孫清斌，沈仁芳，尹春芹，趙學(xué)強中國科學(xué)院南京土壤研究所土壤與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展國家重點實驗室，南京　0008湖北理工學(xué)院環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，黃石　435003

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鋁脅迫下胡枝子根尖胼胝質(zhì)形成規(guī)律及影響因素

孫清斌1，2，沈仁芳1，*，尹春芹2，趙學(xué)強1
1中國科學(xué)院南京土壤研究所土壤與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展國家重點實驗室，南京210008
2湖北理工學(xué)院環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，黃石435003

摘要:采用水培試驗，研究了鋁脅迫下兩個胡枝子品種根尖產(chǎn)生胼胝質(zhì)的變化規(guī)律及影響因素。結(jié)果表明，兩個品種的根尖鋁吸收量與胼胝質(zhì)形成量呈正比例關(guān)系。品種間差異主要是在根尖0—0.5 cm處。敏感品種胼胝質(zhì)形成量同鋁吸收量的變化趨勢相一致，而耐性品種則在鋁處理6 h時出現(xiàn)一個高峰值后下降。去除鋁脅迫后，耐性品種胼胝質(zhì)形成量并不顯著減少。與單獨鋁處理相比，陰離子通道抑制劑苯甲酰甲醛加鋁處理對兩個品種胼胝質(zhì)形成無影響;尼氟滅酸加鋁處理抑制敏感品種胼胝質(zhì)的形成，對耐性品種無影響;蒽-9-羧酸加鋁處理顯著抑制兩個品種的胼胝質(zhì)形成。另外，抑制劑2-去氧-D-葡萄糖加鋁共同處理與單獨鋁處理相比，敏感品種的胼胝質(zhì)形成量顯著降低，耐性品種無影響。甘露醇對兩個品種胼胝質(zhì)形成的影響無顯著差別。鑭處理下胼胝質(zhì)的形成量是耐性品種顯著高于敏感品種，鋁、鑭同時處理胼胝質(zhì)的形成量最高。敏感品種胼胝質(zhì)形成處理間無差別?？傊托云贩N在鋁脅迫下胼胝質(zhì)形成與有機酸分泌可能存在一定的協(xié)調(diào)關(guān)系;鋁脅迫下胼胝質(zhì)形成是敏感指標;在一定條件下，特別是有機酸分泌前胼胝質(zhì)的形成可能具有一定抗性意義;鋁誘導(dǎo)胼胝質(zhì)的形成受多種外界因素(濃度、時間、有機酸分泌，滲透壓等)的影響。

關(guān)鍵詞:胡枝子;鋁脅迫;胼胝質(zhì);有機酸

孫清斌，沈仁芳，尹春芹，趙學(xué)強.鋁脅迫下胡枝子根尖胼胝質(zhì)形成規(guī)律及影響因素.生態(tài)學(xué)報，2016，36(4):1073-1082.

Sun Q B，Shen R F，Yin C Q，Zhao X Q.Analysis of variations in and factors affecting callose formation in response to al stress in Lespedeza Root Tips.Acta Ecologica Sinica，2016，36(4):1073-1082.

酸性土壤中鋁毒害是限制作物生長和產(chǎn)量的最主要影響因子之一［1］。到目前為止，鋁脅迫下對質(zhì)外體和共質(zhì)體所造成的毒害被認為是澄清鋁毒害機制中至關(guān)重要的環(huán)節(jié)［2］。盡管共質(zhì)體的作用不容忽視，但質(zhì)外體的保護作用卻是植物具備耐鋁性的前提條件［1］。這是因為盡管質(zhì)外體在地上器官和根皮層的組織體積中僅占5%或更少［3］，但其結(jié)構(gòu)和運輸特性決定了其在水分、養(yǎng)分和生長物質(zhì)(激素)運輸上起著重要作用［4］。多位專家認為，植物的質(zhì)外體具備調(diào)控植物鋁毒害的能力［5-7］。因此，研究鋁脅迫下質(zhì)外體反應(yīng)，探索其與鋁脅迫之間的關(guān)系有著一定的理論意義。

鋁毒害下植物最快的反應(yīng)之一是胼胝質(zhì)迅速在質(zhì)外體部位合成和沉淀，這一生理反應(yīng)可以在數(shù)分鐘內(nèi)檢測到［2，8］。高等植物原生質(zhì)膜上包含葡聚糖合酶，用于纖維素和胼胝質(zhì)的合成［9］，其中纖維素合酶和胼胝質(zhì)合酶復(fù)合體構(gòu)成了原生質(zhì)膜上的第二大蛋白家族，這一聚合體存在于原生質(zhì)膜的外表面，致力于調(diào)控纖維素和胼胝質(zhì)的合成［10］。植物在遇到機械傷害、生理逆境或病菌感染時胼胝質(zhì)合酶會大量合成胼胝質(zhì)［11-13］。近年來，研究發(fā)現(xiàn)擬南芥胼胝質(zhì)合酶(GSL)家族包含12個成員(GSL1-GSL12)［14］，根據(jù)其在植物體內(nèi)的功能可分兩組［15］:較大組(包括GSL1，GSL2，GSL6，GSL8，GSL10)的作用是在花粉形成和細胞分裂過程中合成胼胝質(zhì);較小組(包括GSL5，GSL7，GSL12)的作用是逆境條件下形成胼胝質(zhì)，以加強細胞結(jié)構(gòu)的抗逆性，其中GSL5對于胼胝質(zhì)形成起至關(guān)重要的作用［16］;其它基因片段功能尚不清楚。另外，這些基因片段具體的生物反應(yīng)過程和定位至今尚未鑒定出來。到目前為止，支持植物合成胼胝質(zhì)起到調(diào)節(jié)作用的直接有力證據(jù)主要集中在花粉壁形成［15］和病害誘導(dǎo)［13，17］胼胝質(zhì)形成方面。而對于除擬南芥之外植物以及其它生物逆境條件下胼胝質(zhì)產(chǎn)生的生物化學(xué)機制、與信號傳導(dǎo)之間的關(guān)系等研究尚且不足。

