霍小東 王慧星 閻衛(wèi)亮 焦玲 張文藝 鄭廣鈞 王俊杰 于振濤 柴樹德

300211，天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院胸外科（霍小東、閻衛(wèi)亮、鄭廣鈞、柴樹德），疼痛科（王慧星）；300192天津，中國醫(yī)學科學院放射醫(yī)學研究所，天津市放射醫(yī)學與分子核醫(yī)學重點實驗室（焦玲、張文藝）；100191，北京大學第三醫(yī)院腫瘤治療中心放療科（王俊杰）；300060，天津醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院食管腫瘤科，天津市腫瘤防治重點實驗室（于振濤）

血管內(nèi)皮抑制素對125I近距離照射裸鼠肺癌移植瘤的增敏效應研究

霍小東 王慧星 閻衛(wèi)亮 焦玲 張文藝 鄭廣鈞 王俊杰 于振濤 柴樹德

300211，天津醫(yī)科大學第二醫(yī)院胸外科（霍小東、閻衛(wèi)亮、鄭廣鈞、柴樹德），疼痛科（王慧星）；300192天津，中國醫(yī)學科學院放射醫(yī)學研究所，天津市放射醫(yī)學與分子核醫(yī)學重點實驗室（焦玲、張文藝）；100191，北京大學第三醫(yī)院腫瘤治療中心放療科（王俊杰）；300060，天津醫(yī)科大學附屬腫瘤醫(yī)院食管腫瘤科，天津市腫瘤防治重點實驗室（于振濤）

目的 探討重組人血管內(nèi)皮抑制素對125I粒子植入治療裸鼠肺癌移植瘤模型的輻射增敏效應。方法 建立裸鼠移植瘤模型，隨機分成對照組（A組）、125I植入組（B組）、重組人血管內(nèi)皮抑制素組（C組）和125I植入聯(lián)合重組人血管內(nèi)皮抑制素組（D組），每組20只。移植瘤直徑達2 cm時行125I粒子植入，處方劑量20 Gy，采用治療計劃系統(tǒng)計算移植瘤的體積及接受劑量。按每只裸鼠每天給予20 mg/kg重組人血管內(nèi)皮抑制素，連續(xù)給藥14 d，觀察并記錄腫瘤生長的速度和瘤體體積的變化，分別于第15、30天時處死裸鼠，并通過免疫組化方法檢測血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）的表達和微血管密度（MVD），通過RT-PCR分別檢測各組腫瘤組織中αvβ3 mRNA水平。結(jié)果 第15、30天時，D組的重量抑瘤率和體積抑瘤率與B、C組相比明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義，B組和D組第30天時的重量抑瘤率和體積抑瘤率均較第15天時明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義。免疫組化結(jié)果顯示，第15、30天時，D組與A、B、C組VEGF、MVD差異均有統(tǒng)計學意義，其中，C組與A、B組VEGF、MVD差異有統(tǒng)計學意義，C組第30天時的VEGF表達水平和MVD較第15天時增加，差異有統(tǒng)計學意義。RT-PCR結(jié)果顯示，第15、30天時，與A組相比，B組αvβ3 mRNA的表達有所增加，并隨時間的延長增加更明顯，差異有統(tǒng)計學意義，而C組和D組αvβ3 mRNA的表達下降，差異有統(tǒng)計學意義。結(jié)論 重組人血管內(nèi)皮抑制素對肺癌移植瘤的近距離輻射增敏作用明確，VEGF、MVD、αvβ3 mRNA的表達變化是其重要機制。

內(nèi)皮抑素類；肺腫瘤；輻射增敏藥；近距離放射療法

Fund programs:National Natural Science Foundation of Tianjin（15JCYBJC28400）;Science Foundation of Tianjin Medical University（2014KYQ27）

