張存勝，王文娟，王振斌，邵淑萍,，馬海樂（江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江0；固體廢物處理與環(huán)境安全教育部重實(shí)驗(yàn)室（清華大學(xué)），北京 00084；青島啤酒股份有限公司，山東 青島6600）

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產(chǎn)氫菌的分離鑒定及發(fā)酵性能

張存勝1,2，王文娟1，王振斌1，邵淑萍1,3，馬海樂1
（1江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇 鎮(zhèn)江212013；2固體廢物處理與環(huán)境安全教育部重實(shí)驗(yàn)室（清華大學(xué)），北京 100084；3青島啤酒股份有限公司，山東 青島266100）

摘要：為了獲得高性能的產(chǎn)氫菌，從堿處理后活性污泥中分離純化得到兩株產(chǎn)氫菌（H-1和H-2），生物學(xué)鑒定表明兩株菌均為Enterobacter種屬，H-1菌為Enterobacter cancerogeous HG6 2A種屬，而H-2與Enterobacter homaechei 83的關(guān)系最親近。發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，將H-1和H-2菌液進(jìn)行1∶1混合時(shí)發(fā)酵性能最佳，對(duì)應(yīng)的發(fā)酵時(shí)間和產(chǎn)氫量分別為33h和861mL/L，混合發(fā)酵克服了H-1菌單獨(dú)發(fā)酵氫產(chǎn)量低和H-2菌發(fā)酵時(shí)間長的缺陷。發(fā)酵液中主要揮發(fā)性脂肪酸（VFA）為乙酸和丁酸，表明兩株菌的發(fā)酵類型均為丁酸型發(fā)酵。由于兩株菌的協(xié)同作用，混合發(fā)酵初期VFA的累積速率降低，提高了發(fā)酵體系的穩(wěn)定性。

關(guān)鍵詞：產(chǎn)氫菌；16S rDNA；制氫；發(fā)酵；協(xié)同作用

第一作者及聯(lián)系人：張存勝（1983—），男，講師，研究方向?yàn)樯镔|(zhì)能源、食品廢棄物資源化利用。E-mail zhangcs@mail.ujs.edu.cn。

生物暗發(fā)酵處理生物質(zhì)廢棄物制氫已逐漸成為生物質(zhì)能源領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一，傳統(tǒng)活性污泥發(fā)酵過程中耗氫菌較多，生物質(zhì)氫轉(zhuǎn)化率較低，非產(chǎn)氫菌產(chǎn)生的有毒物質(zhì)往往抑制產(chǎn)氫菌活性。純菌發(fā)酵避免了非產(chǎn)氫菌對(duì)產(chǎn)氫菌的底物競爭和次級(jí)代謝產(chǎn)物的抑制，能夠提高生物質(zhì)的氫轉(zhuǎn)化率。目前的產(chǎn)氫菌主要有包括梭菌（Clostridium）[1]、腸桿菌（Enterobacter）[2]、芽孢桿菌（Bacillus）[3]、埃希氏菌（Escherichia）[4]等幾大類，但目前的產(chǎn)氫菌發(fā)酵仍存在發(fā)酵時(shí)間長，產(chǎn)氫效率低等問題，高昂的成本仍然限制產(chǎn)氫菌發(fā)酵的工業(yè)化應(yīng)用[5]。為了獲得高性能的產(chǎn)氫菌，本文進(jìn)行了活性污泥產(chǎn)氫菌篩分研究，通過克隆和16S rRNA測序等手段實(shí)現(xiàn)產(chǎn)氫菌種屬鑒定，并對(duì)分離出的產(chǎn)氫菌進(jìn)行了發(fā)酵性能研究。

1　材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種

菌種來源：產(chǎn)氫菌是利用堿法處理活性污泥馴化后得到的。初始厭氧污泥取自江蘇大學(xué)鏡湖，經(jīng)2mm篩過濾去除枝葉等雜質(zhì)，于40L厭氧發(fā)酵罐中馴化3個(gè)月備用。利用6mol/L的NaOH溶液將備用污泥調(diào)節(jié)pH值至12.0±0.1并保持24h[6]。

1.1.2培養(yǎng)基

液體培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖 20；胰蛋白胨 4；牛肉膏 2；酵母汁 1；L-半胱氨酸 0.5；NaCl 3；MgCl20.1；FeSO4·7H2O 0.1；K2HPO41.5；維生素液10mL；微量元素液 10mL。

