高雨飛　歐陽克蕙　瞿明仁　熊小文　溫慶琪　許蘭嬌

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)江西省動物營養(yǎng)重點實驗室，營養(yǎng)飼料開發(fā)工程研究中心，南昌330045)

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利用MiSeq測序技術(shù)分析錦江牛瘤胃細(xì)菌多樣性

高雨飛歐陽克蕙*瞿明仁熊小文溫慶琪許蘭嬌

(江西農(nóng)業(yè)大學(xué)江西省動物營養(yǎng)重點實驗室，營養(yǎng)飼料開發(fā)工程研究中心，南昌330045)

摘要：本研究旨在利用MiSeq高通量測序技術(shù)揭示錦江牛瘤胃細(xì)菌組成及多樣性。選用3頭裝有永久性瘤胃瘺管的錦江牛成年公牛[體重(400±20) kg]，采集瘤胃液樣品后提取細(xì)菌DNA，對瘤胃細(xì)菌的16S rDNA序列V4～V5區(qū)進行MiSeq測序，分析物種的豐度、分布及α-多樣性。結(jié)果表明：3個樣本共獲得56 763條高質(zhì)量16S rDNA序列，946個分類操作單元(OTU)，錦江牛瘤胃細(xì)菌豐富度指數(shù)Chao指數(shù)、Ace指數(shù)分別為836、841，α-多樣性指數(shù)Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)分別為4.96、0.021 5；經(jīng)過物種注釋，15個門、23個綱、26個科以及44個屬在所有樣品中被鑒定。在門水平，擬桿菌門(Bacteroidetes)(64.37%)、厚壁菌門(Firmicutes)(21.20%)和變形菌門(Proteobacteria)(7.59%)數(shù)量最多；在綱水平，主要包括擬桿菌綱(Bacteroidia)(52.88%)和梭菌綱(Clostridia)(17.03%)；在科水平，主要包括普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)(36.26%)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)(9.33%)和毛螺菌科(Lachnospiraceae)(4.89%)；在屬水平，優(yōu)勢細(xì)菌主要包括普雷沃氏菌屬(Prevotella)(28.97%)、帕拉普氏菌屬(Paraprevotella)(3.08%)、理研菌屬(Rikenella)(2.28%)、梭菌_Ⅳ(Clostridium Ⅳ)(1.77%)、解琥珀酸菌屬(Succiniclastium)(1.62%)和瘤胃球菌屬(Ruminococcus)(1.53%)。結(jié)果證明，錦江牛瘤胃細(xì)菌多樣性相對較低；錦江牛瘤胃中最優(yōu)勢菌門是擬桿菌門，其次是厚壁菌門；普雷沃氏菌屬是錦江牛瘤胃中最優(yōu)勢細(xì)菌屬。

關(guān)鍵詞：錦江牛；瘤胃細(xì)菌；多樣性；MiSeq測序

瘤胃微生物是指棲息在反芻動物瘤胃中的微生物，對反芻動物的生長，特別是消化代謝具有特殊的意義[1-2]。瘤胃微生物與反芻動物的共生現(xiàn)象由來已久，與宿主表現(xiàn)出共進化的特點[3]。因此，瘤胃微生物群落結(jié)構(gòu)是常被用來反映宿主遺傳背景的重要指標(biāo)[4-6]。尤其是其中的瘤胃細(xì)菌，種類最為繁多、數(shù)量最為巨大，不僅是瘤胃微生物中最主要的功能群，而且，相比原蟲而言，瘤胃細(xì)菌種群的種間差異要遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于種內(nèi)差異[6]，更能反映宿主品種的差異性。中國是擁有牛品種最多的國家，但目前在牛方面對瘤胃微生物的研究多以荷斯坦牛等大品種為研究對象[7-8]，對小品種牛，特別是我國特有的牛品種的瘤胃微生物群落結(jié)構(gòu)及多樣性的了解有限。錦江牛屬于我國南方小型黃牛，具有耐熱性好、耐粗飼、役力較強等特點，是極其寶貴的地方品種資源，主要分布于江西省西北部、錦江中游的低丘崗地和平原地區(qū)，2006年調(diào)查存欄量超過100萬頭。目前對錦江牛的研究多集中在資源調(diào)查及營養(yǎng)調(diào)控上，對錦江牛瘤胃微生物的研究尚未見報道。本研究利用MiSeq高通量測序技術(shù)，分析錦江牛瘤胃菌群結(jié)構(gòu)及多樣性，旨在為我國南方黃牛種質(zhì)資源的開發(fā)利用奠定基礎(chǔ)，也為錦江牛微生態(tài)營養(yǎng)的深入研究提供參考。

1材料與方法

1.1樣品采集

選擇3頭安裝有永久性瘤胃瘺管的錦江牛，體重(400±20) kg，供瘤胃液采集。試驗動物單欄飼喂、自由飲水。飼糧精料為玉米-豆粕型，粗料為稻草，精粗比20∶80。每天08:00和17:00飼喂。采樣日于晨喂前采集瘤胃液，4層滅菌紗布擠壓過濾后，分裝后迅速放入液氮罐冷凍，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2基因組DNA提取及MiSeq測序

取0.5 mL瘤胃液樣品進行瘤胃微生物基因組DNA的提取，DNA提取按照天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說明書進行。采用NanoDrop-ND1000測定提取的DNA濃度，并利用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA提取質(zhì)量。提取質(zhì)量合格的DNA樣品，送上海美吉生物公司對細(xì)菌16S rDNA V4～V5區(qū)(515F～907R)進行測序，測序使用Illumina MiSeq PE250測序平臺。

