顧文佳 徐瓊 張奕南 張清平 曲勤鳳

摘 要：目的：探索應(yīng)用熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）法檢測(cè)冷凍羊肉卷中羊肉含量。方法：以羊線粒體細(xì)胞色素B基因?yàn)檠蛱禺愋曰颍€粒體12S rRNA為內(nèi)參基因，應(yīng)用ΔCt法對(duì)羊肉含量進(jìn)行相對(duì)定量，并與稱重法進(jìn)行比較，分析基因拷貝數(shù)和羊肉脂肪含量對(duì)定量結(jié)果的影響。結(jié)果：熒光PCR法建立的標(biāo)準(zhǔn)曲線在羊肉含量為1%～100%時(shí)具有良好的線性關(guān)系（R2=0.990 1）。檢測(cè)7 個(gè)市售冷凍羊肉卷樣品，熒光PCR方法檢測(cè)出的羊肉含量與稱重法羊肉含量的相關(guān)系數(shù)為0.945 0（P<0.001），平均絕對(duì)差異為-11.0%，95%可信區(qū)間為（-7.4%，-14.6%）?；蚩截悢?shù)不同和羊肉脂肪含量不同對(duì)內(nèi)參基因擴(kuò)增Ct值影響沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P值分別為0.072和0.206）。結(jié)論：熒光PCR法可用于快速檢測(cè)冷凍羊肉卷中羊肉成分的相對(duì)定量。

關(guān)鍵詞：熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)；定量檢測(cè)；羊肉

Application of Real-Time Fluorescence Polymerase Chain Reaction （PCR） for Quantitative Detection of

Lamb in Frozen Lamb Rolls

GU Wenjia， XU Qiong， ZHANG Yinan， ZHANG Qingping， QU Qinfeng

（Shanghai Institute of Quality Inspection and Technical Research， Shanghai 200233， China）

Abstract： Objective： To establish a real-time PCR method for quantitative detection of lamb in frozen lamb rolls. Methods： The ovine mitochondrial cytochrome b gene （Cyt b） as species-specific primer and the mitochondrial 12S rRNA as endogenous control were selected to conduct relative quantification through ΔCt vs. lamb content （%）. The results obtained were compared with those from the weighing method. Some factors that may affect the quantitative results including the number of gene copies and fat content in lamb were also analyzed. Results： A high correlation coefficient （R2 = 0.990 1） was showed between ΔCt and lamb content in the range of 1%–100%. The correlation between the results of real-time PCR and weighting method for seven marketed samples of frozen lamb rolls was statistically significant （R2 = 0.945， P < 0.001）， and the average absolute difference was ?11.0% （with a 95% confidence interval of ?7.4% to ?14.6%）. The effects of the number of gene copies and fat content in lamb on the quantitative detection were not statistically significant （P = 0.072， and P = 0.206， respectively）. Conclusion： The real-time PCR method can be used as a quick and practical method in quantitative detection of lamb in frozen lamb rolls.

Key words： real-time polymerase chain reaction； quantitative detection； lamb

DOI：10.15922/j.cnki.rlyj.2016.07.006

中圖分類號(hào)：TS251. 7 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2016）07-0026-04

引文格式：

顧文佳， 徐瓊， 張奕南， 等. 應(yīng)用熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測(cè)冷凍羊肉卷中羊肉的含量[J]. 肉類研究， 2016， 30（7）： 26-29. DOI：10.15922/j.cnki.rlyj.2016.07.006. http：//rlyj.cbpt.cnki.net

GU Wenjia， XU Qiong， ZHANG Yinan， et al. Application of real-time fluorescence polymerase chain reaction （pcr） for quantitative detection of lamb in frozen lamb rolls[J]. Meat Research， 2016， 30（7）： 26-29. （in Chinese with English abstract） DOI：10.15922/j.cnki.rlyj.2016.07.006. http：//rlyj.cbpt.cnki.net

羊肉中夾雜其他肉類的“混合羊肉卷”在市場(chǎng)中出售不但存在以次充好的問(wèn)題，還因混雜來(lái)源不明肉類存在重大的安全隱患[1-2]。常見(jiàn)的混雜方式是羊肉中混合鴨肉或豬肉，加入羊尾油，添上羊肋骨間的脂肪，凍成肉柱，作為冷凍羊肉卷出售。雖然一些摻假的羊肉被壓緊切片后，肥瘦相間的部位紅白分明、界限清晰，而真羊肉的肌間脂肪紋路搭配自然合理，相互滲透，以此作為真假羊肉卷鑒別的依據(jù)，尚缺乏客觀、定量的標(biāo)準(zhǔn)。

