陳國(guó)權(quán) 潘紅燁 劉雪松 張躍飛 邵平 王龍虎

[摘要]中藥材提取過(guò)程是感冒靈顆粒劑生產(chǎn)過(guò)程的首個(gè)環(huán)節(jié)，對(duì)藥品質(zhì)量影響顯著。該文在線采集感冒靈中藥材提取過(guò)程近紅外光譜圖，以高效液相色譜和差重法為參照方法，采用一階導(dǎo)數(shù)法處理近紅外光譜，運(yùn)用偏最小二乘回歸法（PLSR）分別建立提取液中蒙花苷、綠原酸和固含量的定量校正模型。采用相關(guān)系數(shù)（r）、交叉驗(yàn)證均方差（RMSECV）、校正集均方差（RMSEC）和驗(yàn)證集均方差（RMSEP）等指標(biāo)優(yōu)化建模參數(shù)，考察模型性能。3種質(zhì)量控制指標(biāo)的模型相關(guān)系數(shù)均達(dá)到095以上，蒙花苷和綠原酸、固含量的RMSEC和RMSEP分別為0010 4和0009 47，0009 34和0142，0055 5和0008 42，在線分析所建模型，預(yù)測(cè)值與實(shí)際測(cè)定值相關(guān)系數(shù)均大于097，其預(yù)測(cè)相對(duì)偏差（RSEP）分別為814%，817%，986%。研究結(jié)果表明，利用近紅外光譜技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)感冒靈中藥提取過(guò)程多指標(biāo)的在線檢測(cè)和實(shí)時(shí)監(jiān)控，該技術(shù)可用于生產(chǎn)過(guò)程中質(zhì)量控制，縮小中間體批次差異性，保證藥品質(zhì)量穩(wěn)定性，也為后續(xù)的產(chǎn)品質(zhì)量回溯提供了實(shí)時(shí)生產(chǎn)數(shù)據(jù)。

[關(guān)鍵詞]近紅外光譜；提取過(guò)程；在線監(jiān)測(cè)；感冒靈

[Abstract] Extraction of the four Chinese herbals is the beginning step of the production process of coldrine granules and influences on drug quality significantly In this paper， the online near infrared spectrum was collected during the extraction process of coldrine and then preprocessed by the first derivative Partial least square regression （PLSR） model was developed for the quantity indicators of linarin， chlorogenic acid and solid content， according to results of both HPLC and weightloss as reference methods The correlation coefficient， root mean square error of crossvalidation （RMSECV）， root mean square error of calibration （RMSEC） and root mean square error of prediction （RMSEP） were used to optimize model parameters and confirm their performance Correlation coefficients of three quality control indicator models reached more than 095Values of RMSEC of linarin， chloroenic acid and solid content were 0010 4， 0009 34 and 0055 5， respectively And the values of RMSEP were 0009 47， 0142 and 0008 42， respectively The models， built online analyze data， revealed that the correlation coefficients of predicted values and measured values were greater than 097 and values of RSEP of linarin， chloroenic acid and solid content were 814%， 817% and 986%， respectively The results showed that the NIR method could achieve the online detection and realtime monitoring of multiindexes during the extraction process of coldrine The technology could be used for drug quality control in the process of practical production， reducing the batch differences and ensuring pharmaceutical quality stability In addition， it could provide realtime production data for subsequent product quality backtracking