另一方面，鋁脅迫誘導(dǎo)胼胝質(zhì)合成是植物鋁敏感性指標，可作為區(qū)分不同植物或品種間耐鋁性差別的可靠參數(shù)［18-22］。同時，胼胝質(zhì)形成可能在調(diào)節(jié)鋁毒害上有一定的積極意義。鋁脅迫下高等植物胼胝質(zhì)的聚集被認為是阻礙或減少鋁進一步貫穿質(zhì)外體的屏障［23］。Sivaguru等證明，鋁脅迫下在胞間連絲上形成胼胝質(zhì)可以有效地阻礙細胞間物質(zhì)轉(zhuǎn)運和信息傳遞，從而最大可能地降低鋁脅迫造成的影響［24］。Eticha等也認為，鋁誘導(dǎo)胼胝質(zhì)形成量提高是不同玉米品種更好地適應(yīng)酸性土壤上生長的一種有效方式，纖維素和胼胝質(zhì)空間結(jié)構(gòu)上的差異可能是調(diào)節(jié)它們功能的關(guān)鍵所在［21］。Buchanan等指出，不同于纖維素(1，4-β-D-葡聚糖)彼此之間平行排列的結(jié)構(gòu)，胼胝質(zhì)(1，3-β-D-葡聚糖)可以形成二級或三級螺旋的空間結(jié)構(gòu)［10］。然而鋁脅迫下誘導(dǎo)胼胝質(zhì)形成是否具有抗性意義至今尚無明確定論。

胡枝子作為酸性土壤上的先鋒植物，其耐鋁能力毋庸置疑。目前已知其耐性品種主要通過分泌有機酸、高效利用磷以應(yīng)對鋁脅迫［25-26］。鑒于胼胝質(zhì)形成是植物受到鋁脅迫后最為迅速的反應(yīng)之一，其形成也是植物對鋁脅迫產(chǎn)生抗性反應(yīng)的先端。同時，細胞壁組分變化可能是對鋁毒害的一種適應(yīng)機制，那么胡枝子在鋁脅迫下誘導(dǎo)胼胝質(zhì)形成和有機酸分泌之間是否存在對應(yīng)關(guān)系、胼胝質(zhì)形成是否可能具有一定的抗性作用、具體形成的受控因素，這些內(nèi)容的研究對于了解鋁脅迫下胡枝子響應(yīng)機制都是十分必要的。因此，本研究選取耐鋁性存在顯著差異的兩個胡枝子品種作為研究對象，探索鋁調(diào)控處理下，濃度、時間以及外加試劑(陰離子通道抑制劑、DDG、甘露醇等)對胼胝質(zhì)形成的作用機制，初步明確胼胝質(zhì)的形成變化規(guī)律，分析其在胡枝子耐鋁方面的生理作用以及與有機酸分泌之間的關(guān)系，為進一步開展鋁脅迫下，植物反應(yīng)和傷害機理提供一定理論參考依據(jù)。

1　材料與方法

1.1植物材料和生長條件

二色胡枝子和截葉胡枝子的種子預(yù)處理和催芽方法參見［27］。當幼芽長至2—3 cm時，移至盛有0.5 mmol/L CaCl2(pH 4.5)溶液的盆子中培養(yǎng)5—7 d后，兩個胡枝子品種都分別選取較為一致的幼苗進行鋁處理。所有試驗在光照培養(yǎng)室中進行，溫度為(25±2)℃，相對濕度為(65±5)%，光強為300 μmol光子m－2s－1，晝夜循環(huán)為光14 h/黑暗10 h。

1.2試驗設(shè)計

1.2.1不同濃度鋁處理下對胼胝質(zhì)形成的影響

試驗共設(shè)4個鋁處理濃度(pH 4.5)，分別為:含0、50、100和200 μmol/L AlCl3的0.5 mmol/L CaCl2溶液。幼苗經(jīng)不同濃度鋁處理24 h后，分別切取根尖(0—1.0 cm)10條待測。前期對鋁脅迫下兩個胡枝子品種相對根伸長、根尖鋁含量進行了測定并已發(fā)表［26，28］，此處僅測定根尖胼胝質(zhì)含量。

1.2.2鋁處理下不同根段胼胝質(zhì)的變化

幼苗用含50 μmol/L AlCl3的0.5 mmol/L CaCl2溶液(pH 4.5)處理24 h后，切取0—0.5，0.5—1.0，1.0—1.5，1.5—2.0 cm長的根段各20條。分別測定根段內(nèi)鋁含量和胼胝質(zhì)含量。

1.2.3胼胝質(zhì)形成隨時間的動態(tài)變化

用0.5 mmol/L CaCl2溶液配制成50 μmol/L鋁處理溶液(pH 4.5)，分別處理幼苗1、2、3、6、9、12、18、24 h后，切取根尖(0—1.0 cm)各20條待測。鋁處理24 h后，改用不含鋁的0.5 mmol/L CaCl2(pH 4.5)溶液繼續(xù)處理，不同時間點每個處理共切取3次。測定項目包括胼胝質(zhì)含量和根尖鋁含量。

1.2.4不同陰離子通道抑制劑對胼胝質(zhì)形成的影響

為了研究鋁脅迫下不同陰離子通道抑制劑對胼胝質(zhì)形成的影響。幼苗用含0或50 μmol/L AlCl3的0.5 mmol/L CaCl2溶液處理，試驗設(shè)加或不加10 μmol/L陰離子通道抑制劑［尼氟滅酸(niflumic acid，NIF)、苯甲酰甲醛(phenylglyoxal，PG)和蒽-9-羧酸(anthracene-9-carboxylic acid，A-9-C)］的不同處理。處理24 h后切取根尖(0—1.0 cm)10條，測定胼胝質(zhì)含量。

1.2.52-去氧-D-葡萄糖(DDG)和甘露醇(Mannitol，簡寫為Man.)對胼胝質(zhì)形成的影響

幼苗先用100 μmol/L DDG處理1 h，沖洗干凈，再用含0或50 μmol/L AlCl3的0.5 mmol/L CaCl2溶液(pH 4.5)處理24 h。50 mmol/L Man.則是直接和含0或50 μmol/L AlCl3的0.5 mmol/L CaCl2溶液(pH 4.5)混合后處理24 h。各處理結(jié)束后，切取根尖(0—1.0 cm)10條，測定胼胝質(zhì)含量。

