劉新慶 郭蕊 范曉寧 王雪 龍鴻

摘 要 擬南芥胚后發(fā)育經(jīng)歷了營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)和生殖生長(zhǎng)兩個(gè)主要階段，在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的過(guò)程中，由幼齡期向成熟期的轉(zhuǎn)變稱(chēng)為營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)相轉(zhuǎn)變。有關(guān)這個(gè)轉(zhuǎn)變的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)仍不清楚。本文對(duì)擬南芥晚花突變體fca-1、fve-1的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)相轉(zhuǎn)變過(guò)程進(jìn)行了形態(tài)學(xué)觀(guān)察和基因表達(dá)分析。結(jié)果表明：與野生型相比，fve-1、fca-1植株幼齡期延長(zhǎng)，導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)相轉(zhuǎn)變延遲。自主開(kāi)花基因FVE、FCA參與了植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)相轉(zhuǎn)變的調(diào)控。

關(guān)鍵詞 營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)相轉(zhuǎn)變 ；miR156 ；fve-1 ；fca-1 ；擬南芥

中圖分類(lèi)號(hào) Q754 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.06.010

Vegetative Phase Change in Late-flowering Mutants fve-1 and fca-1

in Arabidopsis thaliana

LIU Xinqing1） GUO Rui1） FAN Xiaoning2） WANGXue1） LONG Hong1）

（1 College of Horticulture and Landscape， Tianjin Agricultural University， Tianjin 300384

2 College of Life Science and Technology， Huazhong Agricultural University，

Wuhan， Hubei 430070）

Abstract Post-embryo development of Arabidopsis thaliana undergoes two main stages， namely， vegetative and reproductive growth phase. The change in vegetative growth from juvenile to adult refers to vegetative phase change. The gene network of regulating vegetative phase change remains unclear. In this paper， morphological observation and gene expression are performed to analyze the vegetative phase change in two late-flowering mutants， namely， fca-1 and fve-1. The results showed that compared with the wild type Ler， both vegetative phase change and blossoming in fca-1 and fve-1 mutants are delayed. And this cause the vegetative phase change delay. Autonomous pathway related gene FVE and FCA of flowering time of Arabidopsis thaliana can regulate the vegetative phase change.

Keywords vegetative phase change ； miR156 ； mutant ； fca-1 ； fve-1 ； Arabidopsis thaliana

高等植物的生命周期主要分為兩個(gè)階段，以根莖葉生長(zhǎng)發(fā)育為標(biāo)志的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段和以開(kāi)花為標(biāo)志的生殖生長(zhǎng)階段[1]。營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期又可分為幼齡期（Juvenile phase）和成熟期（Adult stage），幼齡期不能誘導(dǎo)開(kāi)花，只有進(jìn)入成熟期后植物才能經(jīng)誘導(dǎo)開(kāi)花[2]，植物由幼齡期向成熟期的轉(zhuǎn)變稱(chēng)為營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)相轉(zhuǎn)變（Vegetative phase change， VPC）[3]。植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)相轉(zhuǎn)變伴隨的表型變異大多是漸變的。模式植物擬南芥中，幼齡期葉片近圓形，葉緣全緣，葉柄較長(zhǎng)；成熟期葉片呈卵圓形，葉緣有鋸齒，葉柄較短。然而，成熟期葉片出現(xiàn)幼齡期所沒(méi)有的遠(yuǎn)軸面表皮毛，這一表型可以作為判定VPC的形態(tài)標(biāo)志[4-5]。

植物時(shí)相轉(zhuǎn)變是受特定基因調(diào)控的。研究表明，一種小分子RNA（miRNA）， miR156及其靶基因SQUAMOSA PROMOTER BINDING PROTEIN LIKE（SPL）基因家族參與了植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)相轉(zhuǎn)變和開(kāi)花。miR156促進(jìn)幼齡期生長(zhǎng)而抑制成熟期生長(zhǎng)，即抑制VPC發(fā)生，其表達(dá)水平在幼齡期較高而在成熟期降低，開(kāi)花后進(jìn)一步降低；SPL3基因則促進(jìn)了營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)相轉(zhuǎn)變，并受到miR156的強(qiáng)烈抑制[6]。