維生素液（g/L）：抗壞血酸 0.025；檸檬酸 0.02；對(duì)氨基苯甲酸 0.01。

微量元素液（g/L）：MnSO4·7H2O 0.01；ZnSO4·7H2O 0.05；H3PO40.01；CaCl20.01；CoCl2·6H2O 0.2。

固體培養(yǎng)基：液體培養(yǎng)基+瓊脂（1.6 ％～2.0％）。pH值為6.0。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1產(chǎn)氫菌富集培養(yǎng)

取100 g堿處理后的活性污泥于三角瓶中，加入滅菌玻璃珠手動(dòng)旋轉(zhuǎn)至污泥顆粒搗碎。在超凈工作臺(tái)上，取10mL菌懸液接種于盛有150mL產(chǎn)氫培養(yǎng)基的250mL發(fā)酵瓶中，連接產(chǎn)氫密封及氣體收集裝置后，將發(fā)酵瓶置于37℃恒溫水浴鍋中培養(yǎng)，24h后測量所產(chǎn)氣體的成分，若有氫氣生成，說明產(chǎn)氫菌得到富集。

1.2.2產(chǎn)氫菌的分離篩選

初篩：取lmL富集好的種子液用無菌生理鹽水依次制成10?1～10?5稀釋梯度的菌懸液，分別取不同梯度下的菌懸液1mL進(jìn)行培養(yǎng)（雙重疊皿培養(yǎng)法），于生化培養(yǎng)箱中37℃培養(yǎng)12h，挑取產(chǎn)氣泡的單個(gè)菌落于平板劃線培養(yǎng)（平板劃線法），觀察菌體形態(tài)、大小是否一致，重復(fù)上述操作直到得到純化的菌株。

復(fù)篩：將分離到的產(chǎn)氫菌株接種于盛有150mL產(chǎn)氫培養(yǎng)基的發(fā)酵瓶中，上封5mL液體石蠟，以橡膠塞密封，用氮?dú)鈷叱l(fā)酵瓶中的空氣，置于37℃的恒溫水浴鍋中培養(yǎng)。通過排水法收集產(chǎn)生的氣體，采用氣相色譜法檢測其是否含有H2，判斷此菌株是否為產(chǎn)氫菌株。選取產(chǎn)氣能力強(qiáng)的菌株進(jìn)行保藏鑒定。

1.2.3產(chǎn)氫菌種保藏

本實(shí)驗(yàn)主要采用液體石蠟保藏法[7]，該法是將菌種置于液體培養(yǎng)基中，浸入石蠟進(jìn)行厭氧封存，于4℃的冰箱中保藏。

1.2.4暗發(fā)酵實(shí)驗(yàn)

采用間歇實(shí)驗(yàn)測定菌株的產(chǎn)氣曲線：將富集培養(yǎng)12h的產(chǎn)氫菌按10％的接種量接種于盛有200mL液體培養(yǎng)基的發(fā)酵瓶中，上封5mL液體石蠟，以橡膠塞密封，以流速為200mL/min的氮?dú)鈷叱l(fā)酵瓶中的空氣5min，在37℃恒溫水浴條件下培養(yǎng)，記錄每小時(shí)的產(chǎn)氣量并檢測氫氣濃度，繪制產(chǎn)氫曲線。

產(chǎn)氫菌按照H-1與H-2為1∶0、0∶1、3∶1、1∶1和1∶3的比例混合，分別考察單菌和混菌發(fā)酵產(chǎn)氫性能。

1.3分析方法

1.3.1產(chǎn)氫菌的形態(tài)鑒定

通過對(duì)菌株的菌落形態(tài)、個(gè)體形態(tài)和革蘭氏反應(yīng)對(duì)細(xì)菌形態(tài)和性質(zhì)進(jìn)行初步鑒定[7]。

1.3.2DNA的提取與檢測

（1）總DNA提取

將菌種于液體培養(yǎng)基富集培養(yǎng)兩次，直接作為樣品進(jìn)行DNA提取。

（2）16S rDNA的PCR擴(kuò)增

① 擴(kuò)增引物：采用擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA的通用引物，序列如下。

Forward 27 F：5-AGAGTTTGATCCTGGCTCA G-3。

Reverse 1492R：5’-TACGGCTACCTTGTTACG ACTT-3’。

② PCR擴(kuò)增體系如表1所示。

③ 擴(kuò)增條件：預(yù)變性95℃，5min；變性95℃，1min；退火55℃，1min；延伸72℃，90 s；重復(fù)上述3個(gè)步驟35個(gè)循環(huán)，然后延伸72℃，10min；最后10℃冷卻。

