鄭肖蘭　胡飛　梁艷瓊　吳偉懷　鄭金龍習(xí)金根　李銳　賀春萍　易克賢

摘 要 橡膠樹(shù)炭疽病是影響橡膠樹(shù)割膠生產(chǎn)的重要病害之一，主要由膠孢炭疽菌和尖孢炭疽菌侵染引起的，在世界各大植膠地區(qū)引起了無(wú)數(shù)橡膠樹(shù)葉片脫落，甚至整株死亡，給當(dāng)?shù)氐南鹉z產(chǎn)業(yè)發(fā)展造成了嚴(yán)重?fù)p失。本實(shí)驗(yàn)主要采用菌落生長(zhǎng)速率法、孢子萌發(fā)測(cè)試法等常規(guī)植物病理學(xué)方法研究萘乙酸對(duì)橡膠樹(shù)膠胞炭疽菌RC169生長(zhǎng)速率、孢子萌發(fā)率和附著胞形成率的影響。結(jié)果表明，低濃度時(shí)萘乙酸對(duì)RC169菌絲生長(zhǎng)、孢子的萌發(fā)和附著胞的形成具有促進(jìn)作用，但隨著用藥濃度的升高，其促進(jìn)作用變?yōu)橐种谱饔?，且抑制作用隨之規(guī)律性增強(qiáng)。

關(guān)鍵詞 萘乙酸 ；橡膠樹(shù)膠胞炭疽菌 ；抑菌率 ；孢子萌發(fā)率 ；附著胞形成率

中圖分類(lèi)號(hào) S682.19；S794.2 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A Doi：10.12008/j.issn.1009-2196.2016.08.010

Abstract The anthracnose is one of the most important diseases that affect the production of rubber tree. The anthracnose is caused by the infection of Colletotrichum gloeosporioides and C. acutatum， which makes rubber leaves fall from trees， and causes serious losses of local rubber industry. This experiment was to explore the effect of NAA on C. gloeosporioides RC169's mycelial growth， spore germination and appressorium formation. The results showed that when NAA has low concentrations， it has promotion effect on the mycelial growth， spore germination and appressorium formation of RC169. With the NAA concentration increasing， the inhibition effect on mycelial growth spore germination and appressorium formation is strengthened.

Keywords NAA ； Colletotrichum gloeosporioides ； mycelial growth rate ； spore germination rate ； appressorium formation rate

橡膠樹(shù)炭疽病是影響橡膠樹(shù)割膠生產(chǎn)的重要病害之一。橡膠樹(shù)炭疽病主要由膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）和尖孢炭疽菌（C. acutatum）侵染引起，可導(dǎo)致世界各大植膠地區(qū)無(wú)數(shù)橡膠樹(shù)葉片脫落，甚至整株死亡，給當(dāng)?shù)氐南鹉z產(chǎn)業(yè)發(fā)展造成了嚴(yán)重?fù)p失[1]。橡膠樹(shù)炭疽病一直以來(lái)是制約橡膠產(chǎn)量的重要因素之一，其病原菌主要侵染橡膠樹(shù)葉片的幼嫩部位，導(dǎo)致橡膠樹(shù)葉片組織壞死或大量脫落，嚴(yán)重時(shí)造成大量落葉和嫩梢回枯，樹(shù)體衰弱，縮短割膠期限，推遲開(kāi)割時(shí)間，導(dǎo)致橡膠總產(chǎn)下降。自1906年斯里蘭卡Peteh首次報(bào)道以來(lái)，已有十幾個(gè)植膠國(guó)家先后報(bào)道有此病發(fā)生。中國(guó)1962年在海南國(guó)營(yíng)大豐農(nóng)場(chǎng)苗圃首次發(fā)現(xiàn)，隨著種植感病品系的增加，各植膠區(qū)陸續(xù)有其發(fā)生危害情況報(bào)道[2-3]。

萘乙酸（Naphthalene acetic acid，NAA）是一種用途較廣的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，可以提高種子中過(guò)氧化物酶和過(guò)氧化氫酶的完整性，對(duì)植物有促進(jìn)發(fā)芽、生根、加速生長(zhǎng)、提早成熟、增加產(chǎn)量等作用[4-5]。若能明確萘乙酸對(duì)橡膠樹(shù)膠胞炭疽菌生長(zhǎng)速率、孢子萌發(fā)和附著胞形成的影響，就可以深入研究其作用和影響的機(jī)理，從而對(duì)植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑進(jìn)行創(chuàng)新性改進(jìn)，最后可望在利用萘乙酸調(diào)節(jié)橡膠樹(shù)幼苗和老樹(shù)生長(zhǎng)的同時(shí)，對(duì)橡膠樹(shù)炭疽病進(jìn)行同步防治。這樣既可以在橡膠樹(shù)苗期和出新芽期等時(shí)期利用萘乙酸調(diào)節(jié)其生長(zhǎng)，并防治橡膠樹(shù)炭疽病，可望節(jié)省大量栽培和防治成本。

