嚴(yán)伶俐 甘小迎 韓冬梅 吳振先

摘 要：為探討LcMn-SOD（荔枝Mn-SOD）、LcCu/Zn-SOD-1（荔枝Cu/Zn-SOD-1）、LcCu/Zn-SOD-2（荔枝Cu/Zn-SOD-2）、LcPRDX5（荔枝過(guò)氧化物還原酶5）與荔枝低溫貯藏過(guò)程中果皮褐變的關(guān)系，該文以‘井岡紅糯和‘懷枝為試驗(yàn)材料，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR對(duì)4個(gè)基因的表達(dá)特性進(jìn)行分析。結(jié)果表明，在‘井岡紅糯和‘懷枝低溫貯藏前期，二者的褐變指數(shù)上升較緩慢，同時(shí)LcMn-SOD、LcCu/Zn-SOD-1、LcCu/Zn-SOD-2、LcPRDX5的表達(dá)量下降；貯藏21d后，4個(gè)基因的表達(dá)量升高，褐變指數(shù)迅速上升，貯藏后期嚴(yán)重褐變果皮中LcMn-SOD、LcCu/Zn-SOD-1、LcCu/Zn-SOD-2、LcPRDX5表達(dá)量比貯藏前期高。低溫貯藏過(guò)程中，‘井岡紅糯的耐貯性高于‘懷枝，與之對(duì)應(yīng)的 LcMn-SOD、LcCu/Zn-SOD-1、LcCu/Zn-SOD-2、LcPRDX5的表達(dá)也高于‘懷枝，但2個(gè)品種種4個(gè)基因表達(dá)的變化趨勢(shì)大致相同，LcMn-SOD、LcCu/Zn-SOD-1、LcCu/Zn-SOD-2、LcPRDX5與荔枝果皮褐變密切相關(guān)。

關(guān)鍵詞：荔枝；果皮褐變；基因；表達(dá)

中圖分類(lèi)號(hào) S66 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼 A 文章編號(hào) 1007-7731（2016）07-114-05

Abstract：In order to clarify the relationship between LcMn-SOD，LcCu/Zn-SOD-1，LcCu/Zn-SOD-2，LcPRDX5 genes and the pericarp browning of Litchi during the low temperatures torage，the method of qRT-PCR was used for the four genes expression in‘Jingganghongnuoand‘Huaizhi litchi. In this study，the pericarp gradually getting brown in the early stage of low temperature storage of the two cultivars，and at the same time ，the expression of LcMn-SOD，LcCu/Zn-SOD-1，LcCu/Zn-SOD-2，LcPRDX5 genes were decreased，but those genes mRNA accumulation increased with the browning index rose rapidly on 21th day at low temperature storage. The expression of LcMn-SOD，LcCu/Zn-SOD-1，LcCu/Zn-SOD-2，LcPRDX5 genes of the seriously browning fruit in the late stage of the storage were higher than the early stage of the storage. Compared with ‘Huaizhi，the storability of ‘Jingganghongnuo was better during the cold storage，and expression of the four genes were also higher，but they have asimilar expression pattern. As a result，LcMn-SOD，LcCu/Zn-SOD-1，LcCu/Zn-SOD-2，LcPRDX5 genes was closely related to the pericarp browning of Litchi.