[Key words]nearinfrared spectroscopy； extraction process； online monitoring； coldrine granules

doi：10.4268/cjcmm20160804

近紅外光譜技術(shù)（nearinfrared spectroscopy）因其無(wú)污染、樣品無(wú)需前處理和快速檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)[13]，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于中藥原藥材質(zhì)量快速評(píng)價(jià)[45]、生產(chǎn)過(guò)程在線質(zhì)量控制及成品的有效成分含量快速測(cè)定等方面[6]。感冒靈顆粒[7]是由三叉苦、野菊花、崗梅、金盞銀盤(pán)等4味中藥與對(duì)乙酰氨基酚、馬來(lái)酸氯苯那敏、咖啡因等化藥組成的，中西結(jié)合治療感冒的藥品。在感冒靈顆粒生產(chǎn)過(guò)程，中藥材的提取[8]是其首個(gè)環(huán)節(jié)，而且提取工藝會(huì)直接影響藥品的質(zhì)量與療效。在感冒靈大品種技術(shù)升級(jí)項(xiàng)目實(shí)施過(guò)程中，為了提高中藥生產(chǎn)工藝并建立有效的過(guò)程控制方法，本文研究了感冒靈中藥提取過(guò)程實(shí)時(shí)監(jiān)控技術(shù)，即采用近紅外光譜技術(shù)建立感冒靈提取液中固含量、蒙花苷和綠原酸含量的在線檢測(cè)模型，實(shí)現(xiàn)了中藥提取裝置內(nèi)溶液3個(gè)指標(biāo)成分含量變化的實(shí)時(shí)監(jiān)控。感冒靈提取過(guò)程近紅外光譜在線檢測(cè)技術(shù)的應(yīng)用，不僅有利于對(duì)感冒靈提取過(guò)程的質(zhì)量控制，也為藥品質(zhì)量回溯提供了大量的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1材料

1 000 L多功能中藥提取設(shè)備（浙江溫兄機(jī)械閥門(mén)有限公司）；Bruker MATRIXF近紅外光譜儀（德國(guó)布魯克），配有透射檢測(cè)器和采樣系統(tǒng)；Waters alliance E2695高效液相色譜儀（Waters，USA）；H1650W高速離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；SG5200 HPT超聲波清洗機(jī)（上海冠特超聲儀器有限公司）。

野菊花、三叉苦、金盞銀盤(pán)和崗梅藥材均由華潤(rùn)三九醫(yī)藥股份有限公司提供，并由浙江大學(xué)藥學(xué)院徐娟華副教授鑒定，分別為菊科植物野菊的干燥頭狀花序、蕓香科植物三叉苦的干燥莖和枝、菊科植物金盞銀盤(pán)的干燥全草、冬青科植物梅葉冬青的干燥根及莖。

乙腈（色譜純，默克公司）；甲酸（分析純，阿拉丁公司）。蒙花苷對(duì)照品（成都曼斯特生物科技有限公司，MUST15101207）、綠原酸對(duì)照品（成都曼斯特生物科技有限公司，MUST15041814），純度995%。

2方法

21提取工藝與近紅外光譜采集

生產(chǎn)過(guò)程在線監(jiān)測(cè)系統(tǒng)見(jiàn)圖1。每次取100 kg中藥材（三叉苦273 kg、野菊花137 kg、金盞銀盤(pán)182 kg、崗梅409 kg）于提取罐中，加水煎煮提取2次，每次2 h。整個(gè)提取過(guò)程實(shí)現(xiàn)升溫、保溫、煎煮、出藥和除渣的全自動(dòng)控制。

為提高測(cè)量精度和準(zhǔn)確性，本研究建立了新的近紅外在線檢測(cè)系統(tǒng)，并采用靜態(tài)光譜采集方法。采集光譜前，關(guān)閉閥門(mén)1～3；光譜采集完成后，打開(kāi)閥門(mén)3，開(kāi)始取樣；取樣結(jié)束后，關(guān)閉閥門(mén)3，同時(shí)開(kāi)啟閥門(mén)1和2，使新鮮藥液持續(xù)經(jīng)過(guò)流通池。采集參數(shù)如下：光譜采集時(shí)間間隔10 min，以空氣為參比，掃描次數(shù)32次，分辨率8 cm-1，掃描范圍4 000～12 000 cm-1。光譜數(shù)據(jù)的采集、傳輸和處理通過(guò)OPUS軟件完成。