本實(shí)驗(yàn)主要研究萘乙酸對(duì)橡膠樹(shù)膠胞炭疽菌RC169生長(zhǎng)速率及其孢子萌發(fā)率和附著胞形成率的影響，以期為今后使用萘乙酸防治橡膠樹(shù)炭疽病研究作好鋪墊。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

橡膠樹(shù)膠孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）由中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院環(huán)境與植物保護(hù)研究所提供。

1.1.2 試劑

2.5%萘乙酸微乳液由安林生物化工有限公司生產(chǎn)。

1.2 方法

1.2.1 萘乙酸對(duì)生長(zhǎng)速率的影響

PDA培養(yǎng)基：200 g/L馬鈴薯煮出液，10 g/L葡萄糖，18 g/L瓊脂，121℃滅菌20 min。

萘乙酸含藥培養(yǎng)基配制方法： ①計(jì)算好所需配置的藥量，取標(biāo)準(zhǔn)用藥量為中間值，向兩邊各取2個(gè)濃度梯度。②向25 mL容量瓶中加入藥劑后，再加入2.5 mL DMF溶劑（分析純，N，N-二甲基甲酰胺），加入適量（一般2滴）的助劑（消泡劑DX-10），然后定容至25 mL。③用系列濃度稀釋法將藥劑配出5個(gè)濃度梯度。④選擇96 mL的培養(yǎng)基熔化，待溫度適宜后分別向各培養(yǎng)基中加入4 mL不同濃度梯度的藥劑，混合均勻并倒入培養(yǎng)皿制成含藥培養(yǎng)基平板。⑤在各平板上接種供試菌株，并設(shè)置對(duì)照組。4～5 d后觀察，測(cè)量，記錄數(shù)據(jù)并拍照，根據(jù)以下公式計(jì)算出抑菌率：抑菌率（%）=（Φ1-Φ2）/（Φ1-D）。其中，D為打孔器的直徑，本實(shí)驗(yàn)中D=0.5 cm；Φ1為對(duì)照組菌落直徑平均值；Φ2為實(shí)驗(yàn)組菌落直徑平均值。

1.2.2 萘乙酸對(duì)孢子萌發(fā)率和附著胞形成率的影響

根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)得出：RC169產(chǎn)孢快且量大，萌發(fā)條件易控制。孢子萌發(fā)判定方法：當(dāng)芽管長(zhǎng)度大于孢子自身寬度的1/2時(shí)，即視為萌發(fā)。

實(shí)驗(yàn)步驟：①水瓊脂玻片制備，將1%或2%水瓊脂熔化后，滴一滴水瓊脂至載玻片上，然后迅速用涂布棒推平，等其晾干。②孢子懸浮液的制取，直接向已產(chǎn)孢的培養(yǎng)皿中加入4～5 mL無(wú)菌水，將孢子洗脫下來(lái)，然后用參試試劑將其配制成每個(gè)視野中40～50個(gè)孢子的孢子懸浮液。③將制備好的孢子懸浮液滴一滴于①中的載玻片上，將載玻片放入含有濕潤(rùn)濾紙的大培養(yǎng)皿中，置于28℃，濕度為90%恒溫培養(yǎng)箱中。待孢子在T h（無(wú)菌水中萌發(fā)率超過(guò)80%所需要的時(shí)間）時(shí)，先用棉蘭乳酚油固定，然后用計(jì)數(shù)器數(shù)出孢子總數(shù)，萌發(fā)數(shù)及附著胞形成數(shù)目，算出孢子萌發(fā)率及附著胞形成率。④根據(jù)以上方法先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，得出RC169的T h。然后根據(jù)得出的T h進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算孢子萌發(fā)率[6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 萘乙酸對(duì)生長(zhǎng)速率的影響

萘乙酸對(duì)RC169生長(zhǎng)速率影響結(jié)果見(jiàn)圖1。從圖1可看出，隨著萘乙酸參試濃度從0.4到64 μg/mL規(guī)律性增大，RC169對(duì)應(yīng)的抑菌率則呈現(xiàn)規(guī)律性增加，分別為0.0、2.1%、0.6%、11.7%、14.7%、34.6%。總體上，隨著萘乙酸濃度的升高，RC169各菌落直徑隨之變小。通過(guò)處理原始數(shù)據(jù)，計(jì)算得出表1的結(jié)果。從表1處理得出相關(guān)的回歸方程y=0.542 2x-0.588 6，R2=0.968，差異達(dá)到極顯著，具體如圖2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑萘乙酸在一定的濃度范圍內(nèi)對(duì)橡膠樹(shù)炭疽菌RC169的生長(zhǎng)速率有一定的抑制作用。