Key words：Litchi；Pericarp browning；Gene；Expression

荔枝是我國(guó)南方重要的熱帶亞熱帶木本果樹(shù)[1]，采后果實(shí)極易衰老，果皮褐變[2]，很大程度上降低了其商品價(jià)值[3]。衰老的自由基理論認(rèn)為，衰老的主要原因是細(xì)胞代謝過(guò)程中不斷產(chǎn)生自由基，保持體內(nèi)自由基和抗氧化劑的平衡可以延緩衰老[4]。超氧化物歧化酶（SOD）和過(guò)氧化物還原酶5（PRDX5）在清除植物體內(nèi)的活性氧自由基的過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，對(duì)于延緩荔枝果實(shí)衰老褐變具有重要意義。有研究表明，SOD是植物體內(nèi)清除活性氧的第一道防線(xiàn)[5]，人們對(duì)其進(jìn)行了廣泛的研究。SOD在植物界普遍存在，根據(jù)其金屬輔離子的不同，可分為 Cu/Zn-SOD、Fe-SOD和Mn-SOD[6]，Cu/Zn-SOD主要存在于細(xì)胞質(zhì)中，Mn-SOD主要存在于線(xiàn)粒體中[7]，與植物的抗衰老等密切相關(guān)[8-9]。PRDX5也是清除活性氧的重要酶之一，在過(guò)氧化物酶體中普遍存在，催化過(guò)氧化氫和羥自由基轉(zhuǎn)化成對(duì)生物體無(wú)害的水和氧氣。過(guò)氧化物還原酶（PRDX）是一類(lèi)不含輔基的巰基依賴(lài)性抗氧化蛋白酶，也是一類(lèi)不含硒的過(guò)氧化物酶超家族，催化活性主要依賴(lài)于硫氧還蛋白的半胱氨酸，因此又稱(chēng)之為硫氧還蛋白過(guò)氧化物酶（TPX）[10]。目前，對(duì)于SOD的研究主要集中在總的SOD上，對(duì)于荔枝果皮中Cu/Zn-SOD、Mn-SOD的研究報(bào)道較少，而荔枝果皮中的PRDX5尚未見(jiàn)報(bào)道。為此，本研究以荔枝果皮為材料，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)不同品種的荔枝低溫貯藏過(guò)程中LcMn-SOD、LcCu/Zn-SOD-1、LcCu/Zn-SOD-2、LcPRDX5的特異性表達(dá)進(jìn)行分析，為今后深入研究LcMn-SOD、LcCu/Zn-SOD-1、LcCu/Zn-SOD-2、LcPRDX5在荔枝果皮褐變中的作用機(jī)理與酶促調(diào)控研究提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 試驗(yàn)用井岡紅糯荔枝采自廣東省陽(yáng)西縣華翔果場(chǎng)，懷枝采自廣東省從化市，采收成熟度為80%。挑選成熟度一致、無(wú)病蟲(chóng)害、無(wú)機(jī)械損傷、大小一致的果實(shí)，不進(jìn)行任何處理，直接使用0.02mm厚的聚乙烯袋包裝，每袋30個(gè)果，（4±1）℃下貯藏35d，每7d取一次樣，每次取3袋荔枝，剝下荔枝果皮，迅速用液氮固定，-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 褐變指數(shù)的評(píng)定 按照荔枝果皮外表面褐變面積的大小進(jìn)行分級(jí)：0級(jí)：果實(shí)全紅，無(wú)褐斑，1級(jí)：龜裂片尖端有零星褐點(diǎn)，褐變面積小于1/4，2級(jí)：褐變面積占果實(shí)面積1/4～1/3，3級(jí)：褐變面積占果實(shí)面積1/3～1/2，4級(jí)：褐變面積占果實(shí)面積大于1/2～3/4，5級(jí)：全部褐變，褐變指數(shù)=∑（級(jí)數(shù)×各級(jí)果數(shù)）/總果數(shù)[1]。隨機(jī)取3袋龍眼果實(shí)，測(cè)定其內(nèi)果皮褐變指數(shù)。

1.3 RNA提取檢測(cè)和cDNA的準(zhǔn)備 以井岡紅糯和懷枝荔枝果皮為材料，總RNA的提取和純化過(guò)程依照北京華越洋生物科技有限公司植物RNA操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。用生物分光光度計(jì)和1.2%的瓊脂糖變性膠電泳對(duì)RNA完整性做出評(píng)價(jià)。以mRNA為模板，使用TOYOBO的ReverTra Ace qPCR RT Kit 試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。用生物分光光度計(jì)測(cè)定其濃度，并分別稀釋到80ng/μL，-70℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 熒光定量的引物設(shè)計(jì)和合成 根據(jù)LcMn-SOD、LcCu/Zn-SOD-1、LcCu/Zn-SOD-2、LcPRDX5的ID在荔枝全基因組中查找并獲得基因序列。根據(jù)熒光定量引物設(shè)計(jì)的規(guī)則，為保證擴(kuò)增片段的特異性，引物設(shè)計(jì)的區(qū)域定于3′末端非翻譯區(qū)和翻譯區(qū)之間。引物擴(kuò)增的長(zhǎng)度在100～250bp，以保證較高的擴(kuò)增效率。引物的長(zhǎng)度在22bp左右，退火溫度在60℃附近或者更高。利用引物設(shè)計(jì)軟件Primer 5.0進(jìn)行熒光引物設(shè)計(jì)，設(shè)計(jì)好的引物通過(guò)Oligo 6.0進(jìn)行評(píng)價(jià)。當(dāng)引物符合上述條件后，送上海生工生物有限公司合成。

