楊宇嘉+陳營(yíng)

摘 要：芽孢桿菌由于功能性強(qiáng)，作用明顯，被廣泛應(yīng)用于水產(chǎn)養(yǎng)殖中。為得到一株能有效凈化養(yǎng)殖水環(huán)境的菌株，本試驗(yàn)從7株芽孢桿菌中篩選出具有高效降氨氮、亞硝態(tài)氮、產(chǎn)酶的菌種，其中C24的氨氮去除率達(dá)到75%；C22的亞硝態(tài)氮去除率可達(dá)64%；C12和C13產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶能力突出。研究認(rèn)為可作為水產(chǎn)微生物制劑的候選菌種。

關(guān)鍵詞：氨氮；亞硝酸鹽；微生物制劑；水產(chǎn)養(yǎng)殖

中圖分類號(hào)：S942.3 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2016.05.013

Analysis of Function of Several Strains of Bacillus in Aquaculture

YANG Yujia， CHEN Ying

（College of Life Sciences， Yantai University， Yantai， Shandong 264005， China）

Abstract： Bacillus is widely used in aquaculture， because of its functional， obvious effect. To obtain a strain which can effectively purify the water environment， in this study， the strains was screened from 7 Bacillus which have efficient ability of decomposition of ammonia， nitrite， enzyme production， among which the ammonia removal rate of Bacillus C24 reached 75%， the nitrite nitrogen removal rate of Bacillus C22 was 64%， the protease， amylase ability of Bacillus C12 and C13 were highlight. It could be used as a candidate species for aquatic microbial agents.

Key words： ammonia； nitrite； microbial agents； aquaculture

近年來(lái)，我國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)不斷發(fā)展，隨著養(yǎng)殖規(guī)模逐漸擴(kuò)大，養(yǎng)殖密集度、繼續(xù)惡化程度的加深，養(yǎng)殖環(huán)境與水浴生態(tài)環(huán)境的矛盾也日益突出。我國(guó)的水產(chǎn)養(yǎng)殖方式大多為靜水養(yǎng)殖，養(yǎng)殖動(dòng)物的活動(dòng)、攝食、排泄都在同一池塘內(nèi)進(jìn)行，并且以單一品種高密度養(yǎng)殖為主，嚴(yán)重破壞了生態(tài)系統(tǒng)的平衡[1]。在高密度養(yǎng)殖中，由于飼料的過(guò)量投喂，水產(chǎn)動(dòng)物排泄物的積累以及漁藥濫用，使得養(yǎng)殖水體不斷惡化[2]。水體污染物有來(lái)自于余料殘餌中殘留的蛋白質(zhì)和淀粉，養(yǎng)殖動(dòng)物糞便、殘餌分解及肥料中的大量氨氮、亞硝酸氮和硫化物等，水質(zhì)好壞直接關(guān)系著水產(chǎn)養(yǎng)殖的經(jīng)濟(jì)效益。而如何調(diào)節(jié)和改善水體環(huán)境，降低和去除水體污染物（有機(jī)物、氨氮、亞硝酸鹽）已經(jīng)成為凈化養(yǎng)殖水質(zhì)的研究熱點(diǎn)[3]。就目前來(lái)看，用傳統(tǒng)的物理及化學(xué)方法處理水體氨氮污染，雖然見(jiàn)效快，但投入較大，且容易引起二次污染，而利用微生物調(diào)節(jié)養(yǎng)殖水體水質(zhì)被認(rèn)為是目前最為經(jīng)濟(jì)、生態(tài)、環(huán)保的方法[4-6]。

芽孢桿菌因其具有生長(zhǎng)速度快、易培養(yǎng)、抗逆性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，已被越來(lái)越多的人所關(guān)注，芽孢桿菌具有高活性的消化酶系，能夠分解養(yǎng)殖水體中的各種大分子有機(jī)物，謝航等研究表明，地衣芽孢桿菌在適宜的水體生態(tài)條件下對(duì)飼料殘餌中的蛋白質(zhì)與淀粉降解率為60%左右[7]。有些芽孢桿菌還能降解水體中的氨氮和亞硝酸氮等有毒物質(zhì)，凈化水質(zhì)，有研究表明，巨大芽孢桿菌在氨氮初始濃度為50 mg·L-1的環(huán)境下，24 h的氨氮降解率在95%以上[8]。同時(shí)芽孢桿菌還能抑制某些病原微生物的生長(zhǎng)[9]，提高免疫力，使養(yǎng)殖動(dòng)物免受病害。因此，芽孢桿菌作為水產(chǎn)微生物制劑的菌株具有廣闊的應(yīng)用前景[10]。

