譚才鄧，王文文，朱美娟，廖延智，姚勇芳

(廣東輕工職業(yè)技術學院，廣東 廣州, 510300)

?

1株耐高溫高鹽生香酵母的選育及特性分析

譚才鄧，王文文，朱美娟，廖延智，姚勇芳*

(廣東輕工職業(yè)技術學院，廣東 廣州, 510300)

摘要以豆瓣醬為材料篩選出86株產酯菌，以期從中得到1株耐高溫高鹽生香酵母菌。通過耐高溫、耐高鹽和產酯能力試驗，獲得1株耐高溫高鹽生香酵母菌PX-8，其在溫度高達40 ℃和NaCl質量濃度高達180 g/L的條件下能正常生長。經過26S rDNA鑒定，確定菌株PX-8為魯氏結合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)。經過產酯發(fā)酵條件優(yōu)化試驗，菌株PX-8的最佳產酯培養(yǎng)條件為：葡萄糖80 g/L，酵母粉40 g/L，KH2PO4 1 g/L，MgSO4 0.5 g/L，pH 6.0，32 ℃，150 r/min，發(fā)酵培養(yǎng)6 d，總酯產量高達2.615 g/L；在高溫高鹽條件下(發(fā)酵培養(yǎng)溫度為40 ℃，鹽質量濃度為180 g/L)，發(fā)酵培養(yǎng)21 d，總酯產量可達1.518 g/L。

關鍵詞耐高溫；耐鹽；酵母；產酯

耐鹽生香酵母主要應用于醬油的生產，由于其能夠生產酯類、醇類等風味物質，故對醬油的品質有很大的影響。目前低鹽固態(tài)醬油占我國醬油生產總量的70%以上[1]，低鹽固態(tài)發(fā)酵的特點主要是生產周期短、工藝成熟、投資規(guī)模要求較小等，但缺點是由于發(fā)酵溫度較高，發(fā)酵過程中除米曲霉外的有益微生物含量較低，使得醬油的色香味較差[1-3]。在已有的報道中，用于醬油生產的耐鹽產酯酵母主要有：魯氏酵母(Zygosaccharomycesrouxii)、蒙奇球擬酵母(Torulopsismogii)、埃契氏球擬酵母(Torulopsisetchellsii)、易變球擬酵母(Torulopsisutilis)等[4-5]，它們在發(fā)酵過程中產生的風味物質有酯類、醇類、醛類、酚類、有機酸、糠醛類、呋喃酮類等[4-6]。另有研究表明，魯氏酵母的谷氨酰胺酶還能轉化底物生成谷氨酸從而增強醬油的鮮味[7]。

目前關于耐鹽酵母種質資源的報道較多，如閆美[8]在辣椒醬中篩選出了1株耐鹽性達240 g/L的魯氏酵母，王春玲等[9]通過原生質體融合的方法篩選出一株耐鹽性高于180 g/L的釀酒酵母，都有效提高了乙酸乙酯、乳酸乙酯等風味物質的含量，但關于耐高溫高鹽酵母的研究鮮見報道。在低鹽固態(tài)醬油的生產過程中，有高溫的發(fā)酵階段，因而一般添加生香酵母只能在后發(fā)酵階段，這樣會導致酵母發(fā)酵時間不夠長，醬油的整體品質提不上來。本試驗旨在篩選出一株耐高溫高鹽的生香酵母，為醬油的低鹽固態(tài)發(fā)酵生產提供種質資源參考。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1篩選材料

四川郫縣豆瓣醬，市售。

1.1.2培養(yǎng)基

富集培養(yǎng)基：酵母粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，NaCl 180 g/L，氯霉素0.1 g/L，pH6.0。

產酯篩選培養(yǎng)基：酵母粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂粉20 g/L，氯霉素0.1 g/L，溴甲酚紫0.05 g/L，吐溫-80 5 mL /L，三乙酸甘油酯30 mL/L(滅菌后加入)，pH 7.2。

YPD(平板、斜面)培養(yǎng)基：酵母粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，氯霉素0.1 g/L，瓊脂粉20 g/L，pH6.0。