2.2 萘乙酸對(duì)孢子萌發(fā)率和附著胞形成率的影響

萘乙酸對(duì)RC169孢子萌發(fā)率和附著胞形成率的影響結(jié)果見(jiàn)表2。經(jīng)多次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，RC169孢子萌發(fā)率超過(guò)80%以上的T=12 h。由表2可知，隨著萘乙酸濃度從0.00、0.04到10.20 μg/mL，RC169 的平均孢子萌發(fā)率分別為80.2%、90.6%、83.7%、56.7%、53.3%、31.3%；平均附著胞形成率則為 68.8%、85.3%、54.5%、22.5%、19.7%、2.7%；表明在萘乙酸0.04 μg/mL濃度下，RC169 的孢子萌發(fā)率和附著胞形成率均比對(duì)照稍大，但在總體上隨著萘乙酸濃度的升高，橡膠樹(shù)炭疽菌RC169的孢子萌發(fā)率和附著胞形成率隨之降低，差異顯著。為了更直觀地分析結(jié)果，依據(jù)數(shù)據(jù)求其相應(yīng)的線性回歸方程，得出圖3和圖4。

由圖3可推出，孢子萌發(fā)率的回歸方程：

y=-10.954x+104.31，R2=0.816 5；孢子萌發(fā)結(jié)果差異達(dá)到極顯著。

附著胞形成率的回歸方程：

y=-15.978x+98.178，R2=0.864 3；附著胞形成結(jié)果差異達(dá)到極顯著。

總體而言，隨著萘乙酸濃度的升高，橡膠樹(shù)炭疽菌RC169的孢子萌發(fā)率和附著胞形成率隨之降低。但在0.04 μg/mL時(shí)的孢子萌發(fā)率和附著胞形成率都比對(duì)照組大；從而推斷，在極低濃度下，萘乙酸對(duì)RC169孢子的萌發(fā)和附著胞的形成有一定的促進(jìn)作用。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)表明：在一定濃度范圍內(nèi)2.5%萘乙酸微乳液，對(duì)橡膠樹(shù)膠胞炭疽菌RC169的生長(zhǎng)速率具有抑制作用，且隨著用藥濃度的升高，其抑制作用相應(yīng)增強(qiáng)。此外，在一定極低濃度范圍內(nèi)2.5%萘乙酸微乳液，對(duì)橡膠樹(shù)膠胞炭疽菌RC169孢子萌發(fā)和附著胞的形成也具有促進(jìn)作用；隨著用藥濃度的增加，其對(duì)RC169的孢子萌發(fā)率和附著胞形成率由促進(jìn)作用變?yōu)橐种谱饔?。由此可以推測(cè)，一定條件下，極低濃度的萘乙酸可以增強(qiáng)炭疽菌RC169的抗逆性能力，從而增強(qiáng)孢子萌發(fā)率和附著胞形成率；隨著萘乙酸濃度的升高，其促進(jìn)作用會(huì)變?yōu)橐种谱饔谩?/p>

殺菌劑對(duì)膠胞炭疽菌抑制作用的主要方式是抑制菌絲生長(zhǎng)、芽管伸長(zhǎng)和分生孢子萌發(fā)[7]。本試驗(yàn)的結(jié)果與前人一般的藥劑敏感性結(jié)果一致，如鄭金龍通過(guò)9 種殺菌劑對(duì)柱花草膠孢炭疽病菌的室內(nèi)毒力測(cè)定結(jié)果[8]，劉永剛采用抑菌圈法和孢子萌發(fā)法測(cè)定枸杞炭疽病菌對(duì)19種藥劑的敏感性以及各種藥劑對(duì)孢子萌發(fā)的抑制作用[9]，曲健祿采用菌絲生長(zhǎng)速率法測(cè)定7 種常用殺菌劑對(duì)柿樹(shù)炭疽病菌的抑制作用[10]。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)萘乙酸對(duì)膠胞炭疽菌RC169的抑制作用屬于首次報(bào)道，萘乙酸對(duì)RC169孢子的萌發(fā)和附著胞的形成的促進(jìn)作用也未見(jiàn)報(bào)道，其作用原理還需要進(jìn)一步深入研究。

本實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，由于水分、光照、培養(yǎng)基厚度等因素的不一致，導(dǎo)致生長(zhǎng)速率的測(cè)定結(jié)果不盡相同，給實(shí)驗(yàn)結(jié)果造成一定的誤差；其次在孢子萌發(fā)率和附著胞形成率影響的測(cè)定過(guò)程中，由于每次滴在玻片上的水分、水瓊脂厚度、顯微鏡光線等因素不盡相同，致使實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，同一處理結(jié)果出現(xiàn)較大差異，這與以往文獻(xiàn)的報(bào)道相同[11-12]，更好更穩(wěn)定的測(cè)試方法還有待進(jìn)一步的探索。

參考文獻(xiàn)

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