開(kāi)花是植物對(duì)環(huán)境因素和內(nèi)源因子的響應(yīng)結(jié)果[7-9]。擬南芥中控制開(kāi)花的途徑包括：光周期途徑、自主開(kāi)花途徑、春化途徑和赤霉素途徑[7，10]。自主開(kāi)花途徑是指植物對(duì)外界環(huán)境都不敏感，依靠體內(nèi)各相關(guān)基因之間的相互協(xié)同和拮抗作用而使植物達(dá)到一定生長(zhǎng)時(shí)期后開(kāi)花。自主開(kāi)花途徑的基因如FLOWERING LOCUS VE（FVE）、FLOWERING LOCUS CA（FCA）、LUMINIDE ENDENS（LD）等是通過(guò)抑制春化途徑關(guān)鍵基因FLOWERING LOCUS C（FLC）的表達(dá)來(lái)促進(jìn)開(kāi)花的[11]。fca-1、fve-1、fpa-1等晚花突變體開(kāi)花晚于相應(yīng)野生型[12]，然而這些基因?qū)I(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)相轉(zhuǎn)變的影響，尤其是miR156的作用仍不清楚。本研究以擬南芥晚花突變體fca-1、fve-1為材料，通過(guò)形態(tài)學(xué)觀(guān)察和基因表達(dá)分析，探討擬南芥營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)相轉(zhuǎn)變過(guò)程中開(kāi)花基因FCA、FVE的作用，為研究開(kāi)花基因與營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)相轉(zhuǎn)變之間的內(nèi)在機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

野生型擬南芥為L(zhǎng)andsberg erecta（Ler）生態(tài)型，突變體為L(zhǎng)er背景下的fve-1、fca-1。Ler種子由作物遺傳改良國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室須健教授課題組惠贈(zèng)，fve-1、fca-1購(gòu)自Arabidopsis Biological Resource Center（ABRC）。

1.2 方法

1.2.1 材料培養(yǎng)

將擬南芥種子置于含濕濾紙的培養(yǎng)皿中，4℃冰箱中春化2～3 d。蛭石與營(yíng)養(yǎng)土按體積比1∶1混合成培養(yǎng)土，121℃高溫高壓濕熱滅菌后浸濕用于播種。播種后用保鮮膜覆蓋約一周以保濕。培養(yǎng)箱采用人工光照，光強(qiáng)為90 μE/cm2·s，光照時(shí)間∶暗培養(yǎng)時(shí)間=16 h∶8 h。光照溫度22℃，黑暗溫度20℃，空氣相對(duì)濕度約60%。

1.2.2 形態(tài)學(xué)鑒定

觀(guān)察擬南芥野生型Ler，突變體fve-1、fca-1植株，記錄開(kāi)花時(shí)間、蓮座葉數(shù)目、產(chǎn)生遠(yuǎn)軸面表皮毛的葉片數(shù)，蓮座葉葉片的長(zhǎng)和寬，計(jì)算長(zhǎng)寬比值并制作柱狀圖。在體視顯微鏡下，觀(guān)察遠(yuǎn)軸面表皮毛的產(chǎn)生時(shí)間，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各個(gè)材料樣本數(shù)均為20株，重復(fù)3次。

1.2.3 RT-PCR

采用Trizol法提取不同天數(shù)（每5 d取1次）Ler、fca-1、fve-1植株的總RNA（單個(gè)樣本均為多株提取）。采用DNase I消化總RNA中的DNA。利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa）進(jìn)行cDNA的合成。引物名稱(chēng)與序列如下：

ActinF，5′-GCAGACCGTATGAGCAAAGA-3′；

ActinR，5′-AGCAAGGATAGAACCACCAA-3′；

miR156a-F，5′-CTCTCCCTCCCTCTCTTTGATTC-3′；

miR156a-R，5′-AGGCCAAAGAGATCAGCACCGG-3′。

以cDNA為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，以Actin為對(duì)照，RT-PCR擴(kuò)增程序如下：95℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，58 ℃復(fù)性30 s，72℃延伸20 s，共38個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，-20℃保存。每個(gè)樣品重復(fù)3次。

使用0.5×TBE溶液配制1%瓊脂糖凝膠，取10 μL PCR產(chǎn)物點(diǎn)樣，電泳檢測(cè)目的條帶，觀(guān)測(cè)反轉(zhuǎn)錄效果并觀(guān)察基因表達(dá)的趨勢(shì)。