基礎發(fā)酵培養(yǎng)基：酵母粉10 g/L，蛋白胨20 g/L，葡萄糖20 g/L，KH2PO41 g/L，MgSO40.5 g/L，pH 6.0。

1.2方法

1.2.1菌株富集培養(yǎng)與分離篩選

稱取10 g左右的樣品，接入200 mL富集培養(yǎng)基，40 ℃靜置培養(yǎng)7 d。在無菌條件下，對富集液進行梯度稀釋，涂布產酯篩選培養(yǎng)基，封口膜封口，40 ℃培養(yǎng)3～7 d至長出單菌落。從平板上挑取菌落附近有黃色圈的單菌落接入斜面培養(yǎng)基，30 ℃培養(yǎng)至長出菌苔，放入4 ℃冰箱保藏。

1.2.2菌株耐高溫篩選

將篩選獲得的菌株接種于50 mL基礎發(fā)酵培養(yǎng)基，30 ℃、150 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)24 h制成種子液，然后以1%的接種量分別接種于100 mL新鮮發(fā)酵培養(yǎng)基，于40℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)3 d，觀察菌體生長情況，取樣并于600 nm處測定吸光度。

1.2.3菌株耐高鹽篩選

按方法1.2.2制成種子液，以1%的接種量分別接種于100 mL含NaCl 180 g/L的發(fā)酵培養(yǎng)基，40℃、150 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)5 d，觀察菌體生長情況，取樣并于600 nm處測定吸光度。

1.2.4菌株產酯能力試驗

按方法1.2.2制成種子液，以10%的接種量分別接種于100 mL發(fā)酵培養(yǎng)基(葡萄糖含量為80 g/L)，30 ℃、150 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)7 d，每隔1 d分別取樣測定各菌株發(fā)酵液的總酯。

1.2.5總酯的測定[10-11]

量取50 mL發(fā)酵液，加入200 mL的蒸餾水，100 ℃進行蒸餾，收集餾出液50 mL，用回流皂化法測定餾出液中的總酯(以乙酸乙酯計)。

1.2.6菌株26S rDNA鑒定[12-13]

離心收集菌體，用酵母基因組DNA抽提試劑盒提取總DNA，作為PCR反應模板。PCR反應體系：5×PrimeSTAR Buffer 10 μL，dNTP Mixture(2.5 mmol each) 5 μL，Primer-F(5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3') 1 μL，Primer-R(5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3') 1 μL，DNA模板1 μL，PrimeSTAR HS DNA Polymerase(2.5 U/μL) 0.5 μL，補水至50 μL。PCR反應程序：96 ℃預變性4 min；96 ℃變性20 s，55 ℃退火15 s，72℃延伸1 min，32個循環(huán)；72℃延伸5 min，并用1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測擴增情況。PCR產物送華大基因科技有限公司進行測序。獲得序列結果后，在NCBI網(wǎng)站進行序列比對，挑選與之同源性在95%以上的菌株的26S rDNA序列，利用Mega 6.0軟件以Neighbor-Joining法進行1 000次步長計算構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.7目標菌株產酯發(fā)酵條件優(yōu)化

按方法1.2.4，探討碳源、氮源、溫度、NaCl含量對菌株產酯的影響，具體種類及用量范圍見表1。

表1　目標菌株產酯發(fā)酵條件優(yōu)化因素表

注：搖瓶為1000 mL三角瓶裝200 mL培養(yǎng)基，種子液接種量為10%，搖床轉速為150 r/min，振蕩培養(yǎng)6 d。

2結果與分析

2.1菌株分離純化

經過富集培養(yǎng)和分離純化，共獲得86個帶黃色圈的單菌落，選取10個黃色圈較大的單菌落劃線至YPD平板，觀察菌落形態(tài)并進行鏡檢，結果見表2。

表2　菌落與菌體特征

如表2所示，菌株PX-1、PX-2、PX-6、PX-7、PX-9的菌落形態(tài)均為圓形、乳白色、表面光滑，細胞形態(tài)為橢圓形，兩端出芽繁殖；菌株PX-3、PX-4、PX-5、PX-8、PX-10的菌落形態(tài)均為圓形、乳白色、表面干燥，細胞形態(tài)為圓形，一端出芽繁殖。

2.2菌株耐高溫、耐高鹽實驗

對獲得的10株菌進行耐高溫耐高鹽實驗，溫度選擇40℃，NaCl含量為180 g/L，結果見圖1。

圖1　菌株耐高溫、耐高鹽實驗結果Fig.1　The test results of thermotolerant and salt-tolerance of target strains