血管內(nèi)皮抑制素與外放療聯(lián)合應用的基礎(chǔ)研究已有報道，內(nèi)皮抑素對小鼠肺癌移植瘤、裸鼠人直結(jié)腸癌移植瘤以及對射線抗拒的移植瘤等均具有放射增敏作用[1]。但在多數(shù)研究中，血管內(nèi)皮抑制素僅與外放療聯(lián)合，對于聯(lián)合125I低劑量率近距離放療是否具有增敏作用尚缺少研究報道。重組人血管內(nèi)皮抑制素作為一種血管內(nèi)皮抑制素，其聯(lián)合125I低劑量率近距離照射是否對裸鼠肺癌移植瘤的輻射增敏有效果，是本研究的意義所在。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng)及裸鼠模型建立

細胞株采用A549肺癌細胞系，由天津市腫瘤研究所公共實驗室提供。培養(yǎng)液選取RPMI1640，加入10%胎牛血清、100 IU/mL青霉素、100 mg/mL鏈霉素，置于37℃、5%CO2的孵育箱中培養(yǎng)。80只雌性BALB/c裸鼠由天津市腫瘤研究所提供，先在實驗室飼養(yǎng)1～2 d（空氣層流室飼養(yǎng)，室溫為26～28℃，相對濕度50%）以適應室內(nèi)環(huán)境，腫瘤移植時小鼠為4～6周齡，體重為15～20 g。飼料、墊料、籠具及飲水等物品均經(jīng)高壓蒸氣滅菌，并在無菌條件下更換。每只裸鼠皮下接種指數(shù)生長期A549細胞，待細胞接種成功的移植瘤長徑達2 cm時，分離瘤組織，用剪刀將組織塊修剪成直徑約2 mm的小塊，用25號接種針將其種植于BALB/c裸鼠前肢腋窩組織內(nèi)，整個腫瘤組織塊的制備和種植均在無菌條件下進行。

1.2 瘤體大小的測量

記錄皮下移植瘤的長徑、短徑，按V（mm3）=（D×d2）/2計算腫瘤體積（V），其中，D是腫瘤表面最長徑，d是腫瘤表面最短徑。待裸鼠皮下種植的腫瘤組織塊生長至腫瘤體積達500 mm3后開始給藥及植入粒子。將裸鼠隨機分為4組：對照組（A組）、125I植入組（B組）、重組人血管內(nèi)皮抑制素組（C組）、125I植入聯(lián)合重組人血管內(nèi)皮抑制素組（D組），每組20只。

1.3 植入粒子及給藥

在無菌條件下，實驗人員穿鉛衣，戴護目鏡、鉛手套，先將裸鼠固定，消毒裸鼠前肢腋下直徑約1．5 cm范圍的皮膚3遍。以遠離選定點1 cm處為穿刺點刺入，植入針經(jīng)皮下穿過直至消毒皮膚中心，拔出針芯，將粒子放入植入針，用針芯將粒子慢慢推入預定點。CT掃描確定植入部位是否準確，將CT圖像輸入治療計劃系統(tǒng)，計算劑量。粒子植入成功后，待裸鼠蘇醒，送返動物飼養(yǎng)室繼續(xù)飼養(yǎng)。根據(jù)前期預實驗的結(jié)果，重組人血管內(nèi)皮抑制素總的給藥劑量為每只裸鼠每天20 mg/kg，質(zhì)量濃度約為200（80～450）μg/mL（0．9%生理鹽水稀釋），注射前1 h內(nèi)，避光，在超凈臺內(nèi)進行配制。通過裸鼠皮下進行注射，每日更換不同注射部位，連續(xù)注射14 d。

1．4 裸鼠移植瘤的瘤重及體積抑瘤率的測定

各組荷瘤裸鼠經(jīng)不同處理后，于第15、30天各處死5只，經(jīng)解剖分離并摘下瘤組織，測量其體積，并稱重。腫瘤體積抑瘤率=（對照組平均體積－治療組平均體積）/對照組平均體積×100%；腫瘤重量抑瘤率=（對照組平均瘤重－治療組平均瘤重）/對照組平均瘤重×100%。

1．5 免疫組織化學法檢測腫瘤組織中血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的表達和微血管密度（microvesseldensity，MVD）