2 結(jié)果與分析

2.1 突變體fve-1、fca-1的總蓮座葉數(shù)比野生型明顯增多

fve-1、fca-1突變體和野生型的發(fā)育形態(tài)觀(guān)察結(jié)果顯示，fve-1、fca-1突變體植株的總蓮座葉數(shù)及葉片特征等方面出現(xiàn)與野生型明顯不同的異常表型。生長(zhǎng)35 d時(shí)Ler植株已開(kāi)花結(jié)果，而fve-1、fca-1植株尚未出現(xiàn)花序（圖1A），說(shuō)明fve-1、fca-1突變體比野生型發(fā)育遲滯，開(kāi)花晚。fve-1、fca-1植株的葉片比野生型增大（圖1A），Ler、fve-1、fca-1總蓮座葉數(shù)分別為7、21、17，突變體比野生型明顯增多，其中fve-1的總蓮座葉數(shù)最多（圖1B）。葉片增大、增多的結(jié)果表明，fve-1、fca-1突變體植株發(fā)育遲滯。

2.2 fve-1、fca-1突變體植株葉片特征顯示其營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)相轉(zhuǎn)變延遲

在擬南芥營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)相轉(zhuǎn)變中，葉形是漸變的特征，幼齡期近圓形，成熟期呈卵圓形；而成熟期葉片會(huì)出現(xiàn)幼齡期所沒(méi)有的遠(yuǎn)軸面表皮毛。形態(tài)觀(guān)察顯示，Ler植株的遠(yuǎn)軸面表皮毛在14 d出現(xiàn)，而fve-1、fca-1則分別在19、18 d出現(xiàn)（圖2）。兩個(gè)突變體植株葉片遠(yuǎn)軸面表皮毛的出現(xiàn)較Ler晚，說(shuō)明fve-1、fca-1植株幼齡期延長(zhǎng)，營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)相轉(zhuǎn)變延遲。Ler植株生長(zhǎng)約20 d出現(xiàn)可見(jiàn)花芽，而fve-1在40 d時(shí)才出現(xiàn)花序，fca-1約在38 d出現(xiàn)花序（圖2）。

葉形觀(guān)察表明，野生型Ler的子葉和第1、2片蓮座葉近圓形，葉片長(zhǎng)寬比約為1，后期的葉片稍呈卵圓形，開(kāi)始生長(zhǎng)遠(yuǎn)軸面表皮毛的第4片葉與之前的蓮座葉相比變化明顯，葉片長(zhǎng)寬比大于1.5；fve-1、fca-1突變體第一對(duì)真葉長(zhǎng)寬比均約為1，葉片近似為圓形。隨后葉形由圓形逐漸變成橢圓形，長(zhǎng)寬比逐漸增大。fve-1和fca-1植株葉片長(zhǎng)寬比分別在開(kāi)始生長(zhǎng)遠(yuǎn)軸面表皮毛的第6和第7片葉時(shí)達(dá)到1.5（圖3）。這些結(jié)果說(shuō)明，fve-1、fca-1植株?duì)I養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)相轉(zhuǎn)變延遲。

2.3 fve-1、fca-1營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)期miR156表達(dá)量變化

鑒于miR156參與了擬南芥營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)相轉(zhuǎn)變，本研究檢測(cè)了fve-1、fca-1突變體各發(fā)育時(shí)期其表達(dá)量的變化。RT-PCR結(jié)果表明，Ler野生型在生長(zhǎng)10 d時(shí)，miR156a的表達(dá)量為最高，在15 d時(shí)開(kāi)始降低，20 d時(shí)明顯降低，25 d時(shí)RT-PCR條帶基本看不到；fca-1和fve-1突變體生長(zhǎng)10 d時(shí)，miR156a的表達(dá)量為最高，fca-1在15 d時(shí)也開(kāi)始降低，在20～25 d時(shí)明顯降低，30 d時(shí)RT-PCR條帶基本消失，而fve-1中miR156的表達(dá)量下降更緩慢，在20 d時(shí)開(kāi)始降低，25 d時(shí)明顯降低，35 d時(shí)條帶基本消失。野生型和突變體在發(fā)育早期中miR156a的表達(dá)量均很高，野生型在15 d時(shí)miR156a的表達(dá)量有所下降，在15～20 d時(shí)下降明顯，說(shuō)明發(fā)生營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)相轉(zhuǎn)變；此時(shí)，fve-1突變體中miR156a的表達(dá)量仍較高，fve-1和fca-1的miR156a表達(dá)量均在20～25 d時(shí)下降較明顯，說(shuō)明晚于野生型發(fā)生營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)相轉(zhuǎn)變（圖4）。