從圖1可知，在耐高溫實驗中，菌株PX-8長勢最好，在600 nm處的吸光度為2.860，其次為菌株PX-3和PX-5，其吸光度分別為2.685和2.610，其余菌株的吸光度均小于2.600；在耐高鹽實驗中，菌株PX-10長勢最好，吸光度達2.930，其次為菌株PX-8，其吸光度為2.910，其余菌株的吸光度均小于2.600。綜合分析，菌株PX-8在耐高溫耐高鹽實驗中，綜合性能表現(xiàn)最優(yōu)，而菌株PX-10雖然在耐高溫實驗中長勢表現(xiàn)一般(吸光度為2.586)，但其在耐高鹽實驗中長勢最好，故考慮選擇菌株PX-8和PX-10進行下一步實驗。

2.3菌株產酯能力實驗

為了探討篩選獲得的兩株耐高溫高鹽菌株PX-8和PX-10的產酯能力，對其進行了發(fā)酵產酯能力實驗，其中發(fā)酵培養(yǎng)基的葡萄糖含量提高到80 g/L，結果見圖2。

圖2　菌株PX-8和PX-10產酯能力實驗結果Fig.2　Yield of total ester produced from strain PX-8 and PX-10(培養(yǎng)條件為30℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)7 d)

由圖2可知，菌株PX-8和PX-10在發(fā)酵1天后都明顯產酯，而且總酯產量隨發(fā)酵時間的延長而提高，到第6天達到最高值，分別為2.353 g/L和2.112 g/L。兩株菌相比較，相同的發(fā)酵時間下PX-8比PX-10總酯產量高，在最高產量處高出11.4%左右。因此，在后續(xù)研究中，應選擇菌株PX-8進行實驗。

2.4菌種鑒定

用酵母基因組DNA抽提試劑盒提取目標菌株PX-8的總DNA，用設計合成的通用引物和高保真DNA聚合酶進行PCR擴增26S rDNA D1/D2區(qū)序列，產物經瓊脂糖電泳檢測，獲得特異擴增目的片段，其大小約600 bp，與預計片段大小吻合。PCR產物送華大基因科技有限公司進行測序，序列長度為576 bp。在NCBI網(wǎng)站進行序列比對，結果顯示，前100個相似性高的菌株中有78個為Z.rouxii，挑選與之同源性在95%以上的菌株的26S rDNA序列，利用Mega 6.0軟件以Neighbor-Joining法構建系統(tǒng)發(fā)育分析圖，如圖3所示。

圖3　菌株PX-8基于26S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育分析圖Fig.3　Phylogenetic analysis of strain PX-8 according to 26S rDNA sequence

由圖3可看出，在系統(tǒng)發(fā)育分析圖上，菌株PX-8與魯氏結合酵母(Z.rouxiiY12)同源性可信度為100%，可認定PX-8為魯氏結合酵母的一種。

2.5菌株PX-8產酯發(fā)酵條件優(yōu)化

2.5.1碳源對菌株產酯量的影響

實驗使用的碳源有葡萄糖、果糖、麥芽糖和蔗糖，為了探討其對菌株PX-8產酯量的影響，使用不同濃度的碳源配合基礎發(fā)酵培養(yǎng)基進行研究，結果見圖4。

圖4　碳源對菌株PX-8產酯量的影響Fig.4　Effect of carbon sources on ester yield of strain PX-8(培養(yǎng)條件為30℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)6 d)

從圖4可知，4種糖類當中，在相同濃度下，葡萄糖對菌株PX-8產酯貢獻量最大，蔗糖最小，可認為葡萄糖更容易被菌株利用轉化產生酯類物質，其用量在80 g/L時總酯產量最高，達到2.353 g/L，可見葡萄糖為最適合的碳源，應選擇其作為碳源進行下一步實驗，其使用質量濃度應為80 g/L。

2.5.2氮源對菌株產酯量的影響

本實驗使用的氮源分為有機態(tài)氮(酵母粉、蛋白胨)和無機態(tài)氮(尿素、硝酸銨)兩大類，為了探討其對菌株PX-8產酯量的影響，使用不同含量的氮源配合葡萄糖(用量為80 g/L)進行研究，結果見圖5。

圖5　氮源對菌株PX-8產酯量的影響Fig.5　Effect of nitrogen sources on ester yield of strain PX-8(培養(yǎng)條件為30℃、150 r/min振蕩培養(yǎng)6 d)