本試驗(yàn)探究幾株市售產(chǎn)品中分離的芽孢桿菌的功能，研究它們的生長(zhǎng)穩(wěn)定性、有機(jī)物分解能力和氨氮、亞硝酸氮去除能力，為以后開(kāi)發(fā)研制高效凈水微生物制劑提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

菌種：從不同種市售芽孢桿菌產(chǎn)品中提取分離得到7株芽孢桿菌，分別是C10-2、C12、C13、C15、C22、C23和C24。留種保存。

主要培養(yǎng)基如下。

（1）牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（g·L-1）：牛肉浸膏3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，固體培養(yǎng)基加1.5%的瓊脂。

（2）生長(zhǎng)速度測(cè)定培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，蛋白胨5 g，K2HPO4 1 g，（NH4）2SO4 10 g，酵母膏0.5 g，MgSO4 0.4 g，水1 000 mL，pH 值7.0～7.2、115 ℃滅菌30 min。

（3）酪素水解培養(yǎng)基（g·L-1）：脫脂奶粉50 g，固體培養(yǎng)基加1.5%的瓊脂。

（4）淀粉水解培養(yǎng)基（g·L-1）：牛肉浸膏 3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，可溶性淀粉2 g，固體培養(yǎng)基加1.5%的瓊脂。

（5）卵磷脂酶測(cè)定培養(yǎng)基（g·L-1）：牛肉浸膏 3 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，體積比1∶1的卵黃鹽水溶液50 mL，固體培養(yǎng)基加1.5%的瓊脂。

（6）耐鹽性培養(yǎng)基：含3%NaCl的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基。

（7）耐堿性培養(yǎng)基：pH值為10的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基。

（8）氨氮降解篩選和測(cè)定培養(yǎng)基（g·L-1）：葡萄糖5.0 g，NH4Cl 2.0 g，NaCl 2.0 g，K2HPO4 1.0 g，MgSO4 0.5 g，F(xiàn)eSO4 0.2 g， pH 值7.0～7.5，固體培養(yǎng)基加1.5%的瓊脂。endprint

（9）亞硝酸氮測(cè)定培養(yǎng)基（g·L-1）：葡萄糖4.0 g，NaNO2 0.5 g，K2HPO4 0.2 g，KH2PO4 0.2 g，MgSO4 0.2 g，蛋白胨1.0 g， pH 值7.0～7.5，固體培養(yǎng)基加1.5%的瓊脂。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化 在無(wú)菌條件下取適量菌種接種于20 mL牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，28 ℃，100 r·min-1搖床振蕩培養(yǎng)24 h（厭氧菌28 ℃靜置培養(yǎng)72 h），于4 ℃保存。

1.2.2 微生物生長(zhǎng)速率試驗(yàn) 取活化后的菌液各200 μL，分別接種于20 mL培養(yǎng)基，28 ℃、100 r·min-1搖床振蕩培養(yǎng)（厭氧菌靜置培養(yǎng)）12和24 h（厭氧菌培養(yǎng)24和72 h），無(wú)菌條件下取適量菌液測(cè)定菌液濃度。

1.2.3 有機(jī)物分解試驗(yàn) 各取5 μL活化好的菌液，分別點(diǎn)種在酪素平板、淀粉平板和卵磷脂平板上，每個(gè)平板上點(diǎn)種3個(gè)點(diǎn)，置于28 ℃培養(yǎng)箱內(nèi)倒置培養(yǎng)24 h（厭氧菌培養(yǎng)72 h），并觀察試驗(yàn)結(jié)果。

1.2.4 耐鹽耐堿性試驗(yàn) 取活化后的菌液各200 μL，分別接種于20 mL含3%NaCl的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基和pH 值為10的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基上，于28 ℃、100 ·min-1搖床振蕩培養(yǎng)（厭氧菌靜置培養(yǎng)），培養(yǎng) 24 h（厭氧菌培養(yǎng)72 h）。

