◎ 段文凱，尹 濤，解玲琴

（1.臺(tái)州科技職業(yè)學(xué)院，浙江 臺(tái)州 318000；2.臺(tái)州學(xué)院，浙江 臺(tái)州 318000；3.臺(tái)州恩澤醫(yī)院，浙江 臺(tái)州 318000）

隨著科技的發(fā)展，人們對(duì)食品添加劑和色素的安全性越來(lái)越重視，天然色素的開發(fā)利用已成為食品添加劑和色素發(fā)展使用的總趨勢(shì)。合成色素雖具有色澤鮮艷，著色力強(qiáng)，穩(wěn)定性好，成本較低等優(yōu)點(diǎn)，但合成色素不易降解、化學(xué)合成等特性使其具有嚴(yán)重的慢性毒性和致癌性[1,2]，因而迫切需要尋找一種安全友好的色素替代合成色素。天然食用色素具有色澤自然鮮艷、生物可降解、安全、無(wú)毒等優(yōu)點(diǎn)，已越來(lái)越受到人們的關(guān)注。

花青素是一種類黃酮類天然色素，廣泛存在于草莓、楊梅、葡萄等自然有色植物中[3]，具有很強(qiáng)的抗氧化能力[4]，并可預(yù)防心腦血管疾病、降低心臟病等的發(fā)病危險(xiǎn)[5,6]，是一種應(yīng)用前景十分廣闊的植物功能成分[7-9]。

草莓是薔薇科草莓屬植物的通稱，屬多年生草本植物。草莓中含有豐富的維生素和花青素，是一種很好的花色素類色素資源。我國(guó)草莓栽培面積和產(chǎn)量一直居世界首位[9]，雖然我國(guó)草莓資源豐富，但仍未很好地開發(fā)利用，大多數(shù)僅用于榨汁或直接食用。近年來(lái)，研究人員已研究出多種草莓保鮮的工藝技術(shù)[10-12]，但離真正解決草莓貯藏變質(zhì)問(wèn)題仍很大差距。開展草莓的加工工藝研究不僅可解決草莓的保鮮貯存問(wèn)題，還可擴(kuò)大草莓的消費(fèi)領(lǐng)域。草莓天然色素巨大的應(yīng)用價(jià)值及良好的功效為草莓加工工藝提供一條很好的應(yīng)用研究途徑。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)微波輔助萃取草莓花色素，以AB-8大孔吸附樹脂純化草莓花色素，以期找出草莓色素提取的最佳工藝，為草莓色素和植物天然色素的開發(fā)利用提供重要的理論依據(jù)，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與器材

草莓采收于實(shí)驗(yàn)室，選果實(shí)成熟，色澤鮮艷,大小相近。除去葉、果柄 ,洗凈 ,瀝干水分放于冰箱中冷藏備用。

主要試劑：矢車菊素標(biāo)準(zhǔn)品（Cyanidin-3-O-glucoside），購(gòu) 于Extrasynthèse公 司；DPPH（2,20-diphenyl-1-picrylhydrazyl）購(gòu)自于Sigma公司；乙腈（色譜純），甲酸，乙醇，均購(gòu)自上海化學(xué)試劑有限公司。

主要儀器：微波萃取儀（CEM MARS Xpress，CEM Cooperation，Mattews，NC，USA），HPLC（Waters Corp），HPLC-MS（Waters Corp），冷凍真空干燥儀（美國(guó)Thermo公司），超聲萃取儀（寧波江南儀器有限公司），超低溫冰箱（三洋，日本松下公司），分光光度計(jì)（北京普析通用有限公司），高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)Thermo公司）。

1.2 花青素測(cè)定方法

色素總含量的測(cè)定參考Kim等[13]及Zhou等[14]所述方法 ，將萃取液分別用pH 1.0和pH 4.5的緩沖液以1∶3的比例混勻，然后在520 nm和700 nm下分別測(cè)定吸光度，按公式（1）計(jì)算：

A=（A520－A700）pH1.0 －（A520－A700）pH4.5 （1）式中：A520為520 nm下的吸光值，A700為700 nm下的吸光值；花青素含量按矢車菊素計(jì)算，其摩爾消光系數(shù)為29 600，分子量為484.48，當(dāng)溶液A值為1時(shí)，