1.2.6La對胼胝質(zhì)形成影響

為了驗證胼胝質(zhì)形成是否為鋁脅迫下的專性反應(yīng)，幼苗分別用含0、50 μmol/L AlCl3、50 μmol/L LaCl3和50 μmol/L AlCl3+LaCl3的0.5 mmol/L CaCl2溶液(pH 4.5)處理24 h。然后切取根尖(0—1.0 cm)10條，測定胼胝質(zhì)含量。

1.3測定項目與方法

1.3.1根尖Al含量測定

Al處理24 h后切取根尖(0—1.0 cm)，進行根尖總Al含量測定，測定方法參見［28］。每個處理重復(fù)3次。

1.3.2胼胝質(zhì)含量測定

胼胝質(zhì)含量測定方法參考Kohle等［29］，具體過程參見孫清斌等［27］。每個處理重復(fù)3次。

2　結(jié)果與分析

2.1兩個品種的相對根伸長率、根尖鋁含量和胼胝質(zhì)的形成

前期實驗表明，隨鋁處理濃度增加，兩個胡枝子品種的相對根伸長率均呈下降趨勢，根尖鋁含量則呈上升趨勢［26，28］。與之相對應(yīng)，根尖胼胝質(zhì)形成的量也是表現(xiàn)出較為明顯的增加趨勢(圖1)。說明植物吸收的鋁越多，根伸長受到抑制程度越大，根尖所形成的胼胝質(zhì)也增多。另外，不同濃度鋁處理下相對根伸長率都是二色胡枝子(耐性品種)高于截葉胡枝子(敏感品種)，根尖鋁含量則是耐性品種顯著小于敏感品種［26，28］，而胼胝質(zhì)形成量也有同樣的規(guī)律(圖1)，說明胼胝質(zhì)形成量與根尖鋁含量相對應(yīng)。

圖1　鋁處理對胡枝子根尖胼胝質(zhì)含量的影響Fig.1Effect of Al on callose content in root apices of Lespedeza plants，L.bicolor and L.cuneataSignificant differences between mean values are indicated by different letters at the P＜0.05 level(Tukey test);Data are means±SD

2.2不同根段胼胝質(zhì)形成和根尖鋁含量變化

圖2是鋁處理下兩個品種不同根段胼胝質(zhì)形成量和根尖鋁含量的結(jié)果。由圖可知，不同根段胼胝質(zhì)的形成量與根尖鋁含量是正相關(guān)的;敏感品種根尖鋁和胼胝質(zhì)的含量是0—0.5 cm段顯著高于其它根段，耐性品種也有較明顯的降低趨勢，說明此段是鋁作用的主要部位;對比品種間差別，發(fā)現(xiàn)根段0.5—2.0 cm內(nèi)品種間無顯著差別，差別主要在于0—0.5 cm處，說明品種間耐鋁的差別主?要體現(xiàn)在根尖0—0.5 cm處，其它部位差別不大。

圖2　不同根段下胼胝質(zhì)形成和根尖鋁分布規(guī)律Fig.2Callose content and Al content in apical root segments of two Lespedeza speciesSignificant differences between mean values are indicated by different letters at the P＜0.05 level(Tukey test);Error bars represent±SD(n=3)

2.3根尖鋁含量和胼胝質(zhì)形成動態(tài)變化

為了探索胼胝質(zhì)形成隨時間的動態(tài)變化規(guī)律，做了50 μmol/L鋁處理24 h內(nèi)和之后12 h不加鋁處理下，兩個品種根尖鋁含量和胼胝質(zhì)形成的變化規(guī)律(圖3)。結(jié)果表明，50 μmol/L鋁處理下，隨時間變化兩個品種根尖鋁含量都是逐漸增加的，但前12 h內(nèi)，品種間無統(tǒng)計上的差異，之后敏感品種顯著高于耐性品種(圖3)。說明兩個品種對鋁的吸附或吸收能力存在一定的差異。鋁處理24 h后再用0.5 mmol/L CaCl2處理，發(fā)現(xiàn)隨時間推移，兩個品種根尖鋁含量都在逐漸降低，耐性品種緩慢下降，敏感品種則是迅速下降后保持不變(圖3)。說明仍有相當一部分鋁依然牢固的吸附于根部組織上。與之相對應(yīng)胼胝質(zhì)的形成變化規(guī)律是:鋁脅迫下，敏感品種胼胝質(zhì)形成同鋁吸收趨勢比較吻合，耐性品種則在鋁處理6 h時出現(xiàn)一個峰值隨后下降。鑒于以往結(jié)果，鋁脅迫下敏感品種不分泌任何有機酸，耐性品種大量分泌檸檬酸和蘋果酸，鋁處理3 h后開始分泌，9 h時達最大值［25］，說明胼胝質(zhì)的形成可能與有機酸的分泌存在一定的協(xié)調(diào)關(guān)系。24 h后去除鋁脅迫耐性品種胼胝質(zhì)的形成量并不顯著減少(圖3)，則印證了仍有相當一部分鋁存在于細胞壁上的結(jié)果，從而使得根尖繼續(xù)產(chǎn)生胼胝質(zhì)。

2.4陰離子通道抑制劑對胼胝質(zhì)形成的影響

鋁脅迫下有機酸是通過陰離子通道分泌出來，因此我們也探索了鋁與陰離子通道抑制劑脅迫下胼胝質(zhì)的形成狀況。結(jié)果顯示，鋁與陰離子通道抑制劑同時作用下，誘導(dǎo)胼胝質(zhì)形成的影響與僅用鋁脅迫相比存在差別(圖4)，說明存在于原生質(zhì)膜上的陰離子通道可能參與了胼胝質(zhì)的形成。同單獨加鋁處理相比PG+Al處理對兩個品種胼胝質(zhì)形成的無影響;NIF+Al處理抑制敏感品種胼胝質(zhì)的形成，對耐性無影響;A-9-C+Al處理顯著抑制兩個品種胼胝質(zhì)的形成。說明不同陰離子通道抑制劑對有機酸分泌的抑制機制存在差別，從而直接影響胼胝質(zhì)的形成。

