鳳 權， 武丁勝， 桓 珊， 楊子龍， 應志祥

(安徽工程大學 安徽省紡織面料重點實驗室， 安徽 蕪湖 241000)

再生纖維素納米纖維膜的制備及其蛋白質分離性能

鳳 權， 武丁勝， 桓 珊， 楊子龍， 應志祥

(安徽工程大學 安徽省紡織面料重點實驗室， 安徽 蕪湖 241000)

為將納米纖維膜應用于蛋白質分離處理，用靜電紡絲和化學改性方法制備聚丙烯腈/再生纖維素(PAN/RC)復合納米纖維膜，通過掃描電鏡、紅外光譜、比表面積及孔徑分析等對制備的復合納米纖維膜進行了表征，并將制備的再生纖維素復合納米纖維膜作為分離層，構建膜分離系統(tǒng)并分離純化血清白蛋白，通過調(diào)節(jié)操作壓力和過濾時間等影響因素，確定其分離純化過程的最佳條件。研究結果表明：在操作壓力為0.10 MPa、過濾時間為1.5 h條件下，再生纖維素復合納米纖維膜對蛋白質的截留率達到80.04%，膜通量達到1.85 L/(m2·min)，與商用聚醚砜超濾膜相比，在截留率差異不大的情況下，膜通量有了數(shù)倍的提升；同時再生纖維素復合納米纖維膜具有優(yōu)異的重復使用能力，并在使用的過程中保持良好的納米纖維形態(tài)結構。

靜電紡絲； 再生纖維素納米纖維； 蛋白質分離； 膜通量

蛋白質作為生物體的重要組成部分一般存在于相對復雜的溶液體系中，而且在生產(chǎn)過程中，蛋白質對外界環(huán)境中的酸堿度、溫度等變化較為敏感，易影響到蛋白質的結構而變性[1]。目前，常用于分離純化蛋白質的方法主要有沉淀法、離子交換法、電泳法、離心法、色譜法等，但是這些方法也存在較多缺陷，例如生產(chǎn)成本較高，工藝過程較為復雜，分離純化效率較低等，不利于其推廣使用[2-4]。近年來，膜分離技術在蛋白質分離純化過程中，由于工藝簡單、處理條件溫和、無需添加試劑等優(yōu)點逐漸引起了人們的關注。在膜分離過程中，通過選擇適當?shù)姆蛛x膜，調(diào)節(jié)操作壓力和過濾時間等因素，即可快速高效地分離純化復雜體系中的蛋白質。膜分離技術主要是利用膜兩側存在的推動力，使混合物中原料的組分可透過選擇膜而對混合物進行分離、提純的一種分離過程[5-6]。當前，靜電紡絲制備的納米纖維膜已經(jīng)成為膜分離方面的研究熱點之一[7-9]。利用靜電紡絲技術制備的納米纖維膜，由于纖維直徑小，比表面積大，孔隙率較高，在分離純化蛋白質的過程中能夠有效地提高分離純化效率，降低能耗，有利于膜分離技術得到更廣泛的應用[10-12]。

本文主要利用靜電紡絲技術制備聚丙烯腈/醋酸纖維素(PAN/CA)復合納米纖維膜，然后通過化學改性制備聚丙烯腈/再生纖維素(PAN/RC)復合納米纖維膜即再生纖維素復合納米纖維膜，將上述纖維膜和聚醚砜(PES)超濾膜作為分離層，分別構建膜分離系統(tǒng)，對同一濃度的血清白蛋白溶液進行膜分離處理。同時，通過靜電紡絲和化學改性得到的再生纖維素復合納米纖維膜孔隙率較高，親水性能較好，在蛋白質分離純化過程中能夠有效提高膜通量和分離膜的抗污染能力。本文系統(tǒng)地分析了再生纖維素復合納米纖維膜對牛血清白蛋白溶液的分離性能，為納米纖維膜應用于蛋白質溶液后處理提供了實驗依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

聚丙烯腈(PAN，質均相對分子質量為90 000)，分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司；二醋酸纖維素(CA，質均相對分子質量為131 900)，分析純，購于阿拉丁化學試劑有限公司；N，N-二甲基甲酰胺(DMF)、NaOH，分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司；考馬斯亮藍(G-250)、血清白蛋白，購于上海金穗生物科技有限公司；

