梁茜　潘福強　梁羽冰　黎凍

[摘要]目的：探討不同比例富血小板血漿（Platelet-rich plasma，PRP）對人脂肪來源干細胞（adipose-derived stemcells，ADSCs）的增殖及周期蛋白Cyclin D₁表達的影響。方法：分離培養(yǎng)ADSCs細胞，傳代至第3代，流式細胞儀鑒定。全血中分離PRP。采用隨機數(shù)字表法將將細胞分為4組（n=24）：C組不做任何處理，PRP₁₀組、PRP₂₀組和PRP₃₀組在ADSCs中加入PRP使其容積比分別為10%、20%和30%，于37℃、5%C02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。應(yīng)用MTT法檢測各組細胞的增殖率，蛋白免疫印跡法（Western blot）測細胞周期蛋白Cyclin D₁的表達。結(jié)果：與C組比較，PRP₁₀組、PRP₂₀組、PRP₃₀組ADSCs細胞增殖率及Cyclin D₁蛋白的表達明顯增高（P<0.05）；組間比較PRP₃₀組ADSCs細胞增殖率及cyclin D₁蛋白的表達高于PRP₁₀組和PRP₂₀組（P<0.05）。結(jié)論：PRP以濃度依賴性方式促進ADSCs細胞內(nèi)周期蛋白Cyclin D₁的表達，從而促進ADSCs的增殖。

[關(guān)鍵詞]脂肪移植；脂肪來源干細胞；細胞增殖率；富血小板血漿；Cyclin D₁蛋白

[中圖分類號]Q813.1 [文獻標志碼]A [文章編號]1008-6455（2016）03-0036-03

臨床上常因畸形、外傷、術(shù)后及美容等的需要而行軟組織缺損修復術(shù)。目前常用的移植填充材料主要有人工材料和自體組織。由于人工材料移植后可能出現(xiàn)排除反應(yīng)、感染及移位等并發(fā)癥，在臨床使用中受限。人體自身脂肪組織移植可避免上述并發(fā)癥，因其來源豐富，抽取脂肪后供區(qū)無明顯并發(fā)癥，理論上為最理想的填充材料。然而目前自體脂肪移植面臨最大的問題為移植后易被吸收，遠期成活率較低。研究報道脂肪細胞經(jīng)體外培養(yǎng)后能獲得穩(wěn)定生長、增殖能力強，且具備定向分化的干細胞。ADSCs作為可大量增殖的主要干細胞群，成為近年來脂肪移植研究的熱點。富血小板血漿（platelet-rich plasma，PRP）為自體血小板的濃縮體，內(nèi)含高濃度生長因子，包括PDGF、TGF-B、VEGF、b-FGF、IGF-1等。有研究報道富血小板血漿聯(lián)合脂肪來源干細胞移植能顯著提高脂肪移植成功率。但具體的機制尚未完全清楚，本研究擬通過不同體積比例的富血小板血漿對脂肪來源干細胞增殖及周期蛋白CyclinD1表達的影響，探討其可能機制，為臨床提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 取材

脂肪組織來源干細胞及富血小板血漿來自廣西醫(yī)科大學一附院美容整形外科接受脂肪抽脂術(shù)的女性患者1例，年齡28歲，排除糖尿病、冠心病、高血壓及其他傳染病患者。手術(shù)前簽署知情同意書。

1.2 試劑

DMEM細胞培養(yǎng)基及胎牛血清均購于Gibco公司；胰蛋白酶、Ⅰ型膠原酶、MTT購于Sigma公司；流式細胞試劑盒購自南京凱基生物公司；CyclinD1抗體、β-actin抗體購自CST公司。

1.3 細胞的分離培養(yǎng)

注射器負壓抽吸法抽取患者大腿后側(cè)脂肪組織，加入0.1%膠原酶Ⅰ，37℃水浴箱消化30min；加入含血清的種板培養(yǎng)基（90%DME-F12，10%胎牛血清，0.2mol/lL谷氨酰胺，100U/ml青霉素、100U/ml鏈霉素）終止消化，1000rpm離心5min；棄上清，加入0.075mmol/l氯化鉀，靜置10min后離心棄上清，加入10%含胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，移入培養(yǎng)皿。于37℃、5%CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，隨后隔天更換培養(yǎng)液。待細胞進入對數(shù)生長期后，用0.25%的胰酶消化，按1：3的比例進行傳代。

1.4 流式細胞儀鑒定脂肪來源干細胞

將傳代到第3代的ADSCs用0.25%的胰酶消化10min，將消化液收集到離心管中，加入培養(yǎng)液終止消化，1000rpm離心5min；棄上清，用D-Hanks沖洗重懸細胞，再次1000rpm離心5min；棄上清。D-Hanks將細胞重懸使細胞濃度約為1×10⁶/ml，同時設(shè)置陰性對照和同型對照。按照說明書加入CD45-PE，CD90-PE，CD106-PE單克隆抗體，4℃避光孵育30min離心，1000rpm離心5min；棄上清。PBS漂洗3次，加入200μl的PBS重懸細胞，流式細胞儀分析標記細胞。

1.5 富血小板血漿（PRP）提取及血小板計數(shù)

抽取患者約35ml外周血液，充分混勻，取0.5ml行全血PLT計數(shù)，余血液分裝至離心管，每管10ml：無菌條件下離心，4℃，l700rpm離心5min，管內(nèi)液體分為上層清液和紅細胞層，吸取全部上清至另一離心管；4℃，3200rpm離心5min，管內(nèi)液體上層為淡黃色貧血小板血漿，離心管底部黃褐色層為濃縮血小板，棄去約3/4上清液，剩余液體混勻即為PRP，對其行PLT計數(shù)。