圖4　不同陰離子通道抑制劑處理下胡枝子根尖胼胝質(zhì)含量Fig.4Effects of anion-hannel inhibitors on callose content in the root apices of two Lespedeza speciesSignificant differences between mean values are indicated by different letters at the P＜0.05 level(Tukey test);Error bars represent±SD (n=3)

2.5DDG與甘露醇對兩個胡枝子品種胼胝質(zhì)形成的影響

DDG被認為是胼胝質(zhì)合成酶的抑制劑，用DDG處理之后，胼胝質(zhì)的形成應(yīng)該減少。本試驗結(jié)果顯示，DDG+Al處理與單獨鋁處理相比，敏感品種的胼胝質(zhì)形成量顯著降低，耐性品種盡管也有降低趨勢，但無統(tǒng)計差別(圖5)。說明在外加干擾劑(DDG)作用下，面對逆境耐性品種表現(xiàn)出較強的穩(wěn)定性。另外，甘露醇是一種維持滲透壓平衡的化學(xué)試劑。有研究表明，鋁脅迫可改變細胞的滲透壓［4］。結(jié)果顯示，它對兩個品種胼胝質(zhì)形成的影響無顯著差別(圖5)。對比品種間差別發(fā)現(xiàn)，兩種試劑(DDG和甘露醇)加鋁對耐性品種胼胝質(zhì)形成的影響同單獨加鋁處理無差異，說明面對鋁脅迫所造成的逆境，耐性品種表現(xiàn)出的穩(wěn)定性強于敏感品種。

圖3　不同鋁處理下胡枝子根尖鋁含量和胼胝質(zhì)含量動態(tài)變化Fig.3Kinetic course of Al content and callose content in apical root segments of two Lespedeza species Error bars represent±SD(n=3)

圖5　DDG與甘露醇對胡枝子根尖胼胝質(zhì)含量的影響(DDG:2-去氧-D-葡萄糖;Man:甘露醇)Fig.5　Effects of Al(50 μmol/L)，DDG(100μmol/L)and mannitol(50 mmol/L)application on callose content in the root apice of two Lespedeza speciesSignificant differences between mean values are indicated by different letters at the P＜0.05 level(Tukey test);Error bars represent±SD(n =3)

2.6鑭對胼胝質(zhì)形成影響

鑭通常被用來鑒定某些生理反應(yīng)是否為鋁脅迫下的專性反應(yīng)，如鑭可阻塞Ca2+通道，抑制有機酸釋放，從而被認為鋁脅迫下的專性反應(yīng)［25］。本試驗結(jié)果顯示，鑭單獨處理也能大量誘導(dǎo)胼胝質(zhì)的形成(圖6)，說明植物合成胼胝質(zhì)并非鋁脅迫下的專性反應(yīng);誘導(dǎo)胼胝質(zhì)形成過程中除了Ca2+信號通道參與之外，還應(yīng)該可能有其他信號傳導(dǎo)物質(zhì)參與其中。另外，單獨鑭處理下胼胝質(zhì)的形成是耐性品種顯著高于敏感品種，Al+La處理更是顯著高于其它處理，說明在鋁毒害下鑭抑制有機酸釋放時，鑭、鋁同時處理，其毒害效應(yīng)有疊加趨勢。結(jié)合敏感品種各處理結(jié)果，除單獨加鋁處理之外，相比耐性品種+La處理(單獨或混合)胼胝質(zhì)形成均顯著降低，說明胼胝質(zhì)的形成可能有一定的抗性意義。

圖6　鋁、鑭對胡枝子根尖胼胝質(zhì)含量的影響Fig.6Effects of Al and La treatments on callose content in the root apex of two Lespedeza speciesSignificant differences between mean values are indicated by different letters at the P＜0.05 level(Tukey test);Error bars represent±SD (n=3)

3　討論

3.1鋁脅迫下胼胝質(zhì)形成和有機酸分泌的關(guān)系

鋁脅迫下不同植物都會有相應(yīng)的應(yīng)對機制。耐鋁機制以外排為主的植物中，分泌有機酸是其最主要的途徑之一。根據(jù)鋁脅迫與有機酸分泌的響應(yīng)時間差，有機酸分泌分兩種模式，Ⅰ類模式:植物可迅速對鋁脅迫做出反應(yīng)，在數(shù)十分鐘內(nèi)即可大量釋放出有機酸;Ⅱ類模式:植物存在明顯的滯后效應(yīng)，一般需數(shù)小時后才有明顯的有機酸分泌［30］。本課題組以往研究表明，耐性胡枝子品種鋁處理3 h后才開始分泌有機酸，9 h達到最大值［25］，存在明顯的滯后效應(yīng)，其分泌模式應(yīng)屬于II類模式。通常認為，Ⅰ類有機酸分泌模式可能與質(zhì)膜陰離子通道被激活有關(guān)，Ⅱ類分泌模式則可能與耐性基因的誘導(dǎo)有關(guān)［31］。楊建立進一步認為，誘導(dǎo)的基因可能與有機酸的代謝，細胞膜或液泡膜上離子通道的開閉，線粒體膜上的有機酸的運輸?shù)冗^程相關(guān)聯(lián)［32］。因此，鋁脅迫下胡枝子分泌有機酸過程應(yīng)該與基因誘導(dǎo)有關(guān)，其分泌過程也是較為復(fù)雜的。

