張?zhí)m英，張婧，歐陽瑤

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，貴州遵義563000)

煙熏誘導(dǎo)慢性阻塞性肺疾病小鼠模型的建立及驗(yàn)證

張?zhí)m英，張婧，歐陽瑤

(遵義醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院，貴州遵義563000)

目的 建立一種煙熏誘導(dǎo)的慢性阻塞性肺疾病(COPD)小鼠模型，并對其進(jìn)行驗(yàn)證。方法 將32只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為正常組、煙熏2周組、煙熏4周組、恢復(fù)組，各8只。正常組不予煙熏，煙熏2、4周組及恢復(fù)組置于熏煙箱中，被動吸煙6支/次，每次1 h；兩次間隔30 min呼吸新鮮空氣，4次/d，5 d/周。煙熏2周組第10天停止吸煙，煙熏4周組第26天停止吸煙，恢復(fù)組煙熏4周后再正常飼養(yǎng)2周。觀察各組一般情況及體質(zhì)量變化，測定支氣管肺泡灌洗液(BALF)中蛋白含量；取肺組織制備切片，HE染色觀察病理形態(tài)變化及肺泡直徑。結(jié)果 建模開始后正常組體質(zhì)量呈上升趨勢，煙熏2、4周組及恢復(fù)組出現(xiàn)精神萎靡、食欲降低，體質(zhì)量較同時(shí)間點(diǎn)正常組降低(P均<0.01)；恢復(fù)組停止煙熏后體質(zhì)量緩慢上升，但仍低于正常組(P均<0.05)。BALF蛋白含量：煙熏2、4周組及恢復(fù)組均明顯高于正常組(P均<0.01)；煙熏4周組及恢復(fù)組明顯高于煙熏2周組，恢復(fù)組明顯低于煙熏4周組(P均<0.01)。肺組織病理形態(tài)學(xué)顯示，正常組肺組織有少量淋巴細(xì)胞，肺泡結(jié)構(gòu)完整；煙熏2周組有少量中性粒細(xì)胞、大量單核細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤，肺泡擴(kuò)大，部分肺泡間隔斷裂并融合；煙熏4周組肺組織伴有少量中性粒細(xì)胞浸潤，單核細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤較煙熏2周組明顯增多；支氣管上皮細(xì)胞變性、壞死脫落，部分肺泡間隔變窄、斷裂并融合成肺大皰。肺泡直徑：煙熏2、4周組及恢復(fù)組均大于正常組，煙熏4周組及恢復(fù)組均大于煙熏2周組(P均<0.01)，煙熏4周組與恢復(fù)組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。結(jié)論 單純煙熏4周法成功制備COPD小鼠模型；該模型符合人類COPD的病理和功能改變，是進(jìn)行COPD動物實(shí)驗(yàn)的理想建模方法。

慢性阻塞性肺疾病；煙熏法；動物模型；小鼠

慢性阻塞性肺疾病(COPD)是一種以氣流受限呈進(jìn)行性發(fā)展且不完全可逆為特征的慢性肺疾病，與肺組織對有害顆粒和氣體的異常炎癥反應(yīng)有關(guān)[1]。COPD是一個(gè)高發(fā)病率、高病死率的慢性疾病，其發(fā)病率仍然在不斷上升。目前COPD的發(fā)病機(jī)制仍未明確，臨床上尚無有效的預(yù)防和治療方法[2]。理想的COPD動物模型對于其基礎(chǔ)和臨床研究至關(guān)重要。COPD的建模方法較多，但目前尚無公認(rèn)的最理想方法。2015年4～6月，本研究采用煙熏法制備COPD小鼠模型并進(jìn)行了驗(yàn)證，旨在為COPD的基礎(chǔ)和臨床研究提供新的動物模型。

