鄧沙寧，齊利敏

（1.湖南有色冶金勞動(dòng)保護(hù)研究院，湖南長沙 410014；2.湖南有色金屬研究院，湖南長沙 410100）

鉛高耐受性細(xì)菌的篩選及其吸附去除水中鉛的初步研究

鄧沙寧1，齊利敏2

（1.湖南有色冶金勞動(dòng)保護(hù)研究院，湖南長沙 410014；2.湖南有色金屬研究院，湖南長沙 410100）

鉛污染會對人體和環(huán)境帶來巨大危害，我國將其列為優(yōu)先控制的第一類污染物。研究人員從鉛鋅冶煉廠冶煉廢渣堆放場地周邊土壤中分離篩選得到一株細(xì)菌Pb－S1，經(jīng)鑒定為鞘氨醇桿菌，該菌具有良好的鉛耐受性，并具有高效穩(wěn)定的Pb2＋去除和吸附性能，在含鉛廢水的處理中具有良好的應(yīng)用前景。

鉛耐受性；生物吸附；細(xì)菌

鉛是一種對人體健康和農(nóng)作物生長危害極大的重金屬元素，會損害人體的神經(jīng)、消化、免疫和生殖系統(tǒng)，引起痙攣、反應(yīng)遲鈍、貧血、腹痛、消化不良等癥狀，特別會影響兒童的智力發(fā)育［1，2］。鉛污染主要來源于鉛礦開采和冶煉、電鍍、涂料、鉛蓄電池制造等行業(yè)，它給人體和環(huán)境帶來的巨大危害已經(jīng)引起了人們的高度重視。《污水綜合排放標(biāo)準(zhǔn)》（GB8978－1996）中將鉛列為第一類污染物，是我國優(yōu)先控制的污染物。

目前含鉛廢水的處理方法主要有化學(xué)沉淀、氧化還原、離子交換和電化學(xué)法等，一般僅適于濃度較高重金屬離子廢水的處理，對濃度較低的廢水處理效果較差或成本較高［2］。然而，隨著近年來一批新的行業(yè)污染排放標(biāo)準(zhǔn)的頒布和實(shí)施，尤其是涉重行業(yè)，如《鉛、鋅工業(yè)污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》（GB 25466－2010）、《銅、鎳、鈷工業(yè)污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》（GB 25467－2010）等，將鉛的排放限值大幅度地降低至0.5 mg／L，使得傳統(tǒng)的含鉛廢水處理方法無法滿足新標(biāo)準(zhǔn)的要求。因此，開發(fā)能夠?qū)Φ蜐舛群U廢水進(jìn)行深度處理的新型技術(shù)成為研究人員的目標(biāo)。

近年來，迅速興起的生物處理技術(shù)，具有操作簡單、投資少、對環(huán)境破壞小、二次污染少且專一性較高等優(yōu)點(diǎn)，尤其對低濃度含鉛廢水進(jìn)行深度處理時(shí)具有一定的經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢，成為綠色環(huán)保領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一［3～6］。隨著環(huán)境微生物學(xué)的發(fā)展，研究人員發(fā)現(xiàn)一些微生物如細(xì)菌、真菌和酵母能夠去除吸附廢水溶液中的鉛離子［7～10］。在長期受重金屬污染的土壤上，存在能耐受重金屬污染，并可富集、氧化或還原重金屬的微生物種群。由于微生物種類繁多，因此用重金屬選擇培養(yǎng)基，從中篩選出對土壤重金屬具有專性高效富集作用的菌株，并進(jìn)行分類鑒定，是生物處理技術(shù)應(yīng)用的前提。本研究從分離和篩選高耐受鉛微生物的研究角度出發(fā)，擬從被鉛嚴(yán)重污染的土壤中分離得到對鉛具有高耐受性的微生物，對其去除水中鉛的能力進(jìn)行研究和探討。

1 材料與方法

1.1 試劑、培養(yǎng)基和土壤樣品

采用優(yōu)級純硝酸鉛配制Pb2＋濃度為5 000mg／L的鉛標(biāo)準(zhǔn)溶液待用。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，無菌蒸餾水1 L。