在肉類摻假鑒別方法中，最常見(jiàn)的方法為核酸分析法，包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）[3-4]、限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性PCR（PCR-fragment length polymorphism，PCR-RFLP）分析[5-6]、測(cè)序法等[7-8]。熒光定量PCR方法靈敏、快捷，被廣泛用于肉類成分鑒別研究中，并已作為標(biāo)準(zhǔn)方法在國(guó)內(nèi)外推廣[9-11]。當(dāng)檢測(cè)目標(biāo)肉制品中含有其他物種時(shí)，熒光PCR法能夠快速直接給出定性結(jié)果[12-15]；但是進(jìn)一步定量檢測(cè)混合肉制品中某種肉含量時(shí)，情況則復(fù)雜得多。盡管熒光PCR方法的定量結(jié)果影響因素很多，但因其方法靈敏、迅速，受到許多國(guó)內(nèi)外學(xué)者青睞，研究探討將其用于摻假肉制品定量檢測(cè)的靈敏性和準(zhǔn)確性[16-17]。

本研究應(yīng)用熒光PCR方法推測(cè)冷凍羊肉卷中羊肉成分的質(zhì)量比，通過(guò)與稱重法比較，驗(yàn)證該方法的準(zhǔn)確性和可行性，并對(duì)基因拷貝數(shù)和羊肉脂肪含量等影響定量結(jié)果的因素進(jìn)行分析，為推廣熒光PCR方法定量檢測(cè)羊肉成分提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實(shí)驗(yàn)用羊肉、鴨肉、豬肉為本實(shí)驗(yàn)室收集樣品，冷凍羊肉卷購(gòu)自批發(fā)市場(chǎng)，樣品經(jīng)解凍后稱質(zhì)量、取樣。

DNA提取試劑盒（11796828001） 羅氏公司；PCR預(yù)混液Premix Ex Taq?（RR390） 大連寶生物工程有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7500fast熒光定量PCR儀 美國(guó)ABI公司；6870冷凍研磨機(jī) 美國(guó)SPEX Sample Prep公司；6131生物分光光度計(jì)、5415R離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司；AL204分析天平（感量0.1 mg） 瑞士Mettle-Toledo公司。

1.3 方法

1.3.1 DNA的提取

稱取50 mg樣品，按照試劑盒說(shuō)明“組織中DNA的提取”進(jìn)行。在50 mg組織中加入200 μL裂解液和20 μL蛋白酶K，55 ℃水浴1 h，加入200 μL結(jié)合液，混勻，70 ℃放置10 min，加入100 μL異丙醇，混勻，移入離心柱中，離心，洗滌2 次，用100 μL稀釋液重懸DNA，4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 引物及探針

引物及探針由上海英俊生物技術(shù)服務(wù)有限公司合成，其序列見(jiàn)表1。

1.3.3 熒光定量PCR擴(kuò)增體系及條件

熒光定量PCR反應(yīng)體系為20 μL，包含DNA模板1 μL，Real Time PCR預(yù)混液10 μL，Rox 0.4 μL，上下游引物（10 mmol/L）各0.4 μL，探針（10 mmol/L）0.6 μL，以超純水補(bǔ)足體積。

熒光定量PCR儀反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火35 s，40 個(gè)循環(huán)。使用ROX染料對(duì)熒光數(shù)值進(jìn)行校正。

1.3.4 內(nèi)校準(zhǔn)系統(tǒng)的建立

選擇線粒體基因12S rRNA作為內(nèi)校準(zhǔn)基因，分別稱取相同質(zhì)量的羊肉、鴨肉和豬肉各6 份，采取1.3.1節(jié)的方法進(jìn)行DNA的提取，使用熒光定量PCR儀測(cè)定內(nèi)參基因。比較所獲得的Ct值之間的差異。