22固含量測(cè)定

感冒靈提取過(guò)程的固含量測(cè)定采用差重法，取烘干至恒重（連續(xù)2次稱(chēng)重差異小于5 mg）的扁形瓶（X0），取約5 mL提取液，精密稱(chēng)定（X1），置干燥箱中105 ℃烘5 h，取出置干燥器中冷卻30 min，稱(chēng)重，再置干燥箱中烘1 h，精密稱(chēng)重（X2），質(zhì)量差異5 mg以上者繼續(xù)置干燥箱中烘，直至差異小于5 mg。根據(jù)減失質(zhì)量，計(jì)算供試品中固含量（%）。

固含量=（X2-X0）/（X1-X0）×100%

23綠原酸與蒙花苷含量測(cè)定

231 色譜條件色譜柱Waters X Bridge Shield RP18（46 mm×250 mm，5 μm），進(jìn)樣量10 μL，柱溫30 ℃，流速10 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng)334 nm，流動(dòng)相05%甲酸（A）乙腈（B），洗脫梯度（0～7 min，13%B；7～27 min，13%～30%B；27～35 min，35%～40%B；后運(yùn)行15 min）。

232 供試品制備取適量提取液樣品溶液于15 mL離心管中，在轉(zhuǎn)速13 000 r·min-1條件下離心10 min，取上清液，即得。

233 對(duì)照品制備精密稱(chēng)取2 mg蒙花苷對(duì)照品置于20 mL量瓶中，以甲醇溶解定容，備用。精確稱(chēng)取2 mg綠原酸對(duì)照品于20 mL量瓶中，以甲醇溶解定容，備用。

234線性、精密度和重復(fù)性考察取蒙花苷儲(chǔ)備液，按梯度進(jìn)行稀釋?zhuān)涑?個(gè)不同濃度的工作液，進(jìn)樣分析。以色譜峰面積（Y）對(duì)進(jìn)樣濃度（X）進(jìn)行線性回歸。線性范圍為0～1202 g·L-1，r=0999 5。

取綠原酸儲(chǔ)備液，按梯度進(jìn)行稀釋?zhuān)涑?個(gè)不同濃度的工作液，進(jìn)樣分析。以色譜峰面積（Y）對(duì)進(jìn)樣濃度（X）進(jìn)行線性回歸。線性范圍為0～0324 1 g·L-1，r =0999 9。

取批號(hào)為15121201的提取終點(diǎn)樣品，按232方法處理后，按231液相條件連續(xù)進(jìn)樣6次，綠原酸和蒙花苷的峰面積RSD分別為052%，050%，表明儀器精密度良好。

取相同提取液，按照232方法制備6份樣品溶液，以231色譜條件，測(cè)得6份樣品中綠原酸和蒙花苷的峰面積RSD分別為029%，035%，表明該方法重復(fù)性良好。

235穩(wěn)定性考察取批號(hào)為15121201的提取終點(diǎn)樣品，按照232方法制備樣品溶液，以231色譜條件，分別于0，4，8，12，16，20，24，28，32，36 h進(jìn)樣分析。綠原酸和蒙花苷峰面積的RSD分別為067%，041%，結(jié)果表明樣品溶液在36 h內(nèi)穩(wěn)定。

236 加樣回收率考察取已知含量的批號(hào)為15121201的提取終點(diǎn)樣品，分別設(shè)置樣品含量的80%，100%，120%為低、中、高濃度，每個(gè)濃度3個(gè)樣品，共9個(gè)樣品，精密量取。分別精密加入相應(yīng)的低、中、高濃度的對(duì)照品，每份均按232項(xiàng)下方法處理后，按231液相條件進(jìn)樣，分別計(jì)算綠原酸與蒙花苷的含量。結(jié)果顯示綠原酸的回收率在99%～100%，RSD 039%，蒙花苷回收率在98%～100%，RSD 073%，表明方法準(zhǔn)確可靠，符合定量測(cè)定要求。

24數(shù)據(jù)處理與模型性能評(píng)價(jià)