由圖5可知，有機態(tài)氮更有利于菌株生產酯類物質，可能是有機態(tài)氮源在被菌體利用的過程當中，除了提供氮源之外，還為菌體提供某些因子，能促進酯化反應朝合成酯類物質的方向進行，從而提高總酯產量。4種氮源當中，在相同濃度下，酵母粉對菌株PX-8產酯貢獻量最大，硝酸銨最小，可認為酵母粉更容易被菌株利用轉化產生酯類物質，其用量在40 g/L時總酯產量最高，達到2.528 g/L，可見酵母粉為最適合的氮源，應選擇其作為氮源進行下一步實驗，其使用質量濃度應為40 g/L。

2.5.3培養(yǎng)溫度對菌株產酯量的影響

為了探討培養(yǎng)溫度對菌株PX-8產酯量的影響，在最佳碳源和氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基配比下，本實驗溫度范圍選擇在26～44℃之間，總酯產量結果如圖6。

圖6　培養(yǎng)溫度對菌株PX-8產酯量的影響Fig.6　Effect of culture temperature on ester yield of strain PX-8(發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖80 g/L，酵母粉40 g/L，150 r/min振蕩培養(yǎng)6 d)

由圖6可知，培養(yǎng)溫度低于32 ℃時，總酯產量隨著培養(yǎng)溫度的升高而增加；在培養(yǎng)溫度高于32 ℃時，總酯產量隨著培養(yǎng)溫度的升高而減少。培養(yǎng)溫度在30～34 ℃時菌株PX-8產酯量較高，在32 ℃時達到最高，總酯含量達2.615 g/L。當培養(yǎng)溫度超過40 ℃時，總酯產量大幅度下降，由40 ℃時的1.596 g/L下降到44 ℃時的0.168 g/L，可能是溫度過高，菌體生長與代謝過慢的緣故而嚴重降低了總酯的產量。

2.5.4鹽質量濃度對菌株產酯量的影響

菌株PX-8在不同鹽質量濃度下總酯產量如圖7所示，隨著培養(yǎng)基中NaCl質量濃度的增大，總酯產量呈不斷下降趨勢。其中，NaCl質量濃度在0～75 g/L，總酯產量由2.612 g/L逐漸下降至1.850 g/L，降幅較小，總酯產量總體也較高；當NaCl質量濃度在75～200 g/L時，總酯產量由1.850 g/L迅速下降至0.105 g/L，降幅較大，總酯產量總體也較低。可見，低NaCl質量濃度(0～75 g/L)較適合菌株PX-8產酯。

圖7　鹽濃度對菌株PX-8產酯量的影響Fig.7　Effect of salinity on ester yield of strain PX-8(發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖80 g/L，酵母粉40 g/L，32 ℃，150 r/min振蕩培養(yǎng)6 d)

2.6菌株PX-8高溫高鹽條件下產酯能力測試

為了探討菌株PX-8在高溫高鹽條件下的產酯能力，本實驗在最佳碳源和氮源配比下延長發(fā)酵培養(yǎng)時間，考察了鹽濃度在180 g/L、溫度在40與42 ℃的條件下菌株產酯情況，總酯產量結果見圖8。

圖8　菌株PX-8在高溫高鹽條件下產酯結果Fig.8　Yield of total ester produced from strain PX-8 under high temperature and high salt conditions

從圖8可知，在高溫高鹽條件下，隨著發(fā)酵培養(yǎng)時間的延長，總酯產量呈上升趨勢，在第21天時達到最高值，之后呈下降趨勢。40 ℃培養(yǎng)與42 ℃培養(yǎng)相比，相同的培養(yǎng)時間內，40 ℃的總酯產量大大高于42 ℃，兩者的最高值分別為1.518 g/L和0.695 g/L，前者為后者的218%。可見菌株PX-8在用于醬油的后發(fā)酵時，為提高總酯產量，溫度不應高于40 ℃。

3結論

以豆瓣醬為篩選材料，通過富集、分離純化、耐高溫、耐高鹽、發(fā)酵產酯能力的試驗，選出1株耐高溫高鹽生香酵母菌PX-8，其在溫度高達40 ℃和NaCl質量濃度高達180 g/L的條件下能正常生長，經過26S rDNA鑒定，基本確定其為魯氏結合酵母(Zygosaccharomycesrouxii)。經過培養(yǎng)基碳源、氮源、培養(yǎng)溫度、NaCl濃度等因子的試驗，確定菌株PX-8最佳產酯培養(yǎng)條件為：葡萄糖80 g/L，酵母粉40 g/L，KH2PO41g/L，MgSO40.5 g/L，pH 6.0，32 ℃，150 r/min，發(fā)酵培養(yǎng)6 d，總酯產量最高達到2.615 g/L；在高溫高鹽條件下(發(fā)酵培養(yǎng)溫度為40 ℃，鹽質量濃度為180 g/L)，發(fā)酵培養(yǎng)21 d，總酯產量可達1.518 g/L。

參考文獻

[1]崔琪,魯梅芳,侯麗華,等.改善低鹽固態(tài)醬油風味的研究[J].中國釀造,2011(2):18-21.