1.5 引物的驗(yàn)證和優(yōu)化

1.5.1 普通PCR擴(kuò)增驗(yàn)證 引物合成后，以1.4中所制備的cDNA混合液作為模板，采用TaKaRa LA Taq酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。引物上下游在體系中的中濃度為250 nM。擴(kuò)增反應(yīng)體系（20μL）如下：2μL 10×rTaq Buffer（Mg2+Plus），2μL dNTP Mixture（2.5mM），2μL Forward primer （2.5μM），2μL Reverse primer（2.5μM），0.2μL r Taq 酶，2μL cDNA，用ddH2O定容到20μL?；靹蚝螅庞赑CR儀中反應(yīng)程序如下：95℃、10min，95℃、30s，TM-5℃、30s，72℃、1min，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min，4℃保存。PCR反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增的特異性及其片段長(zhǎng)度與引物設(shè)計(jì)的產(chǎn)物長(zhǎng)度是否一致，以確定所擴(kuò)增的片段為自己所克隆基因。

1.5.2 溶解曲線(xiàn)分析 在普通PCR對(duì)引物驗(yàn)證的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步使用熒光定量PCR擴(kuò)增，同時(shí)做無(wú)模板對(duì)照（No Template Control，NTC），通過(guò)溶解曲線(xiàn)分析，從更高的靈敏度檢驗(yàn)引物對(duì)的純度和擴(kuò)增的特異性，以及有無(wú)引物二聚體的形成。

1.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作 對(duì)驗(yàn)證后的引物對(duì)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制定。共設(shè)置7個(gè)濃度梯度，采用混合模板，進(jìn)行梯度稀釋?zhuān)?0倍稀釋后，進(jìn)行定量PCR擴(kuò)增后計(jì)算基因的擴(kuò)增效率。PCR反應(yīng)體系：SYBER 10μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，SDW 7μL，cDNA 2μL，PCR儀中反應(yīng)程序如下：95℃、10min，95℃、30s，TM-5℃、30s，72℃、1min，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min。

1.7 不同品種荔枝果皮 LcMn-SOD、LcCu/Zn-SOD-1、LcCu/Zn-SOD-2、LcPRDX5在低溫貯藏過(guò)程中的表達(dá)分析分別使用‘井岡紅糯和‘懷枝果皮不同貯藏時(shí)間的cDNA為模板，統(tǒng)一稀釋到80ng/μL，使用模板量為160ng。PCR反應(yīng)體系：SYBER 10μL，上游引物0.5μL，下游引物0.5μL，SDW 7μL，cDNA2μL，PCR儀中反應(yīng)程序如下：95℃、10min，95℃、30s，TM-5℃、30s，72℃、1min，30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10min，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行溶解曲線(xiàn)分析。熒光表達(dá)量計(jì)算采用2-△△CT法，10min，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行溶解曲線(xiàn)分析。熒光表達(dá)量計(jì)算采用2-△△CT法，由熒光定量PCR儀軟件系統(tǒng)自動(dòng)分析得出結(jié)果。

2 結(jié)果與分析

2.1 荔枝果皮褐變指數(shù)的變化 由圖1可知，井岡紅糯和懷枝果實(shí)低溫貯藏過(guò)程中，褐變指數(shù)隨著貯藏時(shí)間的增加呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，貯藏7～21d果皮的褐變指數(shù)上升較慢，而后迅速褐變，并且在相同貯藏時(shí)間內(nèi)‘懷枝褐變指數(shù)一直高于‘井岡紅糯，二者果實(shí)在采后35d完全褐變。