溶液的花青素含量為16.38 μg/mL。

1.3 微波萃取方法

取一定量的新鮮草莓，用乙醇做萃取劑，微波（400 W、60 ℃）萃取5 min，測(cè)量草莓花色素含量。

1.3.1 溶劑及最佳提取濃度的確定

在參考大量花青素提取工藝和提取溶劑的安全問(wèn)題后，選擇乙醇作為花色素的提取溶劑，并確定乙醇的最佳提取濃度，準(zhǔn)確稱取4份5 g新鮮草莓，分別加入濃度為25%、50%、75%、100%的乙醇溶液各20 mL，微波（400 W、60 ℃）萃取5 min，4 000 r/min離心5 min，取上清液測(cè)草莓花色素含量。

1.3.2 最佳鹽酸提取濃度的確定

取5 g新鮮草莓，加入20 mL 75%乙醇，分別加入0.1%、0.5%、1.0%、1.5%、2%的鹽酸，搖勻，微波（400 W、60 ℃）萃取5 min，4 000 r/min離心5 min，取上清液測(cè)草莓花色素含量。

1.3.3 最佳料液比的確定

分別稱取5 g新鮮草莓4份，按1∶4、1∶6、1∶8、1∶10的比例與75%的乙醇溶液混合，于60 ℃水浴中提取60 min，冷卻至室溫，4 000 r/min離心5 min，取上清液測(cè)草莓花色素含量。

1.3.4 最佳提取溫度的確定

準(zhǔn)確稱取5 g新鮮草莓4份，分別取濃度為75%的乙醇溶液20 mL混合，于40、60、80、100℃水浴中加熱提取60 min，冷卻至室溫，4 000 r/min離心5 min，取上清液測(cè)草莓花色素含量。

1.3.5 最佳提取時(shí)間的確定

準(zhǔn)確稱取5 g新鮮草莓4份，加入6倍體積的萃取劑，分別于60 ℃水浴中加熱提取5、10、15、20 min，冷卻至室溫，定容至相同體積，4 000 r/min離心5 min，取上清液測(cè)草莓花色素含量。

1.4 大孔樹脂的靜態(tài)吸附與解析方法

在草莓有效成分的純化中，樹脂的選擇十分重要，所選的樹脂不僅要對(duì)純化的成分具有較強(qiáng)的吸附力，而且應(yīng)是可逆吸附，易于洗脫。本實(shí)驗(yàn)選用兩種型號(hào)的常用樹脂，通過(guò)對(duì)比兩種樹脂對(duì)草莓色素含量的吸附率和洗脫率，確定適宜的樹脂。

1.4.1 不同樹脂對(duì)草莓花色素的吸附

準(zhǔn)確稱取2.000 g預(yù)處理好的AB-8大孔樹脂于100 mL錐形瓶中，加入50 mL用設(shè)定pH值的檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液稀釋的花青素粗提物，用封口膜密封，置于設(shè)定溫度恒溫振蕩器上，吸附率公式如式（2）：

式中，Q為吸附率，A0為吸附前溶液中花青素質(zhì)量濃度，mg/mL；A1為吸附后溶液中花青素質(zhì)量濃度，mg/mL。

1.4.2 樹脂解析實(shí)驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取2.000 g吸附飽和的AB-8大孔樹脂于100 mL錐形瓶中，加入50 mL設(shè)定濃度乙醇溶液，用保鮮膜封口，置于設(shè)定溫度恒溫振蕩器上，以110 r/min的轉(zhuǎn)速振蕩，每隔設(shè)定時(shí)間取0.5 mL花青素解析液，測(cè)定吸光值，按公式（3）計(jì)算花青素解析率：

式中，P為解析率，A0為吸附前溶液中花青素質(zhì)量濃度，mg/mL；A1為吸附后溶液中花青素質(zhì)量濃度，mg/mL；A2為解析液中花青素質(zhì)量濃度，mg/mL；V1為吸附液的體積，mL；V2為解析液體積，mL。

1.5 花青素干燥方法

真空干燥：取一定量花色素純化液，在50 ℃下濃縮，濃縮液置于蒸發(fā)皿中，50 ℃揮發(fā)水分，成流動(dòng)性較差的浸膏，50 ℃真空干燥得色素粉末。