各組荷瘤裸鼠經(jīng)不同處理后，分別于第15、30天各處死5只，取瘤組織做組織切片，通過對移植瘤組織進行染色及免疫組化二步法來檢測VEGF、MVD的表達情況。根據(jù)免疫組化結(jié)果，在400倍視野下選取具有代表性的區(qū)域，在每個選定區(qū)域中隨機選取150～200個細胞，根據(jù)視野內(nèi)的陽性細胞比例進行評分。當陽性細胞比例為≤5%、6%～25%、26%～50%、51%～75%、＞75%時，分別得到0分、1分、2分、3分、4分。根據(jù)顯色程度為無色、淺黃色、棕黃色、棕褐色可分別得到0分、1分、2分、3分。以上兩項得分相乘為該視野的總分。每張切片所得分是該切片選取的所有視野得分的均值。最后將切片的得分分為4個等級：0～1分表示陰性（－），2～4分為（+），5～8分為（++），9分以上為（+++）。

1．6 RT-PCR檢測αvβ3 mRNA表達差異

在約100 mg組織中加入1 mL Trizol，勻漿器勻漿，直到看不到大塊的組織，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后進行RT-PCR反應。使用的引物由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司合成，β-actin上游引物序列：5′-CACGATGGAGGGGCCGGACTCATC-3′，下游引物序列：5′-TAAAGACCTCTATGCCAACACAG-3′，片段長度265 bp，退火溫度58℃；αvβ3上游引物序列：5′-GCTCATTGGCCTTGCTACTC-3′，下游引物序列：5′-CCCGGTAGGTAGGTGATATTGGTG-3′，片段長度167 bp，退火溫度60℃。

1．7 統(tǒng)計學方法

腫瘤生長的平均相對體積、瘤重等計量資料采用均數(shù)±標準差（±s）來表示。各組數(shù)據(jù)組間比較采用單因素方差分析。分析率的比較運用Fisher’s確切檢驗或卡方檢驗，P＜0．05表示差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2．1 各組裸鼠移植瘤的重量及體積抑瘤率的比較

第30天時，D組的重量抑瘤率與B、C組相比明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=12．9、50．0，P均＜0．05），D組體積抑瘤率與B、C組相比明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=13．7、46．1，P均＜0．05）；第30天時，D組的重量抑瘤率與B、C組相比明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=10．8、63．2，P均＜0．05），D組體積抑瘤率與B、C組相比明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=9．1、63．2，P均＜0．05）；B組第30天時的重量抑瘤率和體積抑瘤率較第15天時明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（χ2=7．3、5．2，P均＜0．05）；D組第30天時的重量抑瘤率和體積抑瘤率較第15天時明顯增加，差異有統(tǒng)計學意義（χ2= 4．3、4．6，P均＜0．05）；而C組第30天時的重量抑瘤率和體積抑瘤率較第15天時無明顯變化，差異無統(tǒng)計學意義（χ2=2．3、3．2，P均＞0．05）。詳見表1。

2．2 粒子植入后瘤體接受劑量

粒子植入后用治療計劃系統(tǒng)進行粒子重建，導出劑量體積直方圖驗證靶區(qū)瘤體接受的覆蓋90%靶體積時的劑量（D90）為（20．3±2．2）Gy，被90%劑量覆蓋的靶體積百分比（V90）為98．3%±8．2%，匹配周邊劑量為20．1 Gy。覆蓋90%靶體積時的劑量大于匹配周邊劑量。