1 材料及方法

1.1 材料 動物：SPF級C57BL/6小鼠32只，6～8周齡，雌雄各半，體質(zhì)量(23±4)g，購自重慶第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動物中心[許可證號：SCXK(渝)2012-0005] 。試劑：黃果樹牌香煙(貴州中國工業(yè)有限責(zé)任公司)，焦油量11 mg、煙氣煙堿量1.0 mg、煙氣一氧化碳量13 mg；考馬斯亮蘭(南京建成生物工程研究所)。儀器與設(shè)備：熏煙箱(自制有機(jī)玻璃箱，90 cm×40 cm×30 cm，蓋子左中右各有3個(gè)直徑為1.5 cm的通氣孔)，電子天平(上海花潮電器有限公司)，離心機(jī)(LD5-2A，北京京立離心機(jī)有限公司)，全自動組織切片機(jī)(RM2145，德國Leica公司 )，深低溫冰箱(MDF-382E型，日本Sanyo公司)，光學(xué)顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.2 COPD模型制備 將32只小鼠隨機(jī)分為正常組、煙熏2周組、煙熏4周組及恢復(fù)組，各8只，四組的飼養(yǎng)環(huán)境完全相同。正常組不予煙熏，煙熏2、4周組及恢復(fù)組全身置于熏煙箱中，被動吸煙6支/次，1 h/次，4次/d，時(shí)間點(diǎn)分別為09:00、10:30、15:00、16:30，5 d/周。熏煙2周組第12天停止吸煙，熏煙4周組第26天停止吸煙，恢復(fù)組煙熏4周后再繼續(xù)正常飼養(yǎng)2周。每次煙熏結(jié)束后，將正常組、熏煙2周組、熏煙4周組及恢復(fù)組共同置于正常的環(huán)境中飼養(yǎng)，溫度21～26 ℃，濕度30%～70%，12 h明暗交替，自由攝食、攝水。

1.3 相關(guān)指標(biāo)觀察 ①一般情況及體質(zhì)量：觀察各組一般情況，煙熏前及煙熏后每周稱量各組體質(zhì)量，動態(tài)觀察熏煙對小鼠體質(zhì)量的影響。②BALF蛋白含量：采用考馬斯亮藍(lán)法。最后一次煙熏后24 h，予4%水合氯醛(100 g/mL)腹腔注射麻醉小鼠，將小鼠仰臥位固定于固定板上。切開氣管前方皮膚，鈍性分離暴露氣管，剖開胸腔，結(jié)扎右主支氣管，在氣管處作一倒“V”字形小口。以拔除針芯的24號靜脈套管針快速插入氣管，予生理鹽水灌洗左主支氣管和肺泡(0.6 mL/次，連續(xù)3次)。共收集BALF約1.5 mL，1 500 r/min離心10 min。取上清液，采用考馬斯亮藍(lán)法檢測BALF蛋白含量，嚴(yán)格按試劑盒說明操作。③肺組織大體形態(tài)：收集BALF后取出肺組織，觀察其大體形態(tài)。④肺組織病理形態(tài)及肺泡直徑：將右下肺組織置于10%中性緩沖甲醛固定液中進(jìn)行固定，石蠟包埋、切片，行HE染色。光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織病理形態(tài)，每張切片隨機(jī)計(jì)數(shù)20個(gè)肺泡，測量其直徑，取平均值。

2 結(jié)果

2.1 各組一般情況及體質(zhì)量比較 正常組直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束均無異常，毛發(fā)光澤，眼睛有神，活潑好動，食欲正常，呼吸平穩(wěn)。煙熏2、4周組逐漸出現(xiàn)體型減小，毛發(fā)枯燥，眼睛無神，精神萎靡，活動減少，食欲下降，弓背卷縮，出現(xiàn)倦怠、打噴嚏，呼吸急促。正常組無死亡，煙熏2周組熏煙過程中死亡1只。煙熏前各組體質(zhì)量比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P均>0.05)，煙熏開始后正常組體質(zhì)量呈上升趨勢，而煙熏2、4周組及恢復(fù)組煙熏后體質(zhì)量較正常組同時(shí)間點(diǎn)降低(P均<0.01)，恢復(fù)組正常飼養(yǎng)后體質(zhì)量緩慢上升，但仍較正常組低(P均<0.05)。見表1。

表1 各組不同時(shí)間點(diǎn)體質(zhì)量比較±s)

