徐海麗

【摘 要】結(jié)合高中生物選修教學(xué)實踐，主要探討了透明圈中心出現(xiàn)紅色的的原因、兩種剛果紅染色法的優(yōu)缺點比較以及選擇培養(yǎng)基和鑒別培養(yǎng)基的具體作用。

【關(guān)鍵詞】選修；剛果紅染色法；透明圈；鑒別培養(yǎng)基

“分解纖維素的微生物的分離”是人教版高中生物選修一《生物技術(shù)實踐》中專題2“微生物的培養(yǎng)與應(yīng)用”的一個課題。學(xué)習(xí)本節(jié)內(nèi)容之前，學(xué)生已經(jīng)掌握了有關(guān)微生物的分離和培養(yǎng)的相關(guān)知識，通過對“分解纖維素的微生物的分離”的學(xué)習(xí)和實踐探究，不僅能夠進一步鞏固理論知識，更能激發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣、提高學(xué)生的生物科學(xué)素養(yǎng)。下面筆者對教學(xué)過程中一些困惑進行了初步探討。

一、剛果紅染色法

（1）透明圈中心為什么有紅色的菌落

剛果紅（CR）是一種染料，剛果紅本身是棕紅色粉末。溶于水呈黃紅色；溶于醇呈橙色；極微溶于丙酮；澄清亮紅色溶液。它可以和像纖維素這樣的多糖物質(zhì)形成紅色復(fù)合物，但并不與水解后的纖維二糖和葡萄糖發(fā)生這種反應(yīng)。當含有纖維素的培養(yǎng)基中加入剛果紅時，剛果紅就能夠與纖維素形成紅色復(fù)合物。當纖維素被纖維素分解酶分解后，剛果紅—纖維素的復(fù)合物就無法形成，培養(yǎng)基中會出現(xiàn)以纖維素分解菌為中心的透明圈。

纖維素屬于天然高分子化合物，在自然界中分布最廣，也是最重要的多糖。它們在無機酸存在下能完全水解，并得到D—葡萄糖。如果纖維素不完全水解，還會得到其他的多聚糖，這些多聚糖就會結(jié)合剛果紅形成多元糖—剛果紅紅色復(fù)合物。菌絲吸收多聚糖—剛果紅復(fù)合物，在菌體內(nèi)將此復(fù)合物分解為可以利用的小分子物質(zhì)，但是剛果紅不能被利用就沉淀在細胞里面，因此顯示紅色。或者進入菌絲的剛果紅與微生物體內(nèi)的葡聚糖成分再次結(jié)合，形成多聚糖—剛果紅復(fù)合物，使剛果紅固定在細胞內(nèi)，從而使菌落成紅色。在透明圈中央出現(xiàn)紅色菌落，是剛果紅進入菌體的原因。

（2）兩種剛果紅染色法比較

方法一：先培養(yǎng)微生物，再加入剛果紅進行顏色反應(yīng)。

方法二：在倒平板使就加入剛果紅。

細菌生長過程中如果初始沒有色素，則細菌不會大量合成能夠分解色素的物質(zhì)，在方法一中，后加入的色素來不及被有關(guān)酶分解。而方法二，初始有色素，所以更容易出現(xiàn)顏色消退的現(xiàn)象，某些微生物能夠緩慢的降解色素從而導(dǎo)致透明圈。這一過程需要一段時間的培養(yǎng)。

剛果紅在篩選纖維素分解菌上的應(yīng)用已經(jīng)有超過20年的歷史，具體哪種方法更適合，可以根據(jù)實際進行選擇。

二、實驗過程中的選擇培養(yǎng)基和鑒別培養(yǎng)基

（1）選擇培養(yǎng)基的作用是什么

在本實驗中，兩次使用了不同的培養(yǎng)基。先來看一下選擇培養(yǎng)基配方：酵母膏中富含微生物生長所需要的必須氨基酸以及B族維生素、核苷酸、微量元素等，但是含量少，不足以作為碳源，所以該培養(yǎng)基還是以纖維素粉作為唯一的碳源，只有纖維素分解菌可以很好的生長，所以可以初步篩選出能夠利用纖維素的微生物，且培養(yǎng)基沒有加入瓊脂，液體培養(yǎng)基可以增加纖維素分解菌的濃度， 以確保能夠從樣品中分離所需的微生物。此過程也稱為富集培養(yǎng)。

（2）鑒別培養(yǎng)基中為什么加土豆汁

首先我們要知道：①微生物通過稀釋涂布平板法要在培養(yǎng)基上繁殖成一個菌落才能夠進行鑒定；②不同微生物基因組成不同，所含的酶系統(tǒng)也不一樣，它們對碳源利用是有選擇的而且有一定的順序，一般淀粉最先被利用，待淀粉消耗完了才會利用纖維素。

土豆汁是一種天然的培養(yǎng)基，不僅含有淀粉，還有很多礦物質(zhì)和多種維生素，營養(yǎng)豐富，有利于微生物的繁殖。微生物可以利用淀粉作為碳源，但是會使能夠產(chǎn)生淀粉酶的微生物出現(xiàn)假陽性反應(yīng)，出現(xiàn)比較模糊的透明圈。在鑒別培養(yǎng)之前，由于梯度稀釋和涂布使得菌體的密度下降，在鑒別培養(yǎng)基中加入土豆汁可以讓單個菌體發(fā)展到一定數(shù)量形成菌落。當然其他的一些分解淀粉的微生物也可以繁殖，但是由于土豆汁的含量太少，其他雜菌還沒有形成菌落之前淀粉被消耗完了，不能形成菌落，只剩纖維素作為碳源了，最后只有纖維素分解菌能夠繼續(xù)利用纖維素繁殖成菌落。所以鑒別培養(yǎng)基加土豆汁是為了讓纖維素分解菌更好的繁殖，以便形成菌落。

結(jié)合相關(guān)實驗表明，該CMC-Na鑒別培養(yǎng)基也可以用秸稈纖維素粉培養(yǎng)基和濾紙片鑒別培養(yǎng)基代替，這兩種培養(yǎng)基中纖維素含量高，且制作簡單，同時產(chǎn)生的透明圈也清晰，篩選出的纖維素分解菌應(yīng)用價值更高。