運(yùn)用Bruker公司的OPUS軟件的偏最小二乘法（PLSR）建立感冒靈提取過(guò)程中提取液的固含量、蒙花苷和綠原酸含量的近紅外定量分析模型。模型建立前對(duì)校正集光譜進(jìn)行異常點(diǎn)判別，以提高模型精度，同時(shí)原始光譜在平滑、微分等適宜的光譜預(yù)處理方法下來(lái)消除儀器背景或漂移對(duì)信號(hào)的影響，選擇合適的波段提取有效信息，減少計(jì)算量，減小模型復(fù)雜程度。本文采用校正集相關(guān)系數(shù)（rc）、交叉驗(yàn)證均方差（RMSECV）、校正集均方差（RMSEC）和驗(yàn)證集均方差（RMSEP）等指標(biāo)優(yōu)化建模參數(shù)，考察模型性能。模型對(duì)未知樣品的預(yù)測(cè)效果采用預(yù)測(cè)均方差（RMSEP）、相對(duì)偏差（RSEP）和驗(yàn)證集相關(guān)系數(shù)（rv）來(lái)考核。一般來(lái)說(shuō)，模型相關(guān)系數(shù)越接近于1，RMSEC和RMSEP越小且越接近，分析效果越好，RSEP越小說(shuō)明模型的預(yù)測(cè)效果越好。

3結(jié)果與討論

31光譜預(yù)處理及波段選擇

PLSR可以處理全譜信息，但因包含過(guò)多冗余信息，會(huì)影響建模效率和增加模型復(fù)雜程度，故建模前光譜區(qū)間篩選至關(guān)重要，以改善模型性能，提高計(jì)算速度[9]。感冒靈中藥材采取水提法，由于水中的羥基有很強(qiáng)的極性，要特別注意其在近紅外譜區(qū)的6 944，5 155 cm-1附近以合頻與倍頻吸收譜帶形成的兩大“水峰”[1011]，在進(jìn)行近紅外吸收光譜分析時(shí)，應(yīng)盡可能減少其干擾。此外，9 750～12 000 cm-1光譜信息較少，沒(méi)有顯著的特征吸收，為減少計(jì)算機(jī)運(yùn)算量，提高建模效率，也不宜建模。在近紅外透射光譜的采集過(guò)程中，外界環(huán)境的變化會(huì)引起光譜基線的偏移，隨機(jī)噪聲和樣品背景干擾也會(huì)影響校正結(jié)果[12]。因此，在對(duì)近紅外光譜進(jìn)行分析之前，一般要對(duì)光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理，以提高模型的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性。

本研究通過(guò)OPUS軟件對(duì)比研究了各種預(yù)處理方法和不同建模波段對(duì)提取液的固含量、綠原酸和蒙花苷含量模型的影響，結(jié)果見(jiàn)表1。通過(guò)比較發(fā)現(xiàn)，固含量模型的最佳波段為5 3923～9 4037 cm-1，綠原酸模型的最佳波段為5 4232～54 534 cm-1， 6 2948～6 5031 cm-1，蒙花苷模型的最佳波段為5 39227～5 45398， 6 0943～6 5031 cm-1，采用一階導(dǎo)數(shù)法對(duì)光譜進(jìn)行預(yù)處理后能有效消除基線偏移，減少峰與峰之間的重疊并使有效信息顯現(xiàn)出來(lái)，r較大，且RMSECV較小。

32定量模型的建立

應(yīng)用OPUS軟件自動(dòng)優(yōu)化功能，經(jīng)過(guò)異常點(diǎn)判斷、光譜預(yù)處理和建模波段的選擇后，最終得到213個(gè)樣品用于建模，隨機(jī)選取183個(gè)樣品作為校正集。用偏最小二乘法建立感冒靈提取過(guò)程固含量、綠原酸和蒙花苷含量的近紅外定量校正模型，分別獲得提取過(guò)程固含量模型、綠原酸模型和蒙花苷模型的校正集實(shí)測(cè)值和NIR預(yù)測(cè)值的相關(guān)性圖，見(jiàn)圖2。蒙花苷、綠原酸和固含量定量模型校正集相關(guān)系數(shù)分別為0956 5，0965 3，0995 2，RMSEC分別為0010 4，0009 34，0055 5，說(shuō)明模型性能良好。