2 結(jié)果與討論

2.1 草莓花色素微波提取的最適條件

2.1.1 乙醇濃度對(duì)提取的影響

乙醇濃度對(duì)草莓花青素提取的影響如圖1所示。由圖1可知，草莓色素收率隨乙醇濃度增加而提高，當(dāng)乙醇濃度達(dá)75%后，再升高乙醇濃度草莓花色素提取量呈略有下降的趨勢(shì)，高濃度的乙醇阻礙植物次級(jí)代謝產(chǎn)物的釋放；因此，確定乙醇濃度75%時(shí)為最佳乙醇濃度。

圖1 乙醇濃度對(duì)草莓花青素提取的影響圖

2.1.2 鹽酸濃度對(duì)色素提取的影響

花青素在酸性環(huán)境下穩(wěn)定，在堿性環(huán)境下則易降解，萃取劑酸濃度對(duì)色素萃取收率有較大影響，如圖2所示。由圖2可知，鹽酸濃度增加到1%時(shí)，色素收率達(dá)到最大，繼續(xù)增加鹽酸濃度，并不能提高色素的收率，這可能是鹽酸濃度過(guò)高并不利于草莓花色素的穩(wěn)定性。綜合考慮，后續(xù)實(shí)驗(yàn)選擇1%的鹽酸作為萃取劑。

圖2 鹽酸濃度對(duì)草莓花青素提取的影響圖

2.1.3 料比對(duì)提取的影響

料液比對(duì)草莓色素萃取得率的影響如圖3所示，由圖3可知，草莓色素收率隨料液比增加而增大，但到一定程度后，繼續(xù)增大料液比，對(duì)收率影響較小。這可能是因?yàn)榱弦罕仍龃笥欣谀康漠a(chǎn)物充分接觸萃取溶劑，但當(dāng)料液比增大至一定量時(shí)，目的產(chǎn)物與溶劑接觸完全，再繼續(xù)增大，并不能增大分子碰撞的概率，同時(shí)浸提液越多，濃縮干燥能耗也越大，溶劑用量也越大，綜合考慮，選擇料比為1∶6為實(shí)驗(yàn)的料液比。

圖3 料液比對(duì)草莓花青素提取的影響圖

2.1.4 溫度對(duì)萃取的影響

圖4表明，色素在80 ℃以下收率值變化不大，尤其是60 ℃以下。溫度高于60 ℃時(shí)，色素收率稍有增加，其原因可能是該溶液為色素粗提液，隨著溫度的升高可能其中的糖類等物質(zhì)發(fā)生改變，而使得顏色變深。在一定階段內(nèi)，隨著溫度的升高提取效果也在不斷變優(yōu)異，但如果繼續(xù)升溫，提取效果反而降低。因?yàn)殡m然升溫有利于色素的溶出，但花青素的穩(wěn)定性較差，溫度升高，花青素會(huì)發(fā)生氧化、聚合，導(dǎo)致提取率下降；溫度低時(shí)，花青素與蛋白質(zhì)、纖維等分離較慢，也會(huì)導(dǎo)致提取率下降。100 ℃時(shí)花青素的穩(wěn)定性降低，使得收率變小。故初步確定提取溫度為60 ℃時(shí)的提取效果最好。

圖4 溫度對(duì)草莓花青素提取的影響圖

2.1.5 萃取時(shí)間對(duì)提取的影響

理論上提取時(shí)間越長(zhǎng)，越有利于花青素溶解提取，提取量越大。但由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，花青素的提取量隨提取時(shí)間的不同而不同，如圖5所示。隨著處理時(shí)間的增加，收率逐漸增加，但時(shí)間過(guò)長(zhǎng)會(huì)導(dǎo)致體系溫度過(guò)高，而引起草莓花青素破壞，從而出現(xiàn)收率下降。

圖5 萃取時(shí)間對(duì)草莓花青素提取的影響圖

2.2 大孔樹脂的篩選

將萃取液減壓濃縮，蒸發(fā)乙醇進(jìn)樣。

2.2.1 不同型號(hào)的大孔吸附樹脂對(duì)草莓花色素的吸附情況

取4 g AB-8、D101樹脂，加入25 mL色素（含量為：0.021 mg/L）再加入50 mL pH 1.0的緩沖液，160 r/min搖床震蕩20、40、60、80、100、120 min和360 min，測(cè)定上清液色素含量，按公式（4）計(jì)算吸附率。