通過分析兩個品種根尖胼胝質(zhì)形成的動態(tài)結(jié)果發(fā)現(xiàn):耐性品種根尖鋁吸收同胼胝質(zhì)形成之間具有非同步性，鋁脅迫下6 h時胼胝質(zhì)形成出現(xiàn)一個峰值(圖3)，此時恰處于有機酸分泌量逐漸增加過程。二者結(jié)合起來分析，可推斷為由于有機酸的分泌，降低了鋁毒害效應(yīng)，從而可能減少了胼胝質(zhì)的形成。將鋁脅迫下陰離子通道抑制劑對胡枝子有機酸分泌［25］和胼胝質(zhì)形成(圖4)的結(jié)果結(jié)合起來分析發(fā)現(xiàn)，PG對有機酸分泌無影響，也不影響Al脅迫下胼胝質(zhì)的形成;NIF可以刺激檸檬酸分泌(達7倍之多)，對蘋果酸無影響(但有機酸分泌總量增加)，從而減少胼胝質(zhì)形成(敏感差異顯著，耐性差異有降低趨勢);A-9-C在完全抑制有機酸分泌的同時也顯著抑制了胼胝質(zhì)形成。PG與NIF對兩者間的作用結(jié)果比較容易理解，A-9-C的結(jié)果可解釋為由于對植物傷害較大，直接破壞了細胞的正常調(diào)節(jié)作用［25］。因此，鋁脅迫下誘導(dǎo)有機酸釋放和胼胝質(zhì)形成之間可能有著共同的調(diào)控因子。

另外，胼胝質(zhì)形成的專性鑒定結(jié)果也進一步說明了胼胝質(zhì)形成過程可能受到有機酸釋放的影響。鑭作為一種金屬陽離子，通常被認為是Ca通道抑制劑，在微摩爾濃度下也會限制植物根系生長［33］。單獨La處理耐性胡枝子品種不分泌任何有機酸(檸檬酸和蘋果酸)［25］，但胼胝質(zhì)形成量高于敏感品種，這就說明了無有機酸釋放，耐性品種受到傷害時，形成的胼胝質(zhì)更多。Al+La處理顯著降低了耐性品種有機酸(蘋果酸)釋放［25］，從而形成胼胝質(zhì)的量高于敏感品種。此結(jié)果從另一方面也說明有機酸釋放與胼胝質(zhì)形成可能存在共同的調(diào)控機制。

因此，胼胝質(zhì)形成和有機酸分泌可能存在相互協(xié)調(diào)的關(guān)系。關(guān)于胼胝質(zhì)形成［34］和有機酸分泌［32］的生理調(diào)節(jié)過程都有相應(yīng)報道。Ma等認為，鋁脅迫下有機酸分泌的滯后現(xiàn)象與誘導(dǎo)基因表達和蛋白質(zhì)合成有關(guān)［35］。楊建立推測:鋁首先激活某些基因，然后這些基因編碼有機酸載體和陰離子通道蛋白合成，由此開始有機酸的分泌［32］。信號傳導(dǎo)是基因誘導(dǎo)的前提，Ca2+濃度的瞬間變化在植物信號傳導(dǎo)系統(tǒng)中被認為占主導(dǎo)因素［36］。因此，誘導(dǎo)有機酸的分泌過程也可能有Ca2+的參與調(diào)節(jié)?，F(xiàn)在認為胼胝質(zhì)合成可能是由于鋁毒害作用，引起膜內(nèi)外電壓發(fā)生變化，誘導(dǎo)膜的超極化，通過Ca通道形成一個瞬間Ca流［37］，誘導(dǎo)細胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度提高，使得蛋白酶激活胼胝質(zhì)合成酶，增加胼胝質(zhì)在細胞壁形成的量［38］。因而可以認為，兩個生理反應(yīng)過程可能同時是因為鋁誘導(dǎo)細胞內(nèi)［Ca2+］變化，一方面蛋白激酶激活，誘導(dǎo)胼胝質(zhì)迅速合成，同時激活調(diào)控有機酸分泌的基因，一旦此過程完成，即刻開始大量分泌有機酸，相應(yīng)的蛋白激酶進一步調(diào)控減少耐性品種胼胝質(zhì)的形成。當然調(diào)控兩個過程中某些步驟的蛋白也可能是由細胞核內(nèi)又重新合成的。同時，鑭處理阻塞Ca通道，抑制耐性胡枝子有機酸分泌［25］，不影響其形成胼胝質(zhì)(圖6)，表明逆境條件下原生質(zhì)體內(nèi)［Ca2+］變化與調(diào)控有機酸分泌生理過程關(guān)系更加密切，原生質(zhì)體內(nèi)［Ca2+］降低(波動)也可能是誘導(dǎo)胼胝質(zhì)形成的另一信號因子。當然，其信號傳導(dǎo)也可能不只是由于［Ca2+］簡單變化引起的，還可能是由其它信號傳導(dǎo)物質(zhì)參與其中的(如IP3等)。另外，質(zhì)膜上面也可能存在直接誘導(dǎo)蛋白激酶啟動的膜受體［10］。此外，Bhuja等認為，胼胝質(zhì)的形成并不是簡單地由Ca2+的變化所引起的，應(yīng)該還包含其它調(diào)節(jié)因素［2］。由此可見，由蛋白激酶和Ca2+參與的信號傳導(dǎo)途徑是一個極為復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)，鋁脅迫下細胞如何調(diào)控兩個生理過程尚有待于進一步的實驗證據(jù)支撐。

3.2胼胝質(zhì)的形成僅僅是鋁脅迫下的毒害指標

細胞壁作為植物與外界環(huán)境的第一道屏障，參與體內(nèi)外一系列代謝活動，在抵抗逆境方面有著獨特的作用。細胞壁是植物細胞區(qū)域劃分中質(zhì)外體的主要組成部分，鋁存在具有改變質(zhì)外體結(jié)構(gòu)和功能的潛力［34］。鋁脅迫下將會使得正常代謝的纖維素合成酶受阻，胼胝質(zhì)合成酶啟動，誘導(dǎo)胼胝質(zhì)形成［34］。胡枝子的耐鋁機制以外排為主［25］，根尖所積聚的鋁越少，則說明該品種耐鋁性越強。前期實驗結(jié)果與本文數(shù)據(jù)也印證了此觀點，即耐性品種根尖鋁含量［26］、胼胝質(zhì)形成量都較低，且隨鋁濃度的增加，胼胝質(zhì)形成量也隨之增加(圖1，圖2)。這些數(shù)據(jù)表明，將胼胝質(zhì)形成定義為鋁脅迫下的毒害指標應(yīng)該是正確的。