2.2 熒光定量引物驗(yàn)證 如圖2所示，用于熒光定量的所有引物對(duì)的溶解曲線(xiàn)都只有一個(gè)單一的銳鋒，且NTC沒(méi)有引物二聚體產(chǎn)生，綜合引物對(duì)的普通PCR結(jié)果來(lái)看，所設(shè)計(jì)的引物符合熒光定量的引物要求。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作 采用混合模板作為標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的制作模板，共設(shè)置5個(gè)濃度梯度，進(jìn)行10倍稀釋。從表1可見(jiàn)，目的基因的回歸系數(shù)R2均高于0.95，最高的為L(zhǎng)cCu/Zn-SOD-1的0.997，最低的為L(zhǎng)cPRDX5的0.960，表明標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的線(xiàn)性關(guān)系很好。擴(kuò)增效率均高于98%，最低為L(zhǎng)cCu/Zn-SOD-1的98.2%，最高為L(zhǎng)cPRDX5的117.1%，均在85%～120%，表明擴(kuò)增效率較好。滿(mǎn)足后續(xù)試驗(yàn)的參數(shù)標(biāo)準(zhǔn)，用2-△△CT法進(jìn)行基因定量表達(dá)結(jié)果的數(shù)據(jù)分析。

2.4 LcMn-SOD、LcCu/Zn-SOD-1、LcCu/Zn-SOD-2、LcPRDX5基因在2個(gè)品種荔枝低溫貯藏過(guò)程中的表達(dá)特性分析 LcMn-SOD在井岡紅糯荔枝和懷枝荔枝低溫貯藏過(guò)程中的各個(gè)時(shí)期都有表達(dá)，且果皮的相對(duì)表達(dá)量整體上都呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)。懷枝荔枝果皮的LcMn-SOD的相對(duì)表達(dá)量在貯藏前期持續(xù)下降，28d達(dá)到一個(gè)峰值后急劇下降；井岡紅糯荔枝果皮的LcMn-SOD的相對(duì)表達(dá)量在14d出現(xiàn)峰值后迅速下降，貯藏的第21天和第28天的相對(duì)表達(dá)量基本沒(méi)有變化，而后先上升再下降；2個(gè)荔枝果皮的LcMn-SOD的表達(dá)量在低溫貯藏的后14d的趨勢(shì)完全相同（圖3A）。

LcCu/Zn-SOD-1和LcCu/Zn-SOD-2在‘井岡紅糯、‘懷枝低溫貯藏的各個(gè)時(shí)期都有表達(dá)，且2個(gè)基因整體的相對(duì)表達(dá)都呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。LcCu/Zn-SOD-1在‘懷枝低溫貯藏過(guò)程中先持續(xù)下降，在28d達(dá)到峰值后迅速下降；而在‘井岡紅糯果皮中則是在14d達(dá)到峰值后起伏式下降，LcCu/Zn-SOD-1與LcMn-SOD在2個(gè)品種中對(duì)應(yīng)的變化趨勢(shì)完全相同（圖3AB）。LcCu/Zn-SOD-2‘懷枝果皮先下降后略有上升再急劇下降，整體表達(dá)量下降；而在‘井岡紅糯果皮中則是起伏式下降后緩慢上升，整體表達(dá)量下降（圖3C）。由此可知LcCu/Zn-SOD在2個(gè)荔枝品種低溫貯藏過(guò)程中表達(dá)量都呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。

LcPRDX5在‘井岡紅糯‘懷枝果皮中的表達(dá)趨勢(shì)與LcMn-SOD在2個(gè)品種中對(duì)應(yīng)的表達(dá)趨勢(shì)完全相同，都是在‘井岡紅糯果皮中起伏式下降，第14天達(dá)到峰值，21～28d基本保持不變；在‘懷枝果皮中持續(xù)下降后在28d達(dá)到峰值后再下降（圖3D）。