1.2.5 抑菌性試驗(yàn) 采用濾紙片法分別浸潤(rùn)芽孢菌懸液，貼在涂有待抑制4種致病菌（大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、嗜水氣單胞菌和副溶血弧菌）平板上，28 ℃倒置培養(yǎng)24 h（厭氧菌培養(yǎng)72 h），觀察有無(wú)抑菌圈及抑菌圈大小。

1.2.6 氨氮含量測(cè)定試驗(yàn) 取適當(dāng)稀釋的菌懸液0.1 mL涂布在氨氮篩選培養(yǎng)基平板上，28 ℃倒置培養(yǎng)24 h，觀察菌種生長(zhǎng)情況。選取能夠在氨氮篩選固體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的菌種，并取其菌懸液0.5 mL接種于20 mL的氨氮測(cè)定培養(yǎng)基的100 mL三角瓶中，28 ℃、120 r·min-1振蕩培養(yǎng)（C22 28 ℃厭氧靜置培養(yǎng)）24 h。菌液適當(dāng)稀釋后測(cè)定氨氮含量，氨氮測(cè)定方法為次溴酸鹽氧化法（參照GB 17378.4—2007）。

1.2.7 亞硝酸氮含量測(cè)定試驗(yàn) 取0.5 mL活化好的不同菌種，分別接種于20 mL的亞硝酸氮測(cè)定培養(yǎng)基1和2的100 mL三角瓶中，于28 ℃、120 r·min-1振蕩培養(yǎng)（C22于28 ℃厭氧靜置培養(yǎng)）24 h，適當(dāng)稀釋后測(cè)定菌液濃度OD600和菌液的亞硝酸氮含量。亞硝酸氮測(cè)定方法為萘乙二胺分光光度法。

2 結(jié)果與分析

2.1 芽孢桿菌生長(zhǎng)的測(cè)定

從圖1可知，C22為厭氧菌，生長(zhǎng)情況較差，其余菌種生長(zhǎng)情況良好。其中：C24在24 h的菌液濃度最大，生長(zhǎng)情況最好；C15前期生長(zhǎng)較差，24 h生長(zhǎng)旺盛；C10-2、C12、C13和C23前后菌濃度差別不大。

2.2 不同芽孢桿菌酶活能力的測(cè)定

如表1所示：所有菌種都有分泌蛋白酶的能力，C22分泌蛋白能力較差；從產(chǎn)淀粉酶的能力來(lái)看，C15、C22產(chǎn)淀粉酶能力非常弱，無(wú)法看到淀粉水解的透明圈，其余菌種都有較強(qiáng)的淀粉水解能力；從產(chǎn)卵磷脂酶的能力來(lái)看，C23、C24產(chǎn)卵磷脂能力很強(qiáng)，C10-2、C12和C13產(chǎn)卵磷脂酶能力次之，C22對(duì)卵磷脂的降解能力較小，C15不產(chǎn)生卵磷脂酶。

2.3 不同芽孢桿菌的耐鹽性試驗(yàn)

如表2所示，在耐鹽性試驗(yàn)中，除了C24試驗(yàn)組（含3%NaCl）的生長(zhǎng)情況好于對(duì)照組（含0.5%NaCl）之外，其余菌種在對(duì)照組中的生長(zhǎng)情況好于試驗(yàn)組，C22的生長(zhǎng)情況較其余菌種的生長(zhǎng)濃度小的多。

2.4 不同芽孢桿菌的耐堿性試驗(yàn)

如表3所示，在耐堿性試驗(yàn)中，對(duì)照組（普通牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基）的生長(zhǎng)情況很好，試驗(yàn)組（pH10的牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基）基本沒(méi)有生長(zhǎng)，C22的生長(zhǎng)結(jié)果在兩組均較差。

2.5 不同芽孢桿菌的抑菌試驗(yàn)

抑菌試驗(yàn)結(jié)果：7個(gè)菌種對(duì)大腸桿菌、嗜水氣單胞菌和副溶血弧菌沒(méi)有抑制作用，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌結(jié)果如表4所示。

在金黃色葡萄球菌的抑菌試驗(yàn)中，可以看出C10-2、C12和C13的抑菌效果較好，C22、C23和C24的抑菌效果稍差一些，C15沒(méi)有抑菌效果。

2.6 不同芽孢桿菌的氨氮降解試驗(yàn)