2．3 免疫組化檢測移植瘤VEGF表達、MVD情況

免疫組化檢測結(jié)果顯示：第15天時，D組VEGF表達水平與A、B、C組比較差異有統(tǒng)計學意義（t=11．9、12．6、3．3，P均＜0．05），D組MVD與A、B、C組比較差異有統(tǒng)計學意義（t=48．8、31．2、4．4，P均＜0．05）。第30天時，D組VEGF表達水平與A、B、C組比較差異有統(tǒng)計學意義（t=10．5、9．5、3．1，P均＜0．05），D組MVD與A、B、C組比較差異有統(tǒng)計學意義（t=45．1、26．9、11．8，P均＜0．05）。其中，C組第15天時VEGF表達水平與A、B組比較差異有統(tǒng)計學意義（t=11．5、12．2，P均＜0．05），C組MVD與A、B組比較差異有統(tǒng)計學意義（t=39．1、25．8，P均＜0．05）；C組第30天時VEGF表達水平與A、B組比較差異有統(tǒng)計學意義（t=7．0、6．2，P均＜0．05），C組MVD與A、B組比較差異有統(tǒng)計學意義（t=34．4、18．3，P均＜0．05）；C組第30天時VEGF表達水平和MVD較第15天時增加，且差異有統(tǒng)計學意義（t=3．8、4．3，P均＜0．05）。詳見表2。

表1 不同處理方法組中裸鼠移植瘤的體積及重量抑瘤率（%）Table 1 Volume，weight and growth inhibitory rate of the transplanted tumor in different treatment groups（%）

表2 不同處理方法組中裸鼠移植瘤的VEGF表達和MVD比較Table 2 Expression of VEGF and MVD in different treatment groups

2．4 不同處理方法對移植瘤αvβ3mRNA表達的影響

RT-PCR結(jié)果顯示：第15、30天時，與A組相比，B組αvβ3 mRNA的表達有所增加，并隨時間的延長增加更明顯，差異有統(tǒng)計學意義（t=6．6、15．4，P＜0．05），而C組和D組αvβ3 mRNA的表達下降，差異有統(tǒng)計學意義（C vs．A：t=16．1、16．5，P均＜0．05；D vs．A：t=9．4、12．9，P均＜0．05）。說明重組人血管內(nèi)皮抑制素聯(lián)合125I粒子照射可以抑制腫瘤細胞內(nèi)αvβ3 mRNA的表達，D組最明顯（表3）。

表3 不同處理方法組中移植瘤αvβ3mRNA的表達比較Table 3 αvβ3 mRNA expression of transplanted tumor in different treatment groups

3 討論

肺癌是世界范圍內(nèi)常見的惡性腫瘤之一，其病死率在惡性腫瘤中居前位[2－3]。在我國，肺癌也是病死率最高的腫瘤，80%確診時往往已屬中晚期[4]，失去了根治性手術(shù)切除的機會，而只能采用放射治療。放射性粒子植入治療腫瘤是局部適形內(nèi)放療。國內(nèi)外多位學者研究報道了經(jīng)CT引導下125I粒子植入治療中晚期肺癌，均取得了一定的療效，但對大多數(shù)惡性腫瘤患者的長期生存率并沒有明顯地提高，主要原因是大多數(shù)腫瘤細胞對射線的敏感性較差或產(chǎn)生耐受[5－6]。因此，探求具有射線增敏作用的藥物具有重要的意義。VEGF抑制劑在正常血管系統(tǒng)中廣泛表達，但對腫瘤新生血管的形成起著負性調(diào)節(jié)的作用，同時對原始內(nèi)皮細胞的分化、血管內(nèi)皮細胞的增殖及腫瘤生長均有抑制作用。經(jīng)過近40年的探索，近年來已經(jīng)有幾十種新生血管抑制劑進入Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ期臨床研究，其中最引人注目的便是目前發(fā)現(xiàn)的最廣譜的血管生成抑制劑——Endostatin。Endostatin能作用于VEGF的受體KDR/Flk-1，阻止VEGF與內(nèi)皮細胞結(jié)合，直接阻斷VEGF的作用[7]。重組人血管內(nèi)皮抑制素聯(lián)合化療治療中晚期非小細胞肺癌已經(jīng)在我國完成了Ⅲ期臨床試驗并取得了可喜成果[8]。

重組人血管內(nèi)皮抑制素聯(lián)合放療處理A549肺腺癌細胞[9]及移植瘤[10-11]、Lewis肺癌細胞移植瘤[12]、H520肺鱗癌細胞[13]的相關(guān)研究均證實重組人血管內(nèi)皮抑制素聯(lián)合放療與單純放療相比顯著提高了對移植瘤及腫瘤細胞的生長抑制作用，具有放射增敏作用。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，D組對腫瘤的抑制作用最強，較A、B和C組更加明顯，而VEGF表達和MVD的變化為不同處理組抑制作用的差異提供了解釋。