自制高壓靜電紡絲機(包括注射器、高壓電源、滾筒接收裝置等)；F-sorb2400型BET比表面積及孔徑分析儀；MSC300型國產(chǎn)杯式超濾器(杯體為有機玻璃)及PES超濾膜截留分子質量為50 kDa；S-4800型掃描電子顯微鏡；日本島津IR Prestige-21型傅里葉紅外光譜儀；DSA-25型光學接觸角測量儀。

1.2 PAN/RC復合納米纖維膜的制備

準確稱取3.36 g聚丙烯腈粉末和1.44 g醋酸纖維素切片溶解于35.2 g N，N-二甲基甲酰胺溶劑中，于40 ℃下恒溫磁力攪拌至完全溶解，制備質量分數(shù)為12% 的均勻紡絲液 (其中PAN與CA的質量比為7∶3)。將PAN/CA復合紡絲液放于注射器中，并將注射器連接于高壓直流電源，采用滾筒接收PAN/CA復合納米纖維(滾筒與地線相接)。其紡絲參數(shù)主要設置為：滾筒與注射器之間距離20 cm，注射器噴射速度0.5 mL/h，施加電壓18 kV。在上述條件下，連續(xù)紡絲20 h后，將收集到的納米纖維膜放于40 ℃真空干燥箱中干燥2 h，備用。

將上述成功制備的PAN/CA復合納米纖維膜先后放入0.05 mol/L和0.1 mol/L的NaOH溶液中反應一段時間后，取出，用蒸餾水清洗，然后將其放于40 ℃真空干燥箱中烘干，備用。靜電紡絲PAN/CA復合納米纖維膜經(jīng)過2次水解改性，從而制備PAN/RC復合納米纖維膜，即再生纖維素復合納米纖維膜。

1.3 納米纖維膜的性能表征

1.3.1 納米纖維膜形貌觀察

采用日本日立公司的S- 4800型掃描電子顯微鏡對各種待測納米纖維膜進行形貌觀察，測試前對待測纖維膜樣品進行噴金處理。

1.3.2 納米纖維膜紅外光譜測定

按照紅外光譜測試要求，制備各種納米纖維膜測試樣品，利用日本島津公司的IR Prestige-21型傅里葉紅外光譜儀對各種復合納米纖維膜進行紅外光譜分析，測試各纖維中的功能性基團。

1.3.3 納米纖維膜比表面積及孔徑測試

參考GB/T 9587—2004《氣體吸附BET法測定固態(tài)物質的表面孔》按比表面積及孔徑測試要求，制備PAN/RC納米纖維膜測試樣品，采用美國康塔NOVA 2000e型比表面積及孔徑分析儀測試納米纖維膜的比表面積和孔徑。

1.4 膜分離系統(tǒng)的構建

為分析再生纖維素復合納米纖維膜對蛋白質溶液分離純化的能力，將相同厚度的復合納米纖維膜(再生纖維素納米纖維膜測定的孔體積、平均孔徑、BET比表面積分別為0.05 mL/g、32.55 nm、28.57 m2/g)和商業(yè)使用的PES超濾膜作為分離膜，分別構建膜分離系統(tǒng)，其結構示意圖如圖1所示[13]。其中，將錦綸導流網(wǎng)作為支撐層，再將分離膜覆蓋于上層，然后血清白蛋白溶液會在一定的壓力驅動下選擇性透過分離膜，達到分離純化蛋白質的效果。

1.5 膜分離性能的測定

準確稱取一定質量的血清白蛋白樣品溶于蒸餾水中，完全溶解制備1 mg/mL的血清白蛋白溶液。分別將4層的PAN/RC納米纖維膜和PES超濾膜作為過濾層，構建膜分離系統(tǒng)分離純化血清白蛋白溶液。通過調(diào)節(jié)實驗中的壓強和過濾時間等影響因素，測定2種分離膜對血清白蛋白的截留率和溶液透過通量，用于評價2種納米纖維膜分離純化血清白蛋白能力的強弱。其中，蛋白質截留率[14]是指溶液中血清白蛋白被膜截留的量與所占溶液中總量的比率，具體計算如下式所示：

式中：C0表示膜分離前溶液中蛋白質的初始質量濃度，mg/mL；CP表示膜分離后濾過液中蛋白質的質量濃度，mg/mL。

膜通量，即溶液透過通量是指在單位時間、單位面積的分離膜透過的溶液體積，用下式計算：

式中：V表示濾過液的體積，L；S表示分離膜的有效面積，m2；t表示膜分離的操作時間，min。

1.5.1 分離時間的影響

當操作壓力為0.1 MPa時，磁力攪拌器的轉速設置為100 r/min，分別測定不同過濾時間下再生纖維素復合納米纖維膜和PES超濾膜的膜通量和蛋白質截留率，實驗采用1 mg/mL的血清白蛋白溶液作為待過濾液。