1.6 實驗分組

根據(jù)PRP容積比例不同將實驗分為對照組（C組）、PRP₁₀組、PRP₂₀組、PRP₃₀組；C組不做任何處理，PRP₁₀、PRP₂₀組、PRP₃₀組在ADSCs中分別加入PRP使其容積比為10%、20%和30%，于37℃、5%CO₂培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.7 MTT法測細胞活力

將細胞以1×10⁶/ml密度接種于96孔培養(yǎng)板，200μ1/孔，每組36孔，分別加入不同體積的PRP孵育，同時設(shè)空白對照組，分12h、24h、36h、48h、60h、72h六個時段觀測；

到達觀測時段時，每組取6孔，每孔加入MTT液20μl，37℃、5%CO₂培養(yǎng)箱培養(yǎng)4h；棄培養(yǎng)液，各孔加200μl二甲基亞砜，振蕩10min；用酶聯(lián)儀在490nm波長下檢測每孔的吸光值（OD），測定細胞活力，并計算細胞增殖率。細胞增殖率的計算公式為：細胞增殖率（%）=OD_PRP組/OD_對照×100%。

1.8 Westernb lot法檢測Cyclin D₁蛋白的表達

用細胞裂解液提取細胞總蛋白，BCA法進行細胞蛋白含量測定。取50μg蛋白在12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，轉(zhuǎn)至硝酸纖維素濾膜，5%脫脂奶37℃封閉1h，加入Cyclin D₁抗體（1：1000，CST公司，美國）于4℃孵育過夜；加入HRP標記的羊抗兔IgG抗體（1：6000，Santa Cruz公司，美國），常溫孵育30min，曝光成像。以β-actin為內(nèi)參。應(yīng)用Quantity One5.0軟件（Bio-Rad公司，美國）進行分析，以Cyclin D₁條帶灰度值與內(nèi)參β-actin條帶灰度值的比值反映Cyclin D₁蛋白的表達。

1.9 統(tǒng)計分析

采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行分析。計量資料以均數(shù)±標準差（x±s）表示，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 流式細胞實驗

培養(yǎng)至第3代的ADSCs經(jīng)流式細胞儀檢測結(jié)果顯示，CD45和CD106呈陰性表達，CD90呈陽性表達（見圖1）。

2.2 富血小板血漿（PRP）提取實驗

全血血小板濃度約為2.68×10³/μl，二次離心法得到的PRP中血小板的濃度約為40.2×10⁴/μ1。

2.3 MTT實驗及Western blot實驗

與C組比較，PRP₁₀組、PRP₂₀組、PRP₃₀組ADSCs細胞增殖率和Cyclin D₁蛋白的表達明顯增高（P<0.05）；組間比較PRP₃₀組ADSCs細胞增殖率和Cyclin D₁蛋白的表達明顯高于PRP₁₀組和PRP₂₀組（P<0.05）（見表1，表2，圖2，圖3）。

3 討論

自體脂肪移植面臨的最大挑戰(zhàn)是如何提高移植后脂肪細胞的存活率。ADSCs作為脂肪組織中可大量增殖的干細胞群中的主要成分，不僅成為組織工程的理想種子細胞，在自體脂肪移植的整個過程中也發(fā)揮著重大作用。研究報道，ADSCs在缺血或者生長因子刺激的條件下釋放促血管化因子，且可分化為血管內(nèi)皮細胞。因此，目前ADSCs被認為是脂肪細胞和血管細胞的雙重前體細胞。本實驗自人類脂肪組織取材，通過膠原酶消后培養(yǎng)經(jīng)流式細胞儀鑒定為ADSCs細胞，該方法具有產(chǎn)量豐富、獲取過程簡單、對人體創(chuàng)傷小等優(yōu)勢。

MTT法又稱四唑鹽法，經(jīng)線粒體琥珀酸脫氫酶裂解后生成紫藍色結(jié)晶，紫藍色結(jié)晶的生成量與細胞釋放出的酶活性成正比，而酶的活性與細胞的數(shù)量及細胞活力成正比，因而可利用該方法間接反應(yīng)ADSCs細胞的活力及增殖率。本研究結(jié)果提示PRP以濃度依賴性方式促進ADSCs增殖。

細胞周期是指細胞從上一次分裂結(jié)束到下一次分裂完成所經(jīng)歷的過程，是細胞生命活動中一個最重要的過程。而細胞周期的有序性驅(qū)動主要依賴于CDKs（cyclindependent-kinase，細胞周期蛋白依賴性激酶）為核心的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控系統(tǒng)，其中Cyclin D₁蛋白是調(diào)控細胞周期的關(guān)鍵蛋白，對決定細胞是否進而分裂至關(guān)重要。研究報道細胞內(nèi)外的各種生長因子及有絲分裂的信號通過作用于可分裂細胞內(nèi)的Cyclin D₁，使其表達上升從而促使細胞進入分裂期。

本研究結(jié)果表明PRP以濃度依賴性的方式提高ADSCs細胞活力及增值率，同時ADSCs細胞Cyclin D₁蛋白表達增加，提示PRP通過促進ADSCs細胞增殖的機制與促進Cyclin D₁蛋白表達上調(diào)有關(guān)。

總之，PRP以濃度依賴性方式促進ADSCs細胞Cyclin D₁蛋白的表達，提高ADSCs細胞增殖率。

編輯/張惠娟