注：與正常組同時(shí)間點(diǎn)比較，*P<0.05，△P<0.01。

2.2 各組BALF蛋白含量比較 煙熏2、4周組及恢復(fù)組BALF蛋白含量分別為(218.41±23.85)、(539.08±184.75)、(436.19±32.96)mg/L，均高于正常組(85.64±27.88)mg/L(P均<0.01)；煙熏4周組及恢復(fù)組BALF蛋白含量均高于煙熏2周組，恢復(fù)組低于煙熏4周組(P均<0.01)。

2.3 各組肺組織大體形態(tài)比較 正常組肺組織大小正常，顏色粉紅，有光澤，無腫脹、出血。與正常組相比，煙熏2、4周組肺組織體積增大，腫脹明顯，無出血及滲出物，顏色灰白，光澤度差，肺表面有褐色斑點(diǎn)；且煙熏4周組較煙熏2周組更明顯?；謴?fù)組與煙熏4周組肺組織大體形態(tài)比較無明顯差異。

2.4 各組肺組織病理形態(tài)比較 正常組光鏡下肺泡間隔見少量炎性細(xì)胞浸潤，以淋巴細(xì)胞為主，肺泡壁完好，肺泡結(jié)構(gòu)連續(xù)。煙熏2周組鏡下見毛細(xì)血管擴(kuò)張充血、出血，局部肺泡間隔水腫增寬，伴有少量中性粒細(xì)胞及大量單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞浸潤，肺泡擴(kuò)大，部分肺泡間隔斷裂并融合。煙熏4周組鏡下見毛細(xì)血管擴(kuò)張充血、出血較多，部分肺泡腔中有紅細(xì)胞；肺間質(zhì)水腫，滲出少量水腫液，肺間隔水腫增寬；伴有少量中性粒細(xì)胞浸潤，單核細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤較煙熏2周組明顯增多；支氣管上皮細(xì)胞變性、壞死脫落，部分肺泡間隔變窄、斷裂并融合成肺大皰。恢復(fù)組鏡下肺泡間隔水腫較煙熏4周組明顯減輕，但局部仍有水腫，伴有少量單核細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤，較煙熏4周組減少，肺泡腔擴(kuò)大與煙熏4周組無明顯差異。見插頁Ⅱ圖4。

2.5 各組肺泡直徑比較 正常組、煙熏2周組、煙熏4周組及恢復(fù)組肺泡直徑分別為(3.06±1.26)×10-2、(6.45±1.01)×10-2、(8.72±1.76)×10-2、(8.48±1.37)×10-2mm。煙熏2、4周組及恢復(fù)組肺泡直徑均大于正常組，煙熏4周組及恢復(fù)組均大于煙熏2周組(P均<0.01)，煙熏4周組與恢復(fù)組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3 討論