3 討論

擬南芥器官形態(tài)的變化貫穿于全部植物發(fā)育的過(guò)程中，這種變化與植物頂端分生組織的發(fā)生和分化相關(guān)，并受特定基因的表達(dá)調(diào)控[13-14]。營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段時(shí)相轉(zhuǎn)變是與生殖能力相關(guān)的[15]，然而控制開(kāi)花的基因是否參與營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)相轉(zhuǎn)變?nèi)圆磺宄?。本研究結(jié)果表明，擬南芥的自主開(kāi)花基因FVE、FCA參與了營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)相轉(zhuǎn)變的調(diào)控。突變體fve-1、fca-1的總蓮座葉數(shù)比野生型明顯增多，發(fā)育進(jìn)程延遲。這與我們前期利用多葉突變體amp1-1為材料的遺傳分析結(jié)論相似，多葉突變體amp1-1發(fā)育進(jìn)程延遲[16]。在長(zhǎng)日照條件下，突變體fve-1、fca-1葉片遠(yuǎn)軸面表皮毛出現(xiàn)的時(shí)間（分別為19和18 d）比野生型Ler（14 d）晚，說(shuō)明Ler從14 d進(jìn)入營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)的成熟期，而fve-1、fca-1則分別是在19、18 d，fve-1、fca-1植株幼齡期明顯增長(zhǎng)，從而導(dǎo)致成熟期也相應(yīng)的推遲。葉形和葉片長(zhǎng)寬比的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也支持以上結(jié)論。Ler、fve-1、fca-1分別在20、40、38 d產(chǎn)生花序，進(jìn)入生殖生長(zhǎng)階段，突變體fve-1、fca-1進(jìn)入生殖生長(zhǎng)時(shí)期也明顯晚于野生型。

植物生長(zhǎng)發(fā)育時(shí)相轉(zhuǎn)變的基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)尚不清楚。研究表明，小RNA及其靶基因參與了調(diào)控植物營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)相轉(zhuǎn)變的過(guò)程[11]。microRNA（miRNA）為內(nèi)源性的非編碼小RNA，它們可與靶mRNA的3'非編碼區(qū)結(jié)合，從而降解靶基因的mRNA或抑制轉(zhuǎn)錄物的蛋白翻譯，進(jìn)而調(diào)控有機(jī)體生長(zhǎng)、分化、發(fā)育[17]。近年來(lái)，已經(jīng)越來(lái)越清楚的是，幼齡期到成熟期時(shí)相轉(zhuǎn)變及生殖生長(zhǎng)時(shí)相轉(zhuǎn)變共享一些主要的調(diào)控因子，特別是，兩個(gè)進(jìn)化上高度保守的小RNA，miR156和miR172，以及它們的靶標(biāo)，是植物生長(zhǎng)時(shí)相轉(zhuǎn)變遺傳調(diào)控機(jī)制的關(guān)鍵組分[6，16，18]。miR156靶定SPL轉(zhuǎn)錄因子家族，調(diào)控幼齡期到成熟期及開(kāi)花的轉(zhuǎn)變。相反，miR172靶定2個(gè)APETALA2（AP2）的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域編碼蛋白的mRNA，與miR156相互拮抗調(diào)控幼齡期到成熟期及開(kāi)花的轉(zhuǎn)變[15，19-20]。miR156在幼齡期高表達(dá)，而在成熟期則下降；組成型超表達(dá)miR156延長(zhǎng)了幼齡期的性狀，而miR156活性喪失則這些性狀消除，說(shuō)明miR156是幼齡期發(fā)育的充分必要條件[15]。本研究表明，無(wú)論是野生型還是突變體，當(dāng)擬南芥處于幼齡期時(shí)，miR156表達(dá)量均很高，伴隨著植物發(fā)育的進(jìn)程，miR156表達(dá)量逐漸下降，從miR156下調(diào)表達(dá)量分析，fve-1和fca-1突變體比Ler野生型進(jìn)入成熟期延遲，這個(gè)結(jié)果與形態(tài)學(xué)觀(guān)察的結(jié)果相一致。進(jìn)入生殖生長(zhǎng)時(shí)期，miR156表達(dá)量進(jìn)一步降低，fve-1和fca-1中miR156表達(dá)量比野生型的下降緩慢。這樣，fve-1和fca-1晚花突變體在延遲開(kāi)花的同時(shí)，它們的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段也被延長(zhǎng)。自主開(kāi)花基因FVE、FCA對(duì)幼齡期和成熟期的植株有促進(jìn)其生長(zhǎng)發(fā)育的作用，可以縮短這兩個(gè)時(shí)期生長(zhǎng)發(fā)育的時(shí)間，從而對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程進(jìn)行調(diào)節(jié)，這些基因突變后營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)時(shí)相轉(zhuǎn)變延遲，植株晚花。

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