式中：C0為花青素吸附前的濃度，C1為花青素吸附后的濃度；由圖6中的結(jié)果可看出，AB-8對(duì)草莓花色素的吸附率較高，對(duì)草莓花色素的吸附能力較強(qiáng)，吸附率達(dá)93.5%，效果最佳。

圖6 靜態(tài)吸附動(dòng)力學(xué)曲線圖

AB-8樹脂是一種球狀、弱極性聚合物吸附劑，其結(jié)構(gòu)中僅有非離子化功能基，并附加親水基團(tuán)?；讵?dú)特的加工方法，AB-8樹脂具有較大的比表面和適宜的孔徑，草莓花色素是可溶于水的弱極性有機(jī)化合物，與AB-8大孔吸附樹脂的表面極性相匹配。這些特性都決定了其對(duì)草莓花色素具有較高的吸附能力。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，后續(xù)的實(shí)驗(yàn)選擇AB-8樹脂作為吸附劑，研究其對(duì)草莓花色素的吸附與解吸情況。

2.2.2 洗脫劑對(duì)AB-8的解析的影響

不同濃度的乙醇解吸液的解吸率如圖7所示。從圖7中可看出，當(dāng)乙醇濃度為80%時(shí)，解吸液的解析率最高，解吸效果最好。乙醇濃度過(guò)高或過(guò)低，解吸效果都會(huì)下降。

圖7 洗脫劑乙醇濃度對(duì)解析率的影響圖

2.2.3 AB-8上柱實(shí)驗(yàn)

柱型號(hào)：60×1.5 cm，上樣pH 1.0，上樣量50 mL×0.021 mg/L，上樣流速60 mL/h ，先用蒸餾水洗120 mL，再用80%的乙醇洗。

由圖8可看出，洗脫劑用量達(dá)到50 mL時(shí)，草莓花色素開始被洗脫下來(lái)，洗脫劑用量達(dá)到140 mL時(shí)，樹脂上的草莓花色素已基本上洗脫完全，故洗脫劑體積應(yīng)控制在140 mL。

圖8 上柱實(shí)驗(yàn)圖

2.3 AB-8循環(huán)使用性能

準(zhǔn)確稱取5.0 g已活化的濕樹脂上柱，分別用80%乙醇溶液及蒸餾水洗凈。取配好的色素溶液在500 nm處測(cè)定吸光度A0=0.807，然后取該色素溶液50 mL進(jìn)行流動(dòng)吸附，控制流速為2 mL/min，測(cè)其流出液吸光度A，結(jié)果見表1。從表1中可以看出，樹脂循環(huán)使用25次后，流出液的吸光度變化不大，樹脂的吸附能力僅降低1.5%。

表1 重復(fù)使用對(duì)樹脂的穩(wěn)定性影響表

3 結(jié)論

（1）草莓花色素最佳提取條件為最佳提取條件為以75%乙醇+1%鹽酸為萃取劑，微波功率400 W、溫度60 ℃、提取時(shí)間15 min、料液比（W/V）1∶6。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可看出，微波和超聲波處理通過(guò)打斷色素與其結(jié)合、破碎組織細(xì)胞，在很大程度上提高草莓花色素的提取率。同時(shí)值得注意的是，微波處理過(guò)度會(huì)引起花色素的破壞。

（2）試驗(yàn)用兩種大孔吸附樹脂中，AB-8樹脂對(duì)草莓花紅色素分離純化較為適宜。據(jù)靜態(tài)吸附和動(dòng)態(tài)吸附實(shí)驗(yàn)，初步確定AB-8型大孔樹脂純化草莓花色素的最佳工藝為：柱型號(hào)：60×1.5 cm，上樣pH 1.0，上樣量50 mL×0.021 mg/L，上樣流速60 mL/h，先用蒸餾水洗120 mL，再用80%的乙醇洗。循環(huán)使用25次以后，吸附率僅降低1.5%。

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