液體馴化培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基中加入Pb2＋1 g。

固體篩選培養(yǎng)基：液體馴化培養(yǎng)基培養(yǎng)幾種加入15～20 g瓊脂粉。

含鉛的土壤樣品取自湖南某鉛鋅冶煉廠冶煉廢渣堆放場地。

1.2 菌株的馴化、分離

取含鉛土壤樣品100 g，接種至1 000 mL的馴化培養(yǎng)基中，在30℃、120 r／min轉(zhuǎn)速下培養(yǎng)24 h后，取100 mL培養(yǎng)液接種至1 000 mL新的馴化培養(yǎng)基中。重復(fù)以上馴化過程3次以后，取適量菌液稀釋一定的倍數(shù)，再分別吸取0.1 m L稀釋液涂布于固體篩選培養(yǎng)基平板上。接種后移入恒溫培養(yǎng)箱中，30℃恒溫培養(yǎng)，直到培養(yǎng)基表面觀察到菌落。根據(jù)菌落形態(tài)不同，挑取單菌落，移種轉(zhuǎn)接到新的固體篩選培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。反復(fù)進(jìn)行上述操作，同時(shí)用顯微鏡檢查，直至獲得純菌株。以上操作均在嚴(yán)格無菌條件下進(jìn)行。

1.3 耐鉛菌的篩選和鑒定

使用721型紫外可見分光光度計(jì)于600 nm波長處測定培養(yǎng)液吸光度，以O(shè)D600表示細(xì)菌的生物量，繪制菌種的生長曲線。

將分離篩選得到的菌株接種至含不同濃度Pb2＋（0～3 000 mg／L）的LB培養(yǎng)基中，測定其生長情況，并根據(jù)生長情況判斷菌種對鉛的耐受性能，篩選出對鉛具有高耐受性的菌株。將篩選得到的具有鉛高耐受性的菌株送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行菌種的鑒定。

1.4 耐鉛菌對鉛的去除性能

將篩選獲得的對鉛耐受性的菌株接種至含不同濃度Pb2＋（0～1 000 mg／L）的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)一定時(shí)間后取適量培養(yǎng)液，5 000 r／min離心5 min，取適量上清液，采用原子分光光度法測定其中Pb2＋濃度。以不接種菌體組作為對照組，每組樣品重復(fù)3次。去除率按照下列公式計(jì)算：

式中：P為鉛的去除率／%；C0（Pb2＋）為原培養(yǎng)液中Pb2＋的濃度／mg·L－1；C（Pb2＋）為鉛耐受菌生長一段時(shí)間后培養(yǎng)液中Pb2＋的濃度／mg·L－1。

1.5 耐鉛菌對鉛的生物吸附性能

將耐鉛菌株接種于pH為中性的LB培養(yǎng)基中，30℃、120 r／min培養(yǎng)24 h之后，在5 000 r／min離心5min，將培養(yǎng)基與菌體分離，菌體用無菌蒸餾水洗滌后轉(zhuǎn)移到培養(yǎng)皿中，80℃恒溫干燥24 h。將干燥后的菌體細(xì)胞研磨、粉碎，作為生物吸附劑備用。

取0.1 g生物吸附劑加入250 mL厄氏燒瓶中，于30℃、pH為中性的條件下測定生物吸附劑對鉛的吸附性能。生物吸附劑與鉛離子溶液混合后，立即放置在水浴恒溫振蕩器中，120 r／min振蕩60 min。為避免操作過程中可能發(fā)生的化學(xué)沉降、被容器壁吸附等造成的誤差，試驗(yàn)條件下同時(shí)做空白試驗(yàn)（即不加吸附劑）。吸附試驗(yàn)鉛離子濃度為100 mg／L，每隔10 min取樣進(jìn)行分析。樣品先經(jīng)10 000 r／min離心5 min后，采用原子吸收分光光度法測定上清液中的Pb2＋濃度。

所有試驗(yàn)重復(fù)3遍，通過標(biāo)準(zhǔn)方差檢驗(yàn)試驗(yàn)誤差，最后取平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 耐鉛菌的分離