動物模型實(shí)驗(yàn)是了解COPD發(fā)病機(jī)制和探索其治療方法的重要手段。目前COPD模型主要有脂多糖誘導(dǎo)模型、煙熏模型、吸入NO2模型、呼吸道感染模型、蛋白酶誘導(dǎo)模型、基因工程模型及兩個(gè)或多個(gè)模型聯(lián)合[3,4]。脂多糖誘導(dǎo)模型需行氣管暴露，是對小鼠的再次打擊，對實(shí)驗(yàn)技術(shù)要求較高，且不符合臨床誘因；此外，脂多糖誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)可以被糖皮質(zhì)激素抑制，但臨床上較多的COPD患者對糖皮質(zhì)激素不敏感[5]。煙熏模型最大的優(yōu)點(diǎn)在于能模擬COPD最主要的發(fā)病因素——吸煙，但其缺乏標(biāo)準(zhǔn)的暴露方法及檢測方法。吸入NO2制備慢性支氣管炎模型，長期氣管炎可導(dǎo)致肺氣腫，但此法操作復(fù)雜，費(fèi)時(shí)耗力[6]；呼吸道感染法符合臨床誘因，但是必須確定一個(gè)合適的活菌感染量[7]；基因工程模型耗時(shí)長，費(fèi)用高，且不符合臨床病因[8]；蛋白酶誘導(dǎo)模型可在較短時(shí)間內(nèi)迅速建模，對肺組織損害持續(xù)時(shí)間較長，但是其炎癥持續(xù)時(shí)間較短，不符合COPD的病理生理特點(diǎn)[9]。符合臨床實(shí)際的理想COPD動物模型應(yīng)具備的條件[10]：①致傷因素與臨床COPD常見誘因基本一致；②必須有氣流阻塞存在，小氣道阻力增高、肺動態(tài)順應(yīng)性下降；③氣道重塑；④可伴有氣道高反應(yīng)性。COPD的病因不明確，目前認(rèn)為與肺組織對有害顆粒和氣體的異常炎癥反應(yīng)有關(guān)，是基因與環(huán)境相互作用的結(jié)果[11]，其中環(huán)境因素中最重要的兩個(gè)因素是吸煙和感染[12]。流行病學(xué)資料表明，COPD是一個(gè)與吸煙關(guān)系密切的炎性疾病[13,14]。煙草中含有焦油、尼古丁及大量粉塵顆粒等幾千種化學(xué)物質(zhì)，長期吸煙可導(dǎo)致多種肺部炎癥性疾病，如慢性支氣管炎、COPD等[15,16]，患有COPD的吸煙患者戒煙后肺部炎癥仍持續(xù)存在[17]。煙熏法雖有一些缺點(diǎn)，如COPD患者絕大部分是主動吸煙，而煙熏法是被動吸煙，但卻是最符合COPD臨床誘因及發(fā)病機(jī)制的建模方法。

本研究采用煙熏法制備COPD小鼠模型，肺組織病理形態(tài)觀察結(jié)果顯示煙熏4周組病理學(xué)特征符合臨床上COPD的病理學(xué)改變?；謴?fù)組炎癥狀況較煙熏4周組減輕，但是肺泡無明顯減小，證明煙熏后小鼠肺氣腫是不可逆病變，亦說明該方法制備的COPD模型是穩(wěn)定的。中性粒細(xì)胞反映急性炎癥情況，而單核細(xì)胞及淋巴細(xì)胞則反映慢性炎癥情況。本研究各組肺組織病理形態(tài)顯示，煙熏2、4周組中性粒細(xì)胞少于單核細(xì)胞及淋巴細(xì)胞，考慮與本次實(shí)驗(yàn)動物組織的取材時(shí)間有關(guān)，在實(shí)驗(yàn)中取材時(shí)間定于最后一次煙熏后24 h，故反映急性炎癥的中性粒細(xì)胞較少，而單核細(xì)胞及淋巴細(xì)胞較多。

慢性炎癥刺激COPD患者肺組織中央氣道杯狀細(xì)胞增多及黏液腺增大，導(dǎo)致黏液高分泌，而黏蛋白是黏液中的重要組成部分，故BALF蛋白含量可反映氣道炎癥情況[18]。本研究結(jié)果顯示，BALF蛋白含量隨著煙熏時(shí)間的延長而增加，煙熏2、4周組及恢復(fù)組BALF蛋白含量均高于正常組；煙熏4周組及恢復(fù)組BALF蛋白含量均較煙熏2周組明顯增多；但停止煙熏后恢復(fù)組BALF蛋白含量明顯低于煙熏4周組，與以往的研究結(jié)果相符[18,19]。正常小鼠因氣道與外界相通，一些致病原進(jìn)入氣道致使其產(chǎn)生少量黏蛋白，而煙熏則極大地刺激小鼠氣道杯狀細(xì)胞增生和黏液腺增多，分泌大量黏液；當(dāng)停止吸煙后炎癥逐漸減輕，BALF蛋白含量逐漸減少。所以，BALF蛋白含量變化也證實(shí)此煙熏法能夠?qū)е轮夤苎装Y。

綜上所述，本研究成功采用單純煙熏4周法制備了COPD小鼠模型。該模型煙熏停止2周后各項(xiàng)指標(biāo)穩(wěn)定，符合臨床COPD的病理生理過程。

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國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81460008)。

歐陽瑤(E-mail: ouyangyao116@sohu.com)

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.32.011

R714.253

A

1002-266X(2016)32-0035-04

2015-09-04)