125I作為一種低劑量率輻射源，半衰期為60.2 d。近距離治療的劑量率是按治療區(qū)內(nèi)參考點單位時間（h）所受到的放射劑量來決定的。劑量率直接影響放射治療時的生物效應。125I的劑量率為7.72 cGy/h。研究發(fā)現(xiàn)在較低范圍內(nèi)的不同劑量率照射下，細胞的反應也會出現(xiàn)不同的結(jié)果，從而產(chǎn)生不一樣的劑量率效應[14]。本研究采用125I低劑量率照射，B組和D組第30天時的重量抑瘤率和體積抑瘤率較第15天時均明顯增加，且差異有統(tǒng)計學意義，說明隨著照射時間的延長，腫瘤所接受的劑量增加，細胞死亡增多，重量及體積減小。但D組較B組第15、30天時的重量抑瘤率和體積抑瘤率增加，且差異有統(tǒng)計學意義。Jain[15-16]提出了“腫瘤血管正?；钡母拍?，即抗血管生成藥物將腫瘤血管系統(tǒng)重新組織，使其結(jié)構(gòu)能重塑并接近正常，功能得到改善，氧合作用增強，組織間液的壓力降低，可提高放療對抗腫瘤的療效。因此，考慮重組人血管內(nèi)皮抑制素作為一種抗血管生成藥物，能顯著改善腫瘤血管乏氧狀態(tài)，使“腫瘤血管正?；?，降低腫瘤細胞對射線的抵抗性。本研究中處方劑量選定20 Gy主要考慮更低劑量不一定能對移植瘤產(chǎn)生明確的抑制效果，而更高的劑量可能對腫瘤產(chǎn)生過強的抑制作用，進而掩蓋重組人血管內(nèi)皮抑制素的療效，反而不利于實驗觀察。

整合素αvβ3 mRNA在內(nèi)皮細胞中過度表達，主要參與內(nèi)皮細胞的增殖、遷移和存活，促進新生血管的生長。本研究顯示125I植入組αvβ3 mRNA表達增高，Abdollahi等[17]在αvβ3 mRNA拮抗劑聯(lián)合外放療對人臍靜脈內(nèi)皮細胞的研究中發(fā)現(xiàn)，隨著照射劑量的增加，內(nèi)皮細胞αvβ3 mRNA的表達升高，這表明整合素αvβ3 mRNA對腫瘤微血管免受放射誘導的損傷起著保護作用。本研究顯示重組人血管內(nèi)皮抑制素聯(lián)合低劑量率放療抑制αvβ3 mRNA的作用顯著，其原因可能是在使用重組人血管內(nèi)皮抑制素后腫瘤組織αvβ3 mRNA表達降低，使腫瘤新生血管減少，改善了腫瘤組織乏氧；另外，低劑量率放療增加了腫瘤組織αvβ3 mRNA的表達，使腫瘤細胞對重組人血管內(nèi)皮抑制素的抗αvβ3作用靶點增多，從而起到增敏作用。

綜上所述，抗血管生成治療的主要靶點是腫瘤血管，近距離放射治療的主要靶點是腫瘤細胞。兩者之間存在協(xié)同作用機制從而提高放射治療的療效[18]。也有學者認為，放射治療可誘導腫瘤組織中血管生長因子VEGF的表達，增加腫瘤血管內(nèi)皮細胞的放射抵抗，刺激腫瘤血管生長；而抗血管藥物可抑制VEGF的表達，同時抑制新生血管生成，從而預防或延遲了腫瘤的局部復發(fā)[19]。本研究結(jié)果提示，重組人血管內(nèi)皮抑制素對肺癌移植瘤的近距離輻射增敏作用明確，VEGF、MVD、αvβ3 mRNA的表達變化是其重要機制，本研究為臨床中應用重組人血管內(nèi)皮抑制素聯(lián)合125I粒子治療非小細胞肺癌提供了理論依據(jù)。