表1　PCR擴(kuò)增體系

（3）電泳

擴(kuò)增結(jié)束后，取2.5 μL PCR產(chǎn)物加入1 μL 10*Loading buffer混合均勻，通過1％瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，利用溴酚藍(lán)作指示劑，檢測PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。最后用EB作染色劑涂布染色30min，在BIO-RAD凝膠成像系統(tǒng)中成像。

（4）序列測定

擴(kuò)增產(chǎn)物引物合成及測序委托南京金斯瑞公司完成。

1.3.3氣體檢測和VFA分析

用SP-6890氣相色譜儀進(jìn)行生物氣體成分測定，配置TCD檢測器和TDX-01不銹鋼柱（2m×3mm，配碳分子篩）。進(jìn)樣口溫度、柱溫、檢測器溫度分別為140℃、160℃和160℃，載氣為Ar，柱前壓為0.08mPa。

揮發(fā)性脂肪酸（volatile fatty acid，VFA）由氣相色譜儀（GC-5890，HP）檢測，配有氫火焰檢測器（FID）和毛細(xì)管柱（安捷倫1909/N-133HPINNOWAX，30m×0.250mm），進(jìn)樣口和檢測器溫度分別為240℃和260℃。柱箱采用如下程序升溫：初溫100℃，保持1min；以15 ℃/min的速率升溫至220℃，保持5min。載氣為氮?dú)?，氮?dú)?、氫氣和空氣的流速分別為290mL/min、170mL/min和290mL/min。

2　結(jié)果與討論

2.1產(chǎn)氫菌的形態(tài)特征

經(jīng)過初篩和復(fù)篩，最終選定兩株產(chǎn)氣能力較強(qiáng)的菌株，分別命名為H-1和H-2。對(duì)分離出的兩株菌進(jìn)行生物學(xué)和掃描電鏡觀察，結(jié)果見圖1和表2，由結(jié)果可知，H-1菌為短桿狀革蘭氏陰性菌，H-2菌為長桿狀革蘭氏陽性菌，兩株產(chǎn)氫菌在固體培養(yǎng)基菌落形態(tài)均為乳白色、光滑、半透明，菌落表面微微突起。在厭氧環(huán)境下單胞生長，好氧環(huán)境下集結(jié)生長，屬于兼性厭氧菌。兩株菌在電子顯微鏡下都可觀察到運(yùn)動(dòng)狀態(tài)，在掃描電鏡下均未觀察到兩株菌有芽孢出現(xiàn)。

圖1　菌株H-1和H-2的掃描電鏡圖

表2　細(xì)菌的生物學(xué)特征

2.2基于16S rRNA 的系統(tǒng)發(fā)育分析

將篩選出的兩株菌進(jìn)行16S rRNA基因序列測定分析，所得序列與GenBank數(shù)據(jù)庫中已知16S rDNA序列進(jìn)行比較，通過NCBI的Blast序列比對(duì)進(jìn)行同源性分析。結(jié)果表明新分離的兩株菌的16S rDNA基因與Enterobacter屬各種的同源性大于99％，但兩株菌種之間不具有相關(guān)性。為了進(jìn)一步確定該產(chǎn)氫菌在生命進(jìn)化中的分類學(xué)地位，對(duì)兩株菌進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析，圖2表明它們是Enterobacter屬的成員，H-1種屬為Enterobacter cancerogeous HG6 2A，同源性達(dá)到100％；H-2與Enterobacter homaechei 83的關(guān)系最親近，其相似性達(dá)到99％。查閱大量文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，這兩種菌株產(chǎn)氫特性尚未有報(bào)道。

圖2　基于16S rDNA序列的菌株的系統(tǒng)發(fā)育樹

2.3氫氣產(chǎn)量

圖3顯示了H-1和H-2菌的單獨(dú)與混合發(fā)酵過程氫氣積累量的變化。由圖3可知，第1、2組（即H-1和H-2單獨(dú)發(fā)酵）的起始階段，H-1菌產(chǎn)氫速率較H-2菌快，發(fā)酵至25h時(shí)氫氣產(chǎn)量不再增加，之后維持在119mL的水平不再變化；與H-1菌不同，H-2菌暗發(fā)酵初始階段有顯著的發(fā)酵遲滯期，發(fā)酵至60h后氫產(chǎn)量才有顯著的提高，發(fā)酵至第100h時(shí)氫氣量不再增加，說明發(fā)酵過程結(jié)束，發(fā)酵結(jié)束后的氫氣量為187mL，與H-1菌相比，H-2菌的氫產(chǎn)量高68mL，占H-1菌總產(chǎn)氫量的57.1％，這說明H-2菌產(chǎn)氫能力比H-1菌高。