3 討論與結(jié)論

超氧化物歧化酶（SOD）是重要的抗氧化酶類(lèi)之一[12]，衰老早期將超氧化物催化分解為基態(tài)氧和H2O2[13]，有效清除植物體內(nèi)的ROS，因此SOD在衰老的整個(gè)代謝過(guò)程中起著重要的作用[14]。不早衰的玉米品種葉片的SOD活性比早衰的高，說(shuō)明這個(gè)酶在延緩衰老過(guò)程中起著重要作用[15]。黃嘌呤氧化酶過(guò)量催化產(chǎn)生了過(guò)多的O[-2]，產(chǎn)生氧化脅迫引起蝴蝶蘭花的衰老，同時(shí)，老花的萼片和花瓣的SOD的活性增大，從而延緩花的衰老[16]。研究荔枝果皮的SOD表達(dá)對(duì)于研究荔枝果皮采后衰老褐變具有重要意義。

Peroxiredoxins（PRDXs）家族是近期發(fā)現(xiàn)的巰基特異性氧化還原酶，是最重要的抗氧化劑之一[17]，在組織細(xì)胞中的廣泛分布和高表達(dá)，含有保守的Cys基團(tuán)和相似的功能域，對(duì)超氧化合物具有高度親和性[18]。Prdxs催化分解H2O2和脂質(zhì)過(guò)氧化物，清除過(guò)多的活性氧[19]。PRDX5作為PRDXs家族的一員，是一種新的不常見(jiàn)的PRDX[20]，有線(xiàn)粒體和過(guò)氧化物酶體靶信號(hào)，被定性為硫氧還蛋白過(guò)氧化物酶[21]，能有效清除植物體內(nèi)的ROS，在荔枝衰老調(diào)控中扮演重要角色。

本研究結(jié)果表明，在‘井岡紅糯和‘懷枝低溫貯藏前期，二者的褐變指數(shù)上升較緩慢，同時(shí)LcMn-SOD、LcCu/Zn-SOD-1、LcCu/Zn-SOD-2、LcPRDX5的表達(dá)量下降，這可能是低溫誘導(dǎo)的條件下，引起荔枝果皮的酶表達(dá)下調(diào)，荔枝果實(shí)的各種代謝緩慢，活性氧的產(chǎn)生受到抑制，褐變緩慢。低溫貯藏的21d內(nèi)，LcMn-SOD、LcCu/Zn-SOD-1、LcCu/Zn-SOD-2、LcPRDX5表達(dá)量低的‘井岡紅糯褐變指數(shù)也低于表達(dá)量高的‘懷枝果皮。這可能是低LcMn-SOD、LcCu/Zn-SOD-1、LcCu/Zn-SOD-2、LcPRDX5表達(dá)量的‘井岡紅糯有較低的LcLac蛋白和低的總酶活性，因而具有較低的褐變指數(shù)。貯藏21d后，4個(gè)基因的表達(dá)量升高，這可能是荔枝果實(shí)對(duì)低溫適應(yīng)后組織代謝積累導(dǎo)致活性氧含量升高引起的。貯藏過(guò)程中，‘懷枝的褐變指數(shù)始終高于‘井岡紅糯，說(shuō)明‘井岡紅糯比‘懷枝耐貯；與之對(duì)應(yīng)的LcMn-SOD、LcCu/Zn-SOD-1、LcCu/Zn-SOD-2、LcPRDX5表達(dá)量也略高于‘井岡紅糯，可能是由于荔枝褐變導(dǎo)致活性氧含量升高，引起LcMn-SOD、LcCu/Zn-SOD-1、LcCu/Zn-SOD-2、LcPRDX5的高表達(dá)，使其編碼的酶的活性升高從而減輕荔枝果皮活性氧積累的壓力。綜合這些結(jié)果說(shuō)明，低溫貯藏過(guò)程中，‘井岡紅糯的耐貯性高于‘懷枝，與之對(duì)應(yīng)的LcMn-SOD、LcCu/Zn-SOD-1、LcCu/Zn-SOD-2、LcPRDX5的表達(dá)也高于‘懷枝，但2個(gè)品種種4個(gè)基因表達(dá)的變化趨勢(shì)大致相同，LcMn-SOD、LcCu/Zn-SOD-1、LcCu/Zn-SOD-2、LcPRDX5與荔枝果皮褐變密切相關(guān)。這些結(jié)果為進(jìn)一步研究這些基因在荔枝果皮褐變中的作用提供依據(jù)。

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（責(zé)編：張宏民）