1.5.2 壓力的影響

當?shù)鞍踪|過濾時間均為90 min，操作壓力在0.04～0.12 MPa之間變化時，研究操作壓力對膜通量和蛋白質截留率的影響。

1.5.3 納米纖維膜重復使用性能測試

分別用再生纖維素納米纖維膜和商業(yè)PES超濾膜分離1 mg/mL的血清白蛋白溶液，在0.1 MPa的操作壓力下過濾分離90 min，取出納米纖維膜用蒸餾水清洗3～5次，然后在相同條件下將納米纖維膜重復測試5次，計算每次分離過程中的膜通量和蛋白質截留率。

2 結果與討論

2.1 PAN/RC復合納米纖維膜的性能分析

2.1.1 PAN/RC復合納米纖維膜形貌

利用靜電紡絲和水解改性制備PAN/RC復合納米纖維膜，并將其用于分離純化血清白蛋白，將分離純化血清白蛋白前后的復合納米纖維膜通過掃描電鏡觀察纖維表觀形態(tài)，結果如圖2所示。由圖可知，經(jīng)過靜電紡絲和水解改性可成功制備纖維成形良好、直徑均勻的再生纖維素復合納米纖維膜。同時，PAN/RC復合納米纖維膜在分離純化血清白蛋白溶液的過程中，其纖維的外觀形態(tài)依然保持穩(wěn)定，并沒有出現(xiàn)明顯的溶脹損壞現(xiàn)象，但是纖維直徑略微變大，原因是復合納米纖維上覆有少量血清白蛋白，從而使纖維略微變粗。

2.1.2 納米纖維膜的紅外光譜分析

2.2 復合納米纖維膜的分離性能

本文實驗采用靜電紡絲和水解改性制備再生纖維素納米纖維膜分離血清白蛋白溶液，主要以蛋白質截留率和溶液透過通量來表征膜分離性能。在膜分離過程中，操作壓力、處理時間、膜孔徑大小及其分布、溶液流速等因素都極大地影響著膜分離性能[15]。本文主要研究膜分離過程中的操作壓力和分離時間與蛋白質的截留率和溶液透過通量之間的關系，同時，本實驗采用考馬斯亮藍法測定溶液中蛋白質的含量。

2.2.1 膜分離時間對蛋白質分離純化的影響

當操作壓力恒定為0.1 MPa時，納米纖維膜分離血清白蛋白時間與膜透過通量和蛋白質截留率之間的關系如圖4所示。由圖可知，隨過濾時間的延長，PAN/RC納米纖維膜和PES超濾膜的膜通量均呈下降趨勢，原因是纖維膜在分離蛋白質溶液過程中，隨分離時間的增加，溶液流動阻力也在逐漸增大，由于纖維膜表面產(chǎn)生吸附阻力、沉積阻力以及濃差極化現(xiàn)象從而降低了膜通量[16]。同時，再生纖維素納米纖維膜的膜通量是PES超濾膜膜通量的4倍左右， 即在相同的操作壓力下，再生纖維素納米纖維膜分離血清白蛋白的速度更快。分析蛋白質截留率與分離時間的關系發(fā)現(xiàn)，隨分離時間的增加，再生纖維素納米纖維膜對血清白蛋白溶液的截留率逐漸變大，最高達到80.04%，具備較高的截留率。

2.2.2 操作壓力對蛋白質分離純化的影響

將PAN/RC納米纖維膜和PES超濾膜在0.04～0.12 MPa壓強下過濾90 min后，計算2種納米纖維膜的膜通量和截留率的變化情況，如圖5所示。由圖可知，當過濾時間相同，操作壓力不同時，2種纖維膜分離純化血清白蛋白性能各不相同。當操作壓力較小時，由于納米纖維膜本身在分離過程中對溶液流動產(chǎn)生一定的過濾阻力，因此PAN/RC納米纖維膜和PES超濾膜在分離初期的膜通量都較低；隨著壓力的增大，血清白蛋白溶液流動的動力增加，因此2種納米纖維膜的膜通量都增大，但再生纖維素納米纖維膜的膜通量增加速率更快。由圖5還可看出，在相同分離時間、不同的操作壓強條件下，再生纖維素納米纖維膜的膜通量始終高于PES超濾膜。觀察蛋白質截留率變化發(fā)現(xiàn)，在相同分離時間的條件下，隨操作壓強的增加，再生纖維素納米纖維膜和PES超濾膜均保持較高截留率，納米纖維膜截留率雖出現(xiàn)小幅波動但基本保持平穩(wěn)。當分離時間一定，在0.1 MPa操作壓力下，納米纖維膜可高效分離血清白蛋白。當操作壓力繼續(xù)增加時，納米纖維膜有少許損壞，造成蛋白質流失。