圖3　H-1和H-2菌的產(chǎn)氫積累曲線

圖3同時(shí)顯示了H-1和H-2菌混合發(fā)酵的氫產(chǎn)量的變化，結(jié)果表明，第3、4、5組（H-1與H-2混合發(fā)酵）的產(chǎn)氫速率和氫產(chǎn)量均高于第1組（H-1菌單獨(dú)發(fā)酵），第3、4、5組的氫產(chǎn)量分別為172mL、167mL和129mL，對(duì)應(yīng)的發(fā)酵時(shí)間為67h、33h和28h。盡管第3組（H-1與H-2比例為3∶1）的氫產(chǎn)量比第4組（H-1與H-2比例為1∶1）時(shí)高5mL，但其發(fā)酵時(shí)間比后者高一倍多。因此，從發(fā)酵時(shí)間和氫產(chǎn)量判斷，H-1菌液與H-2菌液比例為1∶1時(shí)的發(fā)酵性能最佳，在1∶1條件下，混菌發(fā)酵的氫產(chǎn)量比單獨(dú)H-1菌發(fā)酵提高了48mL，發(fā)酵時(shí)間略有延長，比單獨(dú)H-2菌發(fā)酵降低了20mL，但發(fā)酵時(shí)間縮短了67h，這說明H-1和H-2以1∶1混合發(fā)酵時(shí)性能優(yōu)于每株菌單獨(dú)發(fā)酵性能。

表3顯示了不同比例下產(chǎn)氫菌發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在菌比例為1∶1（第4組）時(shí)，氫氣和VFA濃度分別為61.6％和4.0 g/L，均為5組中最高，盡管VFA濃度相對(duì)較高，但第4組最終pH值卻高于其他組，這說明第4組發(fā)酵液的緩沖能力高于其他組，進(jìn)一步說明H-1與H-2以1∶1的比例混合時(shí)，發(fā)酵性能最佳。

表3　兩株產(chǎn)氫菌單獨(dú)與混合發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由表4可知，H-1和H-2菌的氫產(chǎn)量分別為595mL/L和935mL/L，H-2菌產(chǎn)氫能力明顯高于文獻(xiàn)值。為了縮短發(fā)酵時(shí)間，將H-1與H-2菌按1∶1比例混合后，混合菌的產(chǎn)氫能力為861mL/L，比H-1菌單獨(dú)發(fā)酵的產(chǎn)氫能力提高了44.7％，這說明混合菌發(fā)酵克服了單菌發(fā)酵的缺陷，提高了產(chǎn)氫性能。

表4　篩選出的產(chǎn)氫菌產(chǎn)氫能力與文獻(xiàn)值對(duì)比

2.4發(fā)酵液中VFA和乙醇濃度

兩株菌發(fā)酵過程中VFA的變化如圖4所示。除第2組（H-2單獨(dú)發(fā)酵）外，其他組別的VFA在發(fā)酵的初始階段均迅速升高，發(fā)酵至20h后，VFA積累量均在3.0 g/L以上，隨后發(fā)酵液中VFA增加量明顯減少，其中，第4組的VFA在發(fā)酵結(jié)束后VFA濃度達(dá)到4.0 g/L。而第2組的VFA呈現(xiàn)先迅速增加至1.8 g/L后緩慢降低，第60h后又迅速增加，最后維持在3.6 g/L左右，這說明H-2產(chǎn)氫菌對(duì)有機(jī)質(zhì)的降解速率比較慢。

圖4　兩株菌發(fā)酵過程中VFA的變化

圖5　發(fā)酵液中VFA和乙醇含量

發(fā)酵結(jié)束后發(fā)酵液中的VFA主要為乙酸和丁酸，如圖5所示，同時(shí)含有少量的丙酸、乳酸、異戊酸和戊酸，值得注意的是，在每組的發(fā)酵液中均有一定量的乙醇存在，雖然所產(chǎn)氣體主要成分為H2和CO2，但乙醇和乙酸的含量并不符合乙醇型發(fā)酵的要求[10]。因此，該兩株菌的發(fā)酵類型為丁酸型發(fā)酵。