經(jīng)過富集和分離，從所采土樣中分離出3株耐鉛細(xì)菌，分別編號為Pb－S1、Pb－S2和Pb－S3。菌株P(guān)b－S1菌落顏色為白色圓形，菌落表面光滑不透明，易于挑起，黏稠，菌落直徑為2～4 mm；菌株P(guān)b－S2菌落顏色為淺綠色，菌落直徑小于3～5 mm，中央突起，菌落為圓形，表面光滑，邊緣整齊，易于挑起，黏稠；菌株P(guān)b－S3菌落顏色為淺綠色，菌落直徑小于2～4 mm，中央突起，菌落為圓形，表面粗糙，邊緣整齊，易于挑起，黏稠。革蘭氏染色試驗(yàn)表明Pb－S1、Pb－S2為革蘭氏陰性菌，Pb－S3為革蘭氏陽性菌。對分離得到的這三株鉛耐受菌進(jìn)行下一步的耐鉛性能測試，以獲得對鉛具有高耐受性的菌株。

2.2 高耐鉛菌的篩選和鑒定

在不同初始鉛濃度的LB培養(yǎng)液中分別接入Pb－S1、Pb－S2和Pb－S3菌，每隔12 h測定菌株的生長情況，判斷菌株的耐鉛性能。圖1、圖2、圖3分別為Pb－S1、Pb－S2和Pb－S3菌在Pb2＋濃度為0～3 000 mg／L范圍內(nèi)培養(yǎng)基中生長情況，試驗(yàn)結(jié)果表明Pb2＋濃度在2 000 mg／L以下時(shí)，3株耐菌均能夠生長，當(dāng)Pb2＋濃度達(dá)到3 000 mg／L則無法再生長。隨著Pb2＋濃度的升高，3株菌的生長都逐漸受到抑制；在Pb2＋濃度為500 mg／L時(shí)，Pb－S1的生長基本沒有受到影響，Pb－S2和Pb－S3則有些輕微的下降；Pb2＋濃度達(dá)到1 000 mg／L時(shí)，Pb－S1的生長也開始受到輕微的影響，Pb－S2和Pb－S3則明顯開始被抑制；Pb2＋濃度繼續(xù)上升到達(dá)到2 000mg／L后，Pb－S1的生長也受到了限制的抑制，Pb－S2和Pb－S3雖然還能生長，但生長非常緩慢，活性限制降低?？傮w上來說，研究篩選得到的3株細(xì)菌，都具有較高的耐受鉛的能力，均明顯高于一些文獻(xiàn)報(bào)道的芽孢桿菌［8］、拉微球菌［9］和卡氏菌［10］。此外，在這3株菌種，又以Pb－S1顯示出更高的鉛耐受性，在Pb2＋濃度高達(dá)2 000 mg／L仍能較好地生長，因此對其進(jìn)行了進(jìn)一步的菌株鑒定研究，結(jié)果表明Pb－S1為鞘氨醇桿菌屬的一個(gè)菌種。

圖1 菌株P(guān)b－S1在不同Pb2＋濃度下的生長情況

圖2 菌株P(guān)b－S2在不同Pb2＋濃度下的生長情況

圖3 菌株P(guān)b－S3在不同Pb2＋濃度下的生長情況

2.3 高耐鉛菌對鉛的去除能力

為測定篩選獲得的高耐鉛菌Pb－S1對鉛的去除能力，將其接種至Pb2＋濃度為0～2 000 mg／L的LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)72 h后，測定培養(yǎng)液中殘留的Pb2＋含量，結(jié)果如圖4所示。結(jié)果表明，Pb2＋濃度在400～2 000 mg／L范圍內(nèi)，菌株P(guān)b－S1對Pb2＋均具有良好的去除能力。Pb2＋濃度在400 mg／L時(shí)，基本上可以全部去除培養(yǎng)液中的Pb2＋，去除率達(dá)到了99%以上。隨著Pb2＋濃度的升高，Pb2＋去除率逐漸下降，當(dāng)Pb2＋濃度升高到2 000mg／L，去除率下降到只有51.6%。雖然在較高的Pb2＋濃度時(shí)，由于鉛對菌株P(guān)b－S1的毒害作用，會使其生長收到明顯的抑制，但并不妨礙正常的新陳代謝活動(dòng)。本試驗(yàn)所分離出的Pb－S1不僅具有很好的耐鉛性，而且有很強(qiáng)的去除鉛的能力，在鉛污染水體的生物修復(fù)中具有很好的應(yīng)用前景。