33各質(zhì)量控制指標(biāo)在線分析

將預(yù)先建立的模型導(dǎo)入系統(tǒng)工作站，在線采集近紅外光譜，所得近紅外光譜自動(dòng)導(dǎo)入所建模型中，同步預(yù)測(cè)感冒靈提取過(guò)程中固含量、蒙花苷和綠原酸含量信息，并在工作站中實(shí)時(shí)顯示各質(zhì)量控制指標(biāo)含量的變化趨勢(shì)。為進(jìn)一步驗(yàn)證在線檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性，本文將近紅外檢測(cè)數(shù)據(jù)（預(yù)測(cè)值）與傳統(tǒng)方法檢測(cè)結(jié)果（實(shí)測(cè)值）進(jìn)行比較，見(jiàn)圖3。

數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析表明，提取液的固含量、綠原酸和蒙花苷的RMSEC和RMSEP分別為0055 5和0008 42，0009 34和0142，0010 4和0009 47，其預(yù)測(cè)相對(duì)偏差（RSEP）分別為986%，817%，814%，可滿足生產(chǎn)過(guò)程實(shí)時(shí)分析的精度要求。在提取過(guò)程中濃度變化趨勢(shì)上，在線檢測(cè)結(jié)果和傳統(tǒng)方法是一致。所以，近紅外在線方法基本與提取工藝的結(jié)果是吻合的。

不同的指標(biāo)，預(yù)測(cè)精度有所差異。相對(duì)地，固含量定量模型要優(yōu)于綠原酸和蒙花苷定量模型，其原因在于其含量較大且該指標(biāo)測(cè)定的是提取液中所含固體物質(zhì)，受水峰影響較小。一煎過(guò)程中25～80 min綠原酸含量的預(yù)測(cè)值要低于實(shí)測(cè)值，二煎初期各指標(biāo)預(yù)測(cè)值較實(shí)測(cè)值略高。其原因是由于該批次的提取過(guò)程初期工況尚不穩(wěn)定。此外，提取液靜置時(shí)液體中顆粒物沉降不完全、提取溫度變化等因素也會(huì)影響近紅外光譜的采集。

4結(jié)論

近年來(lái)，關(guān)于近紅外在線分析方法的研究和應(yīng)用日益受到重視，但是真正意義上在生產(chǎn)設(shè)備上實(shí)施該技術(shù)的并不多見(jiàn)。在感冒靈工業(yè)生產(chǎn)的提取裝置上，本文建立了近紅外在線檢測(cè)系統(tǒng)，研究了蒙花苷、綠原酸和固含量等指標(biāo)成分的分析方法，并用傳統(tǒng)分析方法對(duì)這些檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行檢驗(yàn)，客觀地評(píng)價(jià)近紅外在線分析方法的誤差范圍。生產(chǎn)過(guò)程的應(yīng)用實(shí)踐表明，本文所建立的模型預(yù)測(cè)精度高，準(zhǔn)確度高，滿足中藥制劑實(shí)際生產(chǎn)中定量分析的要求。該法與傳統(tǒng)藥典方法相比，在保證準(zhǔn)確度的基礎(chǔ)上，大大提高了分析效率，為實(shí)時(shí)監(jiān)控中藥生產(chǎn)過(guò)程關(guān)鍵質(zhì)量指標(biāo)變化提供了可行方法，同時(shí)為后續(xù)的產(chǎn)品質(zhì)量回溯提供了大量的實(shí)時(shí)生產(chǎn)數(shù)據(jù)。

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[責(zé)任編輯孔晶晶]