1.3.5 不同羊肉脂肪含量的比較

將羊肌肉組織與羊脂肪分別按照質(zhì)量比3∶1、1∶1、1∶3混合，制成羊肌肉組織含量為25%、50%、75%和100%的4 份樣品。按照1.3.1節(jié)的方法進(jìn)行DNA的提取，使用熒光定量PCR儀測(cè)定羊特異性基因和內(nèi)參基因，比較4 組之間Ct值的差異。

1.3.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立[19]

將新鮮羊肌肉組織和鴨肌肉組織按比例充分混勻，制成羊肉質(zhì)量百分比分別為100%、50%、20%、10%、5%和1%的羊-鴨混合肉標(biāo)準(zhǔn)品，每組4 個(gè)平行，采取1.3.1節(jié)的方法進(jìn)行DNA的提取，使用熒光定量PCR儀分別測(cè)定羊特異性基因（細(xì)胞色素B（cytochrome b，Cytb））和內(nèi)參基因（12S rRNA）。根據(jù)所獲得的Ct值，按照式（1）計(jì)算。

ΔCt=CtCytb-Ct12S rRNA （1）

以ΔCt為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品中羊肉百分比的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.7 市售樣品的稱重法檢測(cè)

冷凍羊肉卷完全解凍后，將所有可剝離的肉塊單獨(dú)標(biāo)記，逐塊稱質(zhì)量，沖洗表面的血水后從組織中間取樣約50 mg，采取1.3.1節(jié)的方法進(jìn)行DNA的提取，使用熒光定量PCR儀測(cè)定羊特異性基因，做出定性判定。羊肉卷中羊肉的質(zhì)量百分比按式（2）計(jì)算。

（2）

1.3.8 市售樣品的熒光PCR法檢測(cè)

隨機(jī)選取冷凍羊肉卷的不同部位，充分粉碎混合，提取DNA并PCR擴(kuò)增后，將其熒光PCR擴(kuò)增所得的ΔCt值帶入1.3.6節(jié)的標(biāo)準(zhǔn)曲線，由此得出市售羊肉卷中羊肉成分質(zhì)量百分比。并與稱重法結(jié)果進(jìn)行對(duì)比，驗(yàn)證定量方法的準(zhǔn)確性。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)校準(zhǔn)系統(tǒng)

本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)了雙重?zé)晒釶CR反應(yīng)，即在同一反應(yīng)管內(nèi)同時(shí)擴(kuò)增目標(biāo)基因和內(nèi)參基因，根據(jù)兩者Ct值之差得出起始DNA中模板濃度的差異，進(jìn)而推斷出不同動(dòng)物的質(zhì)量比。為了校準(zhǔn)不同動(dòng)物之間細(xì)胞大小、線粒體基因拷貝數(shù)不同，分別稱取相同質(zhì)量的羊肉、鴨肉和豬肉各6 份，提取DNA后調(diào)整模板DNA質(zhì)量濃度至

50 ng/μL，得到內(nèi)參基因Ct值為羊肉15.72±0.35、鴨肉15.96±0.48、豬肉16.24±0.49，各組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=2.969，P=0.072）。且將DNA模板10 倍系列稀釋后，以Ct值為縱軸，模板DNA稀釋倍數(shù)為橫軸得到的回歸方程斜率接近。本次實(shí)驗(yàn)相同質(zhì)量羊肉、鴨肉和豬肉之間內(nèi)參基因表達(dá)無(wú)差異，可以用作后續(xù)雙重?zé)晒釶CR的內(nèi)參照。

2.2 羊肉脂肪的影響

將羊肌肉組織與羊腹部脂肪按一定比例混合，制成羊脂肪含量為0%、25%、50%、75%的4 份樣品，提取DNA后調(diào)整模板DNA質(zhì)量濃度至50 ng/μL，測(cè)定羊特異性基因和內(nèi)參基因Ct值，結(jié)果如表2所示。各組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1.774，P=0.206）。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將新鮮羊肌肉組織和鴨肌肉組織按比例充分混勻，制成羊肉質(zhì)量百分比分別為100%、50%、20%、10%、5%和1%的羊-鴨混合肉標(biāo)準(zhǔn)品，使用熒光定量PCR儀分別測(cè)定羊特異性基因（Cytb）和內(nèi)參基因（12S rRNA）。根據(jù)所獲得的Ct值，按照公式計(jì)算ΔCt。以ΔCt為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品中羊肉質(zhì)量百分比的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性方程為y=-4.501 9x+9.458 8，R?=0.990 1。