結(jié)合圖3和圖4可知，較快的VFA生成可以促進(jìn)氫氣的快速生成，發(fā)酵時(shí)間相對(duì)較短（第1、3、4、5組），而較慢VFA生成速率會(huì)導(dǎo)致較低的產(chǎn)氫速率（第2組）。H-2產(chǎn)氫菌單獨(dú)發(fā)酵時(shí)，VFA生成速率較低，限制了氫氣的生成，這說明產(chǎn)酸階段是H-2菌產(chǎn)氫過程的限速步驟。而H-1菌單獨(dú)發(fā)酵時(shí)，產(chǎn)氫曲線無較長的停滯期，說明H-1菌的產(chǎn)酸速率高于產(chǎn)氫速率。將兩株菌混合發(fā)酵時(shí)，產(chǎn)氫速率得到了一定程度的提高，可能是由于發(fā)酵初始階段H-1菌產(chǎn)生的過量VFA同時(shí)被H-2菌轉(zhuǎn)化成氫氣的原因；同時(shí)H-2菌對(duì)VFA的利用，減緩了體系VFA的積累速度，維持了系統(tǒng)的穩(wěn)定性。因此，混合菌發(fā)酵性能提高是兩株菌協(xié)同作用的結(jié)果。

3　結(jié)論

通過生物形態(tài)學(xué)觀察和分子生物學(xué)鑒定，從堿處理后活性污泥分離出的兩株產(chǎn)氫菌均為桿狀細(xì)菌，種屬為Enterobacter，其中，H-1種屬為Enterobacter cancerogeous HG6 2A，H-2與Enterobacter homaechei 83的關(guān)系最親近。單獨(dú)產(chǎn)氫發(fā)酵時(shí)，H-1和H-2菌的發(fā)酵時(shí)間和氫產(chǎn)量分別為25 h、100 h和595mL/L、935mL/L，H-1菌產(chǎn)氫速率明顯高于H-2，但H-2菌的氫產(chǎn)量比H-1菌高57.1％。混合發(fā)酵實(shí)驗(yàn)表明，將H-1和H-2菌混合發(fā)酵能夠克服單菌發(fā)酵時(shí)的缺陷，顯著提高了產(chǎn)氫速率和縮短發(fā)酵時(shí)間，兩株菌的協(xié)同作用是混菌發(fā)酵性能提高的原因。

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綜述與專論

Screening，identification of hydrogenogen and the research of its fermentation performance

ZHANG Cunsheng1,2，WANG Wenjuan1，WANG Zhenbin1，SHAO Shuping1,3，MA Haile1，
（1School of Food and Biological Engineering，Jiangsu University，Zhenjiang 212013，Jiangsu，China；2Key Laboratory for Solid Waste Management and Environment Safety（Tsinghua University），Ministry of Eduction of China，Beijing 100084，China；3Tsingtao Brewery Co., Ltd., Qingdao 266100，Shandong，China）

Abstract：In order to obtain high performance hydrogen-producing bacteria，two strains (H-1 and H-2) were screened from activated sludge which was pretreated by alkali. Biological identification showed that the two strains were of Enterobacter species. H-1 was Enterobacter cancerogeous HG6 2A species and H-2 had the closest relationship with Enterobacter homaechei 83. Results showed that the best performance could be achieved from co-fermentation at the ratio of 1∶1 (H-1∶H-2). The corresponding fermentation time and hydrogen yield were 33h and 861mL/L，respectively. The defects of lower hydrogen yield by H-1 and longer fermentation time by H-2 were overcome by co-fermentation. The main volatile fatty acids (VFA) in the broth were acetate and butyrate，indicating that the fermentation of the two strains were both butyrate type. Due to the synergistic effect of the two strains，the accumulation rate of VFA reduced at the initial of fermentation. As a result，the stability of the system was enhanced.

Key words：hydrogenogen; 16S rDNA; hydrogen production; fermentation; synergistic effect

中圖分類號(hào)：X 712；TK 91

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1000–6613（2016）04–1184–06

DOI：10.16085/j.issn.1000-6613.2016.04.035

收稿日期：2015- 09-06; 修改稿日期：2015-11-02。

基金項(xiàng)目：中國博士后科學(xué)基金（2014M561589）、江蘇省自然科學(xué)基金青年基金項(xiàng)目（BK20150487）、中聯(lián)環(huán)SWMES教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室開放基金（SWMES 2015-11）及江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程項(xiàng)目。