利益沖突 本研究由署名作者按以下貢獻聲明獨立開展，不涉及任何利益沖突。

作者貢獻聲明 霍小東負責研究命題的提出、設(shè)計及論文起草；王慧星、閻衛(wèi)亮負責研究過程的實施；焦玲、張文藝、鄭廣鈞負責數(shù)據(jù)的獲取、提供與分析；王俊杰、于振濤負責研究命題的總體提出并進行監(jiān)督工作；柴樹德負責研究命題的提出、設(shè)計以及論文審核。

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Sensitization effect of endostatin for125I brachytherapy on transplanted tumor in nude mice

Huo Xiaodong,Wang Huixing,Yan Weiliang,Jiao Ling,Zhang Wenyi,Zheng Guangjun,Wang Junjie,Yu Zhentao,Chai Shude
Department of Thoracic Surgery,the Second Hospital of Tianjin Medical University,Tianjin 300211,China（Huo XD,Yan WL,Zheng GJ,Chai SD）;Pain Management Center,the Second Hospital of Tianjin Medical University,Tianjin 300211,China（Wang HX）;Tianjin Key Laboratory of Radiation Medicine and Molecular Nuclear Medicine,Institute of Radiation Medicine,Chinese Academy of Medical Sciences, Tianjin 300192,China（Jiao L,Zhang WY）;Department of Radiation Oncology,Peking University Third Hospital,Beijing 100191,China（Wang JJ）;Tianjin Key Laboratory of Cancer Prevention and Therapy,Department of Esophageal Oncology,Cancer Institute and Hospital of Tianjin Medical University,Tianjin 300060,China（Yu ZT）

Chai Shude,Email：chaishude@126.com

ObjectiveTo investigate the radiation sensitization effect of endostatin on transplanted tumors in nude mice with125I radioactive seed.MethodsMice were randomly assigned to four groups（n=20）：control group（group A）,125I radioactive seed group（group B）,endostatin group（group C）,and125I radioactive seed combined with endostatin group（group D）.When the diameter of the transplanted tumor was greater than 2 cm,125I radioactive particles were implanted.The prescription dose was 20 Gy. Treatment planning system was used to calculate the target area and size of tumors.Endostatin was injected intraperitoneally at 20 mg/kg once every day for 14 days,and the changes in tumor growth and size were observed.The animals were sacrificed at 15 and 30 days.The expression levels of vascular endothelial growth factor（VEGF）and microvessel density（MVD）in tumor tissues were detected by immunohistochemistry,whereas αvβ3 mRNA levels were determined by RT-PCR.ResultsCompared with groups B and C,the tumor size,tumor weight,and tumor growth inhibitory rate of group D significantly increased at 15 and 30 days.The tumor size,tumor weight,and tumor growth inhibitory rate of groups B and D significantly increased at 30 days compared with those at 15 days.Immunohistochemical staining revealed that the expression levels of VEGF and MVD in group D were significantly different at 15 and 30 days compared with those in groups A,B,and C.The expression of VEGF and MVD in group C was significantly different at 15 and 30 days compared with that in groups A and B.VEGF and MVD in group C were significantly up-regulated at 30 days compared with those at 15 days.RT-PCR analysis demonstrated that the expression of αvβ3 mRNA in group B obviously increased with time compared with that in group A.Compared with group A,αvβ3 mRNA in group B was up-regulated,whereas αvβ3 mRNA in groups C and D was significantly down-regulated.Compared with groups C and B,group D exhibited a statistically significant difference.ConclusionEndostatin is helpful to brachytherapy of lung tumor with radiosensitizing enhancement effects.Changes in VEGF,MVD,and αvβ3 mRNA may be the rational treatment mechanism.

Endostatins;Lung neoplasms;Radiation-sensitizing agents;Brachytherapy

柴樹德，Email：chaishude@126.com

10.3760/cma.j.issn.1673-4114.2016.05.006

天津市自然科學基金（15JCYBJC28400）；天津醫(yī)科大學科學基金（2014KYQ27）

2016-04-14）