7種芽孢桿菌在氨氮篩選平板上均有菌落出現(xiàn)，表明這7種芽孢桿菌都能以NH4Cl作為氮源生長(zhǎng)，具有去除氨氮的能力，需要對(duì)其去除氨氮能力進(jìn)行定量測(cè)定。試驗(yàn)結(jié)果顯示（表5）：不同菌種培養(yǎng)24 h均有良好的生長(zhǎng)；經(jīng)過(guò)24 h的培養(yǎng)，不同菌種對(duì)氨氮的降解率均達(dá)到50%以上，其中C12、C22、C23和C24對(duì)氨氮降解率可以達(dá)到70%。

2.7 不同芽孢桿菌的亞硝酸氮降解試驗(yàn)

如表6所示，不同菌種經(jīng)過(guò)24 h培養(yǎng)后，菌種均有生長(zhǎng)，但生長(zhǎng)濃度不高；亞硝酸氮的降解率最好的是C22，達(dá)到64.4%，C13的亞硝酸降解率最差，其余菌種的降解率均不高。

3 結(jié)論與討論

有許多研究表明，芽孢桿菌具有降低氨氮和大分子有機(jī)物的能力，枯草芽孢桿菌和巨大芽孢桿菌具有明顯的去除氨氮和亞硝酸氮的功能，利用枯草芽孢桿菌制劑改良羅氏沼蝦養(yǎng)殖池塘水質(zhì)，氨氮最大降解率為59.61%，亞硝態(tài)氮的最大降解率為86.70%，地衣芽孢桿菌可以有效地分解殘餌中的蛋白質(zhì)和淀粉；芽孢桿菌還可促進(jìn)微藻、顫藻等有益藻類的生長(zhǎng)，抑制嗜水氣單胞菌、愛(ài)德華氏菌等水產(chǎn)致病菌的繁殖擴(kuò)散[11-12]。此外，芽孢桿菌對(duì)養(yǎng)殖動(dòng)物還有益生作用，像一些短小芽孢桿菌可以作為水產(chǎn)動(dòng)物的促生長(zhǎng)添加劑，添加芽孢桿菌的飼料可以更明顯地提升其在養(yǎng)殖動(dòng)物腸道中的作用。例如在飼料中添加枯草芽孢桿菌，可以顯著提高宿主腸道內(nèi)消化酶的活性，增加腸道中有益菌群（如雙歧桿菌和乳桿菌）的數(shù)量。芽孢桿菌的種類繁多、功能各異，是目前在水產(chǎn)養(yǎng)殖中應(yīng)用最普遍，使用數(shù)量最多的菌種，其研究與發(fā)展前景十分廣闊。endprint

本試驗(yàn)對(duì)從不同種市售芽孢桿菌產(chǎn)品中提取分離得到的7株芽孢桿菌進(jìn)行分類篩選，發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌C24在基本培養(yǎng)基和高鹽的培養(yǎng)基中均能旺盛生長(zhǎng)，分泌胞外酶，對(duì)氨氮的降解率均達(dá)到75%以上，并且同時(shí)具有降低亞硝態(tài)氮的能力，說(shuō)明其生長(zhǎng)速度快，有一定的抗逆性，能有效去除水中氨氮，可作為高效氨氮降解的水產(chǎn)試驗(yàn)菌種。C22作為試驗(yàn)中唯一的厭氧菌，生長(zhǎng)速度緩慢，菌液濃度偏低，所表現(xiàn)出的酶活力、抑菌能力也較差，但在亞硝酸氮的降解試驗(yàn)中，對(duì)亞硝酸氮的降解率明顯高于其他菌種，達(dá)到64.4%，可作為有效去除亞硝態(tài)氮的水產(chǎn)試驗(yàn)菌種。C12和C13生長(zhǎng)迅速，產(chǎn)蛋白酶、淀粉酶能力較強(qiáng)，可作為水體有機(jī)質(zhì)降解的水產(chǎn)試驗(yàn)菌株。本次試驗(yàn)中得到的芽孢桿菌，雖然在去除氨氮，亞硝酸氮和有機(jī)物的降解等方面作用具有可行性，但其在應(yīng)用實(shí)際生產(chǎn)中的降氨效果與有機(jī)物分解效率還需進(jìn)一步研究。

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