在實際的蛋白質分離純化過程中，膜分離系統(tǒng)應保證在較高的截留率基礎上，能大幅提高其處理效率，這樣才能更好地運用到社會生活中，因此選擇在90 min的過濾時間內(nèi)，0.1 MPa操作壓力下，PAN/RC納米纖維膜可高效地分離純化血清白蛋白。

2.2.3 納米纖維膜重復使用性能

在操作壓力為0.1 MPa，過濾時間為90 min的條件下，2種纖維膜重復使用性能測試結果如圖6所示。

由圖6可知，隨著重復使用次數(shù)的增加，2種分離膜的的分離性能基本保持穩(wěn)定。同時再生纖維素納米纖維膜經(jīng)過5次重復分離血清白蛋白實驗后，其蛋白質截留率雖略低于商業(yè)PES超濾膜，但膜通量是商業(yè)PES超濾膜膜通量的4倍左右，而且也具備優(yōu)良的重復使用能力。

3 結 論

本文研究采用靜電紡絲制備PAN/CA復合納米纖維膜，再經(jīng)水解制備PAN/RC復合納米纖維膜即再生纖維素復合納米纖維膜。

再生纖維素納米纖維膜由于引入羥基等功能性基團，不僅能改善纖維膜本身的浸潤性、耐污染性，而且具有良好的生物相容性?；谠偕w維素納米纖維膜構建的膜分離系統(tǒng)，用于分離血清白蛋白溶液，其蛋白質的截留率可達到 80.04%，膜通量能達到 1.85 L/(m2·min)，與PES超濾膜分離純化血清白蛋白相比，在維持較高截留率的基礎上，膜通量得到大幅提高，而且該納米纖維膜可多次重復使用。實驗結果表明，再生纖維素納米纖維膜在蛋白質分離純化預處理上具有顯著的應用價值。

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Preparation and protein separation properties of regenerated cellulose nanofiber membrane

FENG Quan, WU Dingsheng, HUAN Shan, YANG Zilong, YING Zhixiang

(AnhuiProvincialKeyLaboratoryofTextileFabric,AnhuiPolytechnicUniversity,Wuhu,Anhui241000,China)

Polyacrylonitrile/ regenerated cellulose (PAN/RC) composite nanofibers membrane were prepared by electrospinning and chemical modification for the separation and purification of serum albumin. Composite nanofiber membranes were characterized by scanning electron microscopy, infrared spectroscopy, specific surface area and pore size analysis. The membrane separation system was assembled by the PAN/RC composite nanofiber membrane, which was overlaid to form the reaction layer. The optimal condition of the protein separation were analyzed by adjusting the operating pressure, filtration time and the pH value. Results showed that the rejection rate of serum albumin and flux of membrane could reach 80.04% and 1.85 L/(m2·min), respectively, under the following conditions: the operating pressure was 0.10 MPa, and the processing time was 1.5 h. Compared with the polyether sulphone commercial ultrafiltration membranes, the rejection rate decreased slightly, while the transport flux improved by several times. At the same time, the experimental results indicated that the regenerated cellulose nanofiber membrane possessed excellent reusability. Additionally, the regenerated cellulose nanofiber membrane could well retain the nanofiber morphological structure after the separation of serum albumin for several times in aqueous environment.

electrospinning; regenerated cellulose nanofiber; separation of protein; flux

10.13475/j.fzxb.20151203906

2015-12-31

2016-08-14

國家自然科學基金項目(21377004)；安徽省自然科學基金項目(1408085ME87)；安徽省高校自然科學研究項目(KJ2016SD04)；安徽省科技計劃項目(1604b0602024)

鳳權(1975—)，男，副教授，博士。 主要研究方向為功能性納米纖維。E-mail: fengquan@ahpu.edu.cn。

TQ 342

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