圖4 菌株P(guān)b－S1在不同Pb2＋濃度下對Pb2＋的去除率

2.4 高耐鉛菌對鉛的生物吸附性能

為進(jìn)一步考察菌株P(guān)b－S1對Pb2＋的生物吸附性能，本試驗(yàn)進(jìn)一步利用Pb－S1的菌體制備了生物吸附劑，并測定了其吸附去除水中Pb2＋的能力?？紤]到生物吸附劑大多數(shù)應(yīng)用于重金屬廢水處理的深度凈化過程，因此研究的生物吸附試驗(yàn)所用的溶液Pb2＋濃度為100 mg／L，主要考察的是Pb－S1生物吸附劑深度處理含鉛廢水的性能，結(jié)果如圖5所示。結(jié)果表明，在Pb2＋濃度為100 mg／L，加入0.1 g Pb－S1制備的生物吸附劑后，吸附10 min后，吸附過程基本完成。在隨后的50 min內(nèi)，對Pb2＋的吸附基本沒有發(fā)生變化，整個(gè)過程水中殘留的Pb2＋均穩(wěn)定在0.4 mg／L以下，顯著低于《鉛、鋅工業(yè)污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》（GB 25466－2010）、《銅、鎳、鈷工業(yè)污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》（GB 25467－2010）等國標(biāo)要求的0.5mg／L的排放標(biāo)準(zhǔn)。試驗(yàn)結(jié)果說明Pb－S1生物吸附劑對Pb2＋的吸附迅速而穩(wěn)定，對于生物吸附劑應(yīng)用于重金屬廢水的生物吸附處理非常有利。

圖5 菌株P(guān)b－S1制備的生物吸附劑對Pb2＋的吸附性能

3 結(jié) 論

研究結(jié)果表明，從被Pb嚴(yán)重污染的土壤中可篩選得到對鉛具有高耐受性的菌株；本試驗(yàn)分離得到了一株細(xì)菌Pb－S1可以耐受濃度高達(dá)2 000 mg／L的Pb2＋，并在Pb2＋濃度為400～2 000 mg／L的范圍內(nèi)具有很好的去除Pb2＋的能力，去除率達(dá)到99%以上；利用Pb－S1制備的生物吸附劑，在處理濃度低于100 mg／L的Pb2＋溶液時(shí)具有高效快速的生物吸附性能，處理后溶液中的Pb2＋濃度穩(wěn)定在0.4 mg／L以下，低于《鉛、鋅工業(yè)污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》（GB 25466－2010）、《銅、鎳、鈷工業(yè)污染物排放標(biāo)準(zhǔn)》（GB 25467－2010）等要求的排放標(biāo)準(zhǔn)；細(xì)菌Pb－S1在去除水中Pb2＋的應(yīng)用中顯示出很好的前景。

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Screening of Lead-tolerant Microbes and Prelim inary Study on Their Rem oval Capability of Lead in Liquidoid

DENG Sha-ning1，QILi-min2
（1.Hunan Labor Protection Institute of NonferrousMetals，Changsha 410014，China；2.Hunan Research Institute of NonferrousMetals，Changsha 410100，China）

Lead is the first category pollutant in China because of the great harm to human body and environment.In the study，a bacterial strain Pb-S1 was isolated from the soil that was seriously polluted by the slag from lead smeltery.Pb-S1 was capable of removing and adsorbing Pb2＋in liquidoid.

lead tolerance；biosorption；bacteria

X758

A

1003－5540（2016）05－0052－04

2016－06－28

鄧沙寧（1983－），男，工程師，主要從事安全工程方向的研究工作。