根尖通常被認為是鋁作用的主要部位，有機酸也主要在這一段分泌［39-40］。本實驗結(jié)果也同樣支持該觀點，不同品種根段只有根尖0—0.5 cm處存在顯著差別(圖2)。Zheng和Yang認為，根尖部細胞活性越強，鋁所產(chǎn)生的毒害越強［41］，那么毒害越強的部位是不是更加需要有相應(yīng)的抵抗機制?因此，鋁脅迫下胼胝質(zhì)形成除了說明其是毒害指標之外，是否還具有抵抗鋁毒害的作用?這似乎也是一個很讓人產(chǎn)生興趣的課題，本試驗鑭處理結(jié)果也直接支持這樣的觀點。鑭也是一種毒害元素，也能誘導(dǎo)大量胼胝質(zhì)形成。由于鑭抑制耐性品種有機酸的釋放，所形成胼胝質(zhì)的量顯著高于敏感品種相應(yīng)的處理(圖6)，表明胼胝質(zhì)形成可能也是面對脅迫環(huán)境的一種抗性反應(yīng)。另外，鋁處理下加入DDG，同敏感品種相比耐性品種依然表現(xiàn)出較強穩(wěn)定性(胼胝質(zhì)形成量不減)(圖5)。結(jié)合上面3.1討論內(nèi)容，鋁脅迫下有機酸分泌和胼胝質(zhì)形成可能存在共同調(diào)節(jié)機制，有機酸分泌前期有大量胼胝質(zhì)形成且耐性品種高于敏感品種的事實，也再次表明鋁脅迫下胼胝質(zhì)形成可能并不僅僅是簡單的毒害指標。以往也有報道認為，鋁脅迫下胼胝質(zhì)的聚集被認為是對植物抵抗逆境脅迫有著積極的作用［21，23-24］。Hossain等指出，胼胝質(zhì)合成的增加，誘導(dǎo)半纖維素合成的增加，從而提高細胞壁的剛性，達到抵抗逆境的作用，從而認為，合成半纖維素的前體物質(zhì)主要是胼胝質(zhì)［42］。同時，近年來有多篇文獻報道了胼胝質(zhì)在植物抵御病害方面有著重要意義［13-17］。盡管如此，對于胼胝質(zhì)在抵抗鋁脅迫作用方面的研究還是很欠缺的。Zheng和Yang認為，鋁脅迫下胼胝質(zhì)的形成是一種保護反應(yīng)、還是一種簡單的傷害作用、甚至是一種無害的反應(yīng)都是尚無定論的［41］。因此，進一步深入研究以確定胼胝質(zhì)的真正生理作用是很有必要的。

3.3鋁脅迫下胼胝質(zhì)形成的可能受控因素

由于鋁毒害的產(chǎn)生實際上是一系列的傷害，植物對其抗性反應(yīng)也是多重的。胼胝質(zhì)形成被認為鋁脅迫下是一個快速而又敏感的生理反應(yīng)，數(shù)分鐘內(nèi)纖維素合成酶完全失活，胼胝質(zhì)大量形成［12］。由于該反應(yīng)經(jīng)歷時間極短，其形成應(yīng)該是鋁處理濃度的高低，持續(xù)時間的長短都會影響。本試驗數(shù)據(jù)印證了胼胝質(zhì)的形成受鋁毒害濃度高低(圖1)、時間長短(圖3)的影響。另外，通過上面討論La對胼胝質(zhì)形成的影響發(fā)現(xiàn)胼胝質(zhì)形成可能受控于信號傳導(dǎo)物質(zhì)［Ca2+］參與。結(jié)合陰離子通道抑制劑結(jié)果分析證明，胼胝質(zhì)形成的調(diào)控過程可能也有陰離子通道的參與。以往對耐性品種分泌有機酸的研究表明，A-9-C抑制兩種有機酸分泌［25］。本試驗結(jié)果顯示，A-9-C完全抑制有機酸分泌的同時也顯著降低了胼胝質(zhì)形成(圖4)，這A-9-C可能是對植物傷害較大，直接破壞了細胞的正常調(diào)節(jié)作用［25］，從而說明胼胝質(zhì)的形成可能受有機酸釋放的調(diào)控。

除此之外，胼胝質(zhì)形成也受到細胞膨壓所調(diào)控。甘露醇預(yù)處理可以降低鋁脅迫下的膨壓，增加細胞間空隙，從而便于可溶性物質(zhì)在質(zhì)外體的運輸［4］。本試驗結(jié)果顯示，甘露醇的加入有降低敏感品種胼胝質(zhì)形成的趨勢(圖5)。因此，盡管甘露醇的加入并不一定能夠緩解鋁對共質(zhì)體的毒害，但是由于其可以維持質(zhì)外體正?？臻g結(jié)構(gòu)，從而可以減少胼胝質(zhì)的形成。由于胼胝質(zhì)合成是由胼胝質(zhì)合成酶來完成的，那么底物多少將直接決定胼胝質(zhì)的合成量。DDG被認為是參與UDPG和GDPG的代謝過程，可以限制寡糖脂鍵的生物合成，從而限制蛋白糖基化，最終限制胼胝質(zhì)的形成［43］。本試驗結(jié)果也顯示，DDG處理顯著降低敏感品種胼胝質(zhì)的合成(圖6)。因此，DDG和甘露醇處理胼胝質(zhì)的合成表觀效果類似，但實際上并不一定降低鋁產(chǎn)生的毒害，原因在于它們的作用機制確實有著本質(zhì)上的差異。當然，除了上述幾種因素之外，胼胝質(zhì)的形成還可能受到其它多種因素的調(diào)節(jié)作用。

4　結(jié)論

耐性品種在鋁脅迫下胼胝質(zhì)形成與有機酸分泌可能存在一定的協(xié)調(diào)關(guān)系;胼胝質(zhì)形成是植物鋁脅迫下敏感指標;在一定條件下，特別是有機酸分泌前可能會發(fā)揮一定的抗性作用;鋁誘導(dǎo)胼胝質(zhì)的形成受多種外界因素(濃度、時間、有機酸分泌，滲透壓平衡等)影響。

參考文獻(References):

［1］Horst W J，Kollmeier M，Schmohl N，Sivaguru M，Wang Y，F(xiàn)elle H H，Hedrich R，Schr?der W，StaA.Significance of the root apoplast for aluminium toxicity and resistance of maize//Sattelmacher B，Horst W J，eds.The Apoplast of Higher Plants:Compartment of Storage，Transport and Reactions.Heidelberg:Springer，2007:49-66.