2.4 市售冷凍羊肉卷的定量檢測(cè)

將購(gòu)入的摻假冷凍羊肉卷按照稱重法和熒光PCR法同時(shí)檢測(cè)羊肉含量，結(jié)果見(jiàn)表3。熒光PCR方法檢測(cè)出的羊肉含量與稱重法羊肉含量的相關(guān)系數(shù)為0.945 0，

P<0.001說(shuō)明兩者相關(guān)性極高。熒光PCR方法檢測(cè)出的羊肉含量與稱重法結(jié)果比較平均，絕對(duì)差異為-11.0%，95%可信區(qū)間為（-7.4%，-14.6%）。

3 討 論

定量檢測(cè)混合肉類中各組分的質(zhì)量比一直是肉類檢測(cè)中的一個(gè)難點(diǎn)[20]。熒光PCR方法靈敏、迅速，有許多研究探討將其用于摻假肉制品定量檢測(cè)的可行性。本研究通過(guò)熒光PCR法檢測(cè)冷凍羊肉卷中羊肉成分質(zhì)量比，得出市售冷凍羊肉卷中羊肉含量為8.5%～35.6%。并與稱重法比較，發(fā)現(xiàn)2 種方法檢測(cè)結(jié)果相關(guān)性較高（r=0.945 0，P<0.001），在實(shí)際工作中可作為一個(gè)快速、簡(jiǎn)便的肉類定量檢測(cè)的方法。

在應(yīng)用中，將定量PCR得到的DNA拷貝數(shù)直接換算成各個(gè)肉組分的質(zhì)量比會(huì)受到一些因素的影響[20-21]。首先，不同動(dòng)物的細(xì)胞大小、染色體倍數(shù)、基因組大小、拷貝數(shù)等不同，會(huì)影響定量結(jié)果[21-22]；其次，未知肉的組成不同也會(huì)影響定量結(jié)果，相同質(zhì)量的不同組織中DNA含量從多到少依次為：腎、心、肝、肌肉、腦、皮[17]；再次，DNA的提取效率、PCR的擴(kuò)增效率不同也會(huì)影響核酸定量的準(zhǔn)確性[23]。建立含有內(nèi)參照系統(tǒng)的熒光定量PCR體系能夠盡可能地消除由DNA提取效率和PCR擴(kuò)增效率引發(fā)的差異，從而得到更接近真實(shí)值的定量結(jié)果[24-25]。本研究使用了含有內(nèi)參照系統(tǒng)的雙重?zé)晒釶CR體系，經(jīng)實(shí)驗(yàn)分析，相同質(zhì)量的羊、豬和鴨肉經(jīng)DNA提取和PCR擴(kuò)增，不同基因拷貝數(shù)和羊肉脂肪含量對(duì)內(nèi)參基因擴(kuò)增Ct值影響沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。因此該方法可得到較廣泛的應(yīng)用，樣本中脂肪含量、混雜的不同肉類成分對(duì)羊肉的定量結(jié)果影響不大。

混合肉類定量結(jié)果在同一實(shí)驗(yàn)室、使用同一樣本制作標(biāo)準(zhǔn)曲線和盲樣時(shí)，定量結(jié)果通常非常準(zhǔn)確[26-28]。當(dāng)遇到實(shí)際樣本或者成分更多的混合肉制品時(shí)，熒光PCR的定量結(jié)果與實(shí)際結(jié)果會(huì)有較大差異[4，29-30]。周彤等[4]通過(guò)含豬源性成分的模擬混合肉樣檢測(cè)，樣品豬源性成分含量的回收率平均值為122.27%。K?ppel等[29]則發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)熒光PCR得出的定量結(jié)果與真值之間的誤差在±30%之內(nèi)。本研究熒光PCR法檢測(cè)得出的羊肉含量結(jié)果比稱重法偏低，平均差異為-11.0%，95%可信區(qū)間為（-7.4%，

-14.6%），與上述學(xué)者研究結(jié)果接近。應(yīng)用該方法進(jìn)行羊肉卷中羊肉成分定量檢測(cè)時(shí)結(jié)果更趨于保守，產(chǎn)生這種差異可能的原因有待進(jìn)一步研究。相對(duì)而言，稱重法在肉制品各個(gè)小組分能夠輕松分離、總數(shù)不多的情況下使用，如冷凍羊肉卷、羊肉串等，也是一個(gè)值得嘗試的有效而準(zhǔn)確的方法。

參考文獻(xiàn)：

[1] 李楠， 王佳慧， 沈青， 等. 北京地區(qū)牛、羊肉片中鴨、雞、豬源性成分調(diào)查[J]. 中國(guó)食品衛(wèi)生雜志， 2014（3）： 227-232. DOI：10.13590/j.cjfh.2014.03.006.