[2]盧美歡,李利軍,賀建超,等.耐鹽產酯酵母在醬油生產中的應用研究進展[J].中國調味品,2010, 35(10): 48-51.

[3]FENG Jie, ZHAN Xiao-bei, WANG Dong, et al. Identification and analysis of the metabolic functions of a high-salt-tolerant halophilic aromatic yeast Candida etchellsii for soy sauce production[J]. World J Microbiol Biotechnol, 2012,28(4):1 451-1 458.

[4]關陽,王國良,王金枝,等.產酯酵母的應用研究現(xiàn)狀[J].釀酒科技,2013(1):101-103

[5]CHEN Xiong, YAN Mei, XIE Fu-li, et al. Biotin enhances salt tolerance ofTorulopsismogii[J]. Annals of Microbiology, 2015, 65(1):393-398.

[6]王春玲,劉卓,綦偉,等.耐鹽醬油酵母產香氣成分的動態(tài)分析[J].中國釀造,2008(9):16-19.

[7]徐瑩,姜維,何曉霞.耐鹽性魯氏酵母的研究進展[J].中國釀造, 2009(10):1-4.

[8]閆美.高耐鹽醬油酵母的選育及其在醬油釀造中的應用[D].武漢:湖北工業(yè)大學,2014.

[9]王春玲,宋茜,侯麗華,等.耐鹽產酯酵母的選育及發(fā)酵性能研究[J].中國釀造,2010(6):20-24.

[10]李向陽,王旭亮,王德良,等.高產乙酸乙酯酵母產酯條件的研究[J]. 釀酒科技,2014, 239(5):11-16.

[11]中華人民共和國國家質量監(jiān)督檢驗檢疫總局,中國國家標準化管理委員會. GB/T 10345—2007 白酒分析方法[S].北京:中國標準出版社,2007.

[12]譚才鄧,陳維新,廖延智,等.乙酸異戊酯高產菌株的選育及發(fā)酵條件優(yōu)化[J].中國調味品,2015,40(9):30-34.

[13]郭雪婉,崔海云,吳艷萍,等.酯酶產生菌的篩選、鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析[J].廣東輕工職業(yè)技術學院學報,2013,12(4):19-26.

Screening and characterization of aroma yeast with thermo-tolerant and salt-tolerance

TAN Cai-deng, WANG Wen-wen, ZHU Mei-juan, LIAO Yan-zhi, YAO Yong-fang*

(Guangdong Industry Technical College, Guangzhou 510300,China)

ABSTRACTTo obtain an aroma yeast strain with thermo-tolerance and salt-tolerance, 86 strains was isolated from bean paste. Through thermo-tolerance test, salt-tolerance test and determination of yield of este, strain PX-8 was screened out because it could grow normally at temperature up to 40 ℃ and NaCl concentration up to 180 g/L. According to 26S rDNA sequence analysis, strain PX-8 was identified as Zygosaccharomyces rouxii. The optimum conditions for production of ester with strain PX-8 were fermentation in medium cotaining glucose 80 g/L, yeast extract 40 g/L, KH2PO4 1 g/L, MgSO4 0.5 g/L, at pH6.0, 32 ℃, with 150 r/min shaking for 6 days. The yield of total ester was up to 2.615 g/L. After fermentation under high temperature and high salt conditions (fermentation temperature was 40 ℃, NaCl concentration was 180 g/L) for 21 days, the yield of total ester could reach 1.518 g/L. This study could provide useful reference for germplasm resources in the flavor promotion of fermented food such as soy sauce.

Key wordsthermotolerant; salt-tolerance; yeast; ester producing

收稿日期：2015-09-30，改回日期：2016-01-12

基金項目：廣州市科技計劃項目(201510010113)；創(chuàng)新強校工程專項資金項目(1A20205)。

DOI:10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201603016

第一作者：碩士，高級實驗師(姚勇芳教授為通訊作者,E-mail:2002102016@gdite.edu.cn)。