［2］Bhuja P，McLachlan K，Stephens J，Taylor G.Accumulation of 1，3--D-glucans，in response to aluminum and cytosolic calcium in Triticum aestivum.Plant＆Cell Physiology，2004，45(5):543-549.

［3］Grignon C，Sentenac H.pH and ionic conditions in the apoplast.Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology，1991，42:103-128.

［4］Sivaguru M，Eticha D，Horst WJ，Matsumoto H.Aluminum inhibits apoplastic flow of high-molecular weight solutes in root apices of Zea mays L.Journal of Plant Nutrition and Soil Science，2006，169(5):679-690.

［5］Horst W J.The role of the apoplast in aluminium toxicity and resistance of higher plants:a review.Zeitschrift für Pflanzenern?hrung und Bodenkunde，1995，158(5):419-428.

［6］Kochian L V.Cellular mechanisms of aluminum toxicity and resistance in plants.Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology，1995，46:237-260.

［7］Taylor G J.Overcoming barriers to understanding the cellular basis of aluminium resistance.Plant and Soil，1995，171(1):89-103.

［8］Wissemeier A H，Klotz F，Horst W J.Aluminium induced callose synthesis in roots of soybean(Glycine max L.).Journal of Plant Physiology，1987，129(5):487-492.

［9］Kudlicka K，Brown R M.Cellulose and callose biosynthesis in higher plants I.Solubilization and separation of(1→3)-and(1→4)-β-glucan synthase activities from mung bean.Plant Physiology，1997，115(2):643-656.

［10］Buchana B B，Gruissem W，Jones R L.Biochemistry＆Molecular Biology of Plants.Rockville，MD:American Society of Plant Physiologists，2000.

［11］Delmer D P.Cellulose biosynthesis.Annual Review of Plant Physiology，1987，38:259-290.

［12］Nakashima J，Laosinchai W，Cui X J，Brown R M.New insight into the mechanism of cellulose and callose biosynthesis:proteases may regulate callose biosynthesis upon wounding.Cellulose，2003，10(4):369-389.

［13］Voigt C A.Callose-mediated resistance to pathogenic intruders in plant defense-related papillae.Frontier in Plant Science，2014，5(168):1-5.

［14］Chen X Y，Kim J Y.Callose synthesis in higher plants.Plant Signaling and Behavior，2009，4(6):489-492.

［15］Ellinger D，Voigt C A.Callose biosynthesis in arabidopsis with a focus on pathogen response:what we have learned within the last decade.Annals of Botany，2014，114(6):1349-1358.

［16］Maeda H，Song W，Sage T，Penna D D.Role of callose synthases in transfer cell wall development in tocopherol deficient Arabidopsis mutants.Frontier in Plant Science，2014，5(46):1-15.

［17］Ellinger D，Naumann M，F(xiàn)alter C，Zwikowics C，Jamrow T，Manisseri C，Somerville S C，Voigt C A.Elevated early callose deposition results in complete penetration resistance to powdery mildew in Arabidopsis.Plant Physiology，2013，161(3):1433-1444.

［18］Wissemeier A H，Diening A，Hergenroder A，Horst W J，Mix-Wagner G.Callose formation as parameter for assessing genotypical plant tolerance of aluminium and manganese.Plant and Soil，1992，146(1/2):67-75.

［19］Horst W J，Püschel A K，Schmohl N.Induction of callose formation is a sensitive marker for genotypic aluminium sensitivity in maize.Plant and Soil，1997，192(1):23-30.

［20］Massot N，Llugany M，Poschenrieder C，Barcelo J.Callose production as indicator of aluminum toxicity in bean cultivars.Journal of Plant Nutrition，1999，22(1):1-10.

［21］Eticha D，Thé C，Welcker C，Narro L，StaA，Horst W J.Aluminium-induced callose formation in root apices:Inheritance and selection trait for adaptation of tropical maize to acid soils.Field Crops Research，2005，93(2/3):252-263.

［22］Rangel A F，Mobin M，Rao I M，Horst W J.Proton toxicity interferes with the screening of common bean(Phaseolus.vulgaris L.)genotypes for aluminium resistance in nutrient solution.Journal of Plant Nutrition and Soil Science，2005，168(4):607-616.

［23］Marschner H.Mechanisms of adaptation of plants to acid soils.Plant and Soil，1991，134(1):1-20.

［24］Sivaguru M，F(xiàn)ujiwara T，?amaj J，Balu?ka F，Yang Z M，Osawa H，Maeda T，Mori T，Volkmann D，Matsumoto H.Aluminum induced 1，3→β-D-glucan inhibits cell-to-cell trafficking of molecules through plasmodesmata.A new mechanism of aluminum toxicity in plants.Plant Physiology，2000，124(3):991-1005.

［25］Dong X Y，Shen R F，Chen R F，Zhu Z L，Ma J F.Secretion of malate and citrate from roots is related to high Al-resistance in Lespedeza bicolor.Plant and Soil，2008，306(1-2):139-147.

［26］Sun Q B，Shen R F，Zhao X Q，Chen R F.Phosphorus enhances Al resistance in Al-resistant Lespedeza bicolor but not in Al-sensitive L.cuneata under relatively high Al stress.Annals of Botany，2008，102(5):795-804.

［27］孫清斌，沈仁芳，趙學(xué)強.不同參數(shù)評價植物耐鋁性的研究.植物營養(yǎng)與肥料學(xué)報，2008，14(5):1017-1022.

［28］孫清斌，沈仁芳，趙學(xué)強.顯微技術(shù)在植物Al毒研究中的應(yīng)用.土壤學(xué)報，2009，46(6):1026-1032.