[2] 金萍， 丁洪流， 李培， 等. 2013年蘇州地區(qū)肉及其制品摻假情況調(diào)查[J]. 中國(guó)食品衛(wèi)生雜志， 2014， 26（2）： 168-172. DOI：10.13590/j.cjfh.2014.02.016.

[3] NAKYINSIGE K， MAN Y B C， SAZILI A Q. Halal authenticity issues in meat and meat products[J]. Meat Science， 2012， 91（3）： 207-14. DOI：10.1016/j.meatsci.2012.02.015.

[4] 周彤， 李家鵬， 田寒友， 等. 一種基于實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的肉及肉制品中豬源性成分含量測(cè)定[J]. 肉類研究， 2013， 27（12）： 11-15.

[5] CHEN Shiyi， YAO Yonggang， LIU Yiping. Species identification of ten common farm animals based on mitochondrial 12S rRNA gene polymorphisms[J]. Animal Biotechnology， 2012， 23（3）： 213-220.

DOI：10.1080/10495398.2012.696568.

[6] 汪琦， 張昕， 趙大賀， 等. 利用12S rRNA基因的限制性酶切末端片段長(zhǎng)度多態(tài)性鑒定動(dòng)物種類[J]. 食品科學(xué)， 2010， 31（2）： 214-219.

[7] GIRISH P S， ANJANEYULU A S R， VISWAS K N， et al. Sequence analysis of mitochondrial 12S rRNA gene can identify meat species[J]. Meat Science， 2004， 66（3）： 551-556. DOI：10.1016/S0309-1740（03）00158-X.

[8] MANE B G， MENDIRATTA S K， NARAYAN A K T R. Sequence analysis of mitochondrial 16S rRNA gene to identify meat species[J]. Journal of Applied Animal Research， 2013， 41（1）： 77-81. DOI：10.1080/09712119.2012.738213.

[9] 中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局. GB/T25165—2010 明膠中牛、羊、豬源性成分的定性檢測(cè)方法實(shí)時(shí)熒光PCR法[S]. 北京： 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社， 2010.

[10] 中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢驗(yàn)總局. GB/T 21107—2007 動(dòng)物源性飼料中馬、驢源性成分定性檢測(cè)方法PCR方法[S]. 北京： 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社， 2007.

[11] 中國(guó)臺(tái)灣衛(wèi)生署. 公告署授食字第0961800444號(hào)公告 食品中動(dòng)物性成分檢驗(yàn)方法： 牛肉制品中含豬肉成分之定量檢驗(yàn)[S]. 臺(tái)灣， 1996.

[12] 王建昌， 王金鳳， 陳瑞春， 等. 鴨肉冒充牛羊肉的分子生物學(xué)檢測(cè)[J]. 肉類研究， 2012， 26（6）： 20-23.

[13] MURUGAIAH C， NOOR Z M， MASTAKIM M， et al. Meat species identification and Halal authentication analysis using mitochondrial DNA[J]. Meat Science， 2009， 83（1）： 57-61. DOI：10.1016/j.meatsci.2009.03.015.

[14] 趙新， 王永， 蘭青闊， 等. 熒光定量PCR方法鑒別肉制品中羊源性成分[J]. 食品工業(yè)科技， 2015， 36（1）： 299-302. DOI：10.13386/j.issn1002-0306.2015.01.054.

[15] DAI Z， QIAO J， YANG S， et al. Species authentication of common meat based on PCR analysis of the mitochondrial CO I gene[J]. Applied Biochemistry and Biotechnology， 2015， 176（6）： 1770-1780. DOI：10.1007/s12010-015-1715-y.