［29］K?hle H，JeblickW，Poten F，Blaschek W，Kauss H.Chitosan-elicited callose synthesis in soybean cells as a Ca2+-dependent process.Plant Physiology，1985，77(3):544-551.

［30］Ma J F.Role of organic acids in detoxification of aluminum in higher plants.Plant＆Cell Physiology，2000，44(4):383-390.

［31］沈仁芳.鋁在土壤-植物中的行為及植物的適應(yīng)機制.北京:科學(xué)出版社.2008.

［32］楊建立.植物耐鋁的分子生理機理［D］.杭州:浙江大學(xué)，2007.

［33］Ryan P R，DiTomaso J M，Kochian L V.Aluminium toxicity in roots:an investigation of spatial sensitivity and the role of the root cap.Journal of Experimental Botany，1993，44(2):437-446.

［34］孫清斌，沈仁芳，尹春芹，趙學(xué)強.鋁毒脅迫下植物的響應(yīng)機制.土壤，2008，40(5):691-697.

［35］Ma J F，Ryan P R，Delhaize E.Aluminium tolerance in plants and the complexing role of organic acids.Trends in Plant Science，2001，6(1): 273-278.

［36］Sivaguru M，Pike S，Gassmann W，Baskin T I.Aluminum rapidly depolymerizes cortical microtubules and depolarizes the plasma membrane: evidence that these responses are mediated by a glutamate receptor.Plant＆Cell Physiology，2003，44(7):667-675.

［37］Rengel Z，Zhang W H.Role of dynamics of intracellular calcium in aluminium-toxicity syndrome.New Phytologist，2003，159(2):295-314.

［38］Fox T C，Guerinot M L.Molecular biology of cation transport in plants.Annual Review of Plant Physiology and Plant Molecular Biology，1998，49: 669-696.

［39］Delhaize E，Ryan P R.Aluminum toxicity and tolerance in plants.Plant Physiology，1995，107(2):315-321.

［40］Sivaguru M，Horst W J.The distal part of the transition zone is the most aluminum-sensitive apical root zone of maize.Plant Physiology，1998，116 (1):155-163.

［41］Zheng S J，Yang J L.Target sites of aluminum phytotoxicity.Biologia Plantarum，2005，49(3):321-331.

［42］Hossain A K M Z.Hossain M A，Asgar M A，Tosaki T，Koyama H，Hara T.Changes in cell wall polysaccharides and hydroxycinnamates in wheat roots by aluminum stress at higher calcium supply.Journal of Plant Nutrition，2006，29(4):601-613.

［43］Datema R，Schwarz R T，Rivas L A，Lezica R P.Inhibition of β-1，4-glucan biosynthesis by deoxyglucose.Plant Physiology，1983，71(1): 76-81.

Analysis of variations in and factors affecting callose formation in response to al stress in Lespedeza Root Tips

SUN Qingbin1，2，SHEN Renfang1，*，YIN Chunqin2，ZHAO Xueqiang1
1 State Key Laboratory of Soil and Sustainable Agriculture，Institute of Soil Science，Chinese Academy of Sciences，Nanjing 210008，China
2 College of Environmental Science and Engineering，Hubei Institute of Technology，Huangshi 435003，China

Abstract:Lespedeza speices can grow very well in infertile acidic soils as native pioneer plants.The reasons why such plants are well adapted to these soils might be due to a combination of mechanisms.Al toxicity is the primary factor limiting plant growth in acidic soils.Our previous results indicated that secretion of malate and citrate from roots was related to the high Al-resistance of Lespedeza.The objective of this study was to investigate the formation of callose under Al stress and its regulating factors in two Lespedeza species with different Al resistance，and attempted to explore the relative role of callose formation and organic acid exudation in Al toxicity or resistance of Lespedeza.The results showed that increased Al uptake was associated with increased callose formation in both Lespedeza species.The differences in Al tolerance between the two species were mainly expressed at the root apical 0—0.5 cm.Moreover，the callose formation was similar to root Al uptake for Al－sensitive species，but not for Al-tolerant species，of which callose formation peaked at 6 h of Al treatment and thenbook=1074,ebook=186decreased.Callose formation of the tolerant species was not obviously reduced following removal of Al from the culture.Furthermore，no obvious differences in callose formation were observed under treatment with PG(phenylglyoxal，anionchannel inhibitor)plus Al as compared to Al treatment alone in both species.NIF(niflumic acid，anion-channel inhibitor) plus Al treatment inhibited callose formation in the Al-sensitive species，but not in the Al-tolerant species.Callose formation was inhibited by A-9-C(9-anthracene carboxylic acid，anion-channel inhibitor)plus Al treatment in both species.Compared with Al treatment alone，DDG plus Al treatment caused a significant reduction in callose formation in the Alsensitive species but not in the Al-tolerant species.No differences in callose formation were observed for both species following mannitol treatment.Callose formation in response to La treatment was significantly higher in the Al-tolerant species than in the Al-sensitive species and was still higher following treatment with both Al and La.However，no differences in callose formation in Al-sensitive species were detected among treatments.In summary，callose synthesis may be regulated in conjunction with organic acid exudation.Callose formation may be a sensitive indicator of Al stress and may also function in Al tolerance before organic acids are secreted from roots.Finally，callose formation may be dependent on many factors，including Al concentration，treatment time，organic acid exudation，and osmotic pressure.Further studies are required to examine these additional factors to determine the complex mechanisms mediating callose formation.

Key Words:Lespedeza;Al stress;callose;organic acids

*通訊作者

Corresponding author.E-mail:rfshen@issas.ac.cn

收稿日期:2014-06-09;網(wǎng)絡(luò)出版日期:2015-07-09

基金項目:土壤與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展國家重點實驗室開放基金課題(0812201225);湖北省自然基金面上項目(2014CFC1089);湖北省礦區(qū)環(huán)境污染控制與修復(fù)重點實驗室開放基金(2013104);湖北理工學(xué)院引進人才項目(10yjz04R);國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃項目(973項目) (2014CB441000)

DOI:10.5846/stxb201406091185