[16] NIKOLA D， SHYANG-CHWEN S， HSIEH Y P. Quantitative detection of poultry in cooked meat products[J]. Journal of Food Science， 2005， 70（9）： C586-C593. DOI：10.1111/j.1365-2621.2005.tb08309.x.

[17] LAUBE I， ZAGON J， BROLL H. Quantitative determination of commercially relevant species in foods by real-time PCR[J].International Journal of Food Science and Technology， 2007， 42： 336-341. DOI： 10.1111/j.1365-2621.2006.01249.x.

[18] 張清平， 顧文佳， 曲勤鳳， 等. 素食中動(dòng)物源性成分的PCR檢測(cè)方法的研究[J]. 食品工業(yè)， 2011（10）： 112-115.

[19] XU Qiong， GU Wenjia， ZHANG Yinan. Quantitative detection of raw sheep in meat products by a Taq man real-time PCR assay[C]//International Conference on Chemical， Material and Food Engineering. Kunming： Chongqing University， 2015： 39-42. DOI：10.2991/cmfe-15.2015.10.

[20] BALLIN N Z， VOGENSEN F K， KARLSSON A H. Species determination： can we detect and quantify meat adulteration[J]. Meat Science， 2009， 83： 165-174. DOI：10.1016/j.meatsci.2009.06.003.

[21] KOPPEL R， RUF J， ZIMMERLI F， et al. Multiplex real-time PCR for the detection and quantification of DNA from beef， pork， chicken and turkey[J]. European Food Research and Technology， 2008， 227（4）： 1199-1203. DOI：10.1007/s00217-008-0837-7.

[22] MOHAMAD N A， SHEIKHA A F E， MUSTAFA S， et al. Comparison of gene nature used in real-time PCR for porcine identification and quantification： a review[J]. Food Research International， 2012， 50（1）： 330-338. DOI：10.1016/j.foodres.2012.10.047.

[23] DRUML B， MAYER W， CICHNA-MARKL M， et al. Development and validation of a TaqMan real-time PCR assay for the identification and quantification of roe deer （Capreolus capreolus） in food to detect food adulteration[J]. Food Chemistry， 2015， 178： 319-326. DOI：10.1016/j.foodchem.2015.01.003.

[24] MIGUEL A R， TERESA G， ISABEL G， et al. TaqMan real-time PCR for the detection and quantitation of pork in meat mixtures[J]. Meat Science， 2005， 70： 113-120. DOI：10.1016/j.meatsci.2004.12.005.

[25] LAUBE I， SPIEGELBERG A， BUTSCHKE A， et al. Methods for the detection of beef and pork in foods using real-time polymerase chain reaction[J]. International Journal of Food Science and Technology， 2003， 38： 111-118. DOI：10.1046/j.1365-2621.2003.00651.x.

[26] 薛晨玉， 宋麗萍， 路勇， 等. 實(shí)時(shí)定量PCR法對(duì)羊肉中雞源性成分的量化檢測(cè)[J]. 食品工業(yè)科技， 2014， 35（17）： 294-297. DOI：10.13386/j.issn1002-0306.2014.17.0056.

[27] 胡智愷， 宋麗萍， 姜潔， 等. 實(shí)時(shí)定量PCR法對(duì)牛肉中雞源性成份的量化檢測(cè)[J]. 食品安全質(zhì)量檢測(cè)學(xué)報(bào)， 2015（2）： 550-554.

[28] SOARES S， AMARAL J S， MAFRA I， et al. Quantitative detection of poultry meat adulteration with pork by a duplex PCR assay[J]. Meat Science， 2010， 85（3）： 531-536. DOI：10.1016/j.meatsci.2010.03.001.

[29] K?PPEL R， RUF J， ZIMMERLI F， et al. Multiplex real-time PCR for the detection and quantification of DNA from beef， pork， horse and sheep[J]. European Food Research and Technology， 2011， 232（1）： 151-155. DOI：10.1007/s00217-008-0837-7.

[30] EUGSTER A， RUF J， RENTSCH J， et al. Quantification of beef， pork， chicken and turkey proportions in sausages： use of matrix-adapted standards and comparison of single versus multiplex PCR in an interlaboratory trial[J]. European Food Research and Technology， 2009， 230（1）： 55-61. DOI：10.1007/s00217-009-1138-5.