1.3生物信息學(xué)分析

對測得的原始數(shù)據(jù)進行質(zhì)量控制，舍棄低質(zhì)量序列(read尾部堿基質(zhì)量<20，質(zhì)控后的read<50 bp)，獲得的高質(zhì)量序列用Usearch 7.1軟件進行聚類，以16S rDNA序列97%的相似度作為分類操作單元(operational taxonomic unit，OTU)的劃分標(biāo)準(zhǔn)。獲得的OTU與RDP數(shù)據(jù)庫(Release 11.1，http://rdp.cme.msu.edu/)比對，通過RDP Classifier鑒定OTU代表性序列的微生物分類地位。豐富度指數(shù)(Chao、Ace)和α-多樣性指數(shù)(Shannon、Simpson)的計算利用Mothur 1.30.1軟件完成。

2結(jié)果

2.1錦江牛瘤胃菌群的多樣性

經(jīng)數(shù)據(jù)前處理，從3個樣本中獲得56 763條高質(zhì)量16S rDNA序列，平均長度393.74 bp，根據(jù)序列相似性97%水平劃分得到的OTU總數(shù)為946個。在OTU水平，3個樣品的平均豐富度指數(shù)Chao指數(shù)、Ace指數(shù)分別為836、841，α-多樣性指數(shù)Shannon指數(shù)、Simpson指數(shù)分別為4.96、0.021 5。

2.2錦江牛瘤胃菌群結(jié)構(gòu)

本研究中，錦江牛瘤胃細(xì)菌有15個門被鑒定，擬桿菌門(Bacteroidetes)(64.37%)、厚壁菌門(Firmicutes)(21.20%)和變形菌門(Proteobacteria)(7.59%)是相對含量最多的菌門(表1)。其他菌門，如纖維桿菌門(Fibrobacteres)、螺旋體門(Spirochaetes)、黏膠球形菌門(Lentisphaerae)、柔膜菌門(Tenericutes)、疣微桿菌門(Verrucomicrobia)、浮霉菌門(Planctomycetes)、綠彎菌門(Chloroflexi)、互養(yǎng)菌門(Synergistetes)、TM7、迷蹤菌門(Elusimicrobia)、藍(lán)菌門(Cyanobacteria)和裝甲菌門(Armatimonadetes)也存在所有個體中，但相對含量較低。在綱水平，鑒定出23個綱，其中擬桿菌綱(Bacteroidia)和梭菌綱(Clostridia)相對含量最多，分別占總菌的52.88%和17.03%。其次是鞘脂桿菌綱(Sphingobacteria)、γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)和Negativicute。

進一步細(xì)化分類水平，僅有70.29%和54.26%的序列可以鑒定到科和屬。26個科在所有個體中被鑒定，其中普雷沃氏菌科(Prevotellaceae)(36.26%)、瘤胃菌科(Ruminococcaceae)(9.33%)和毛螺菌科(Lachnospiraceae)(4.89%)相對含量最多，其他優(yōu)勢科，包括鞘脂桿菌科(Sphingobacteriaceae)、理研菌科(Rikenellaceae)、琥珀酸弧菌科(Succinivibrionaceae)、紫單胞菌科(Porphyromonadaceae)和氨基酸球菌科(Acidaminococcaceae)等。在屬水平，44種屬在所有樣品中被鑒定。普雷沃氏菌屬(Prevotella)相對含量最多，占總菌的28.97%。其次是帕拉普氏菌屬(Paraprevotella)、理研菌屬(Rikenella)、梭菌_Ⅳ(Clostridium_Ⅳ)、解琥珀酸菌屬(Succiniclastium)和瘤胃球菌屬(Ruminococcus)。

3討論

群落生態(tài)學(xué)可通過單樣品的OTU和α-多樣性分析來反映微生物群落的豐度和多樣性。本研究通過MiSeq測序獲得的錦江牛瘤胃細(xì)菌16S rDNA序列共56 763條，劃分為946個OTU，低于荷斯坦牛(1 800～2 939)[7-8]及牦牛(6 642)[9]的研究結(jié)果。Chao指數(shù)和Shannon指數(shù)也相對荷斯坦牛和牦牛較低(836 vs. 1 311～4 242和4.96 vs. 6.23～8.28)[8-10]。這說明錦江牛瘤胃細(xì)菌的豐富度和多樣性相對較低。瘤胃微生物的多樣性是宿主和瘤胃微生物之間強烈選擇和協(xié)同進化的結(jié)果，宿主動物的進化歷程的差異可能決定其瘤胃的差異[11]。錦江牛主產(chǎn)區(qū)在江西省西北部、錦江中游，屬亞熱帶濕潤氣候區(qū)，狹窄的分布范圍以及溫和的氣候可能導(dǎo)致其瘤胃菌群豐富度和多樣性低。另外，飼糧結(jié)構(gòu)也是影響瘤胃微生物的重要因素。Kobayashi等[12]研究發(fā)現(xiàn)野生動物和半家養(yǎng)動物瘤胃菌群豐富度高于家養(yǎng)動物，認(rèn)為這是由于野生動物和半家養(yǎng)動物飼料的復(fù)雜度相對較大。因此，我們估計飼糧結(jié)構(gòu)的相對單一[以天然牧草(春夏秋)和稻草(冬)為主，冬季補飼少量玉米]可能是引起錦江牛瘤胃菌群豐富度和多樣性低的又一重要原因。

表1　錦江牛瘤胃細(xì)菌在門、綱、科和屬

在大多數(shù)研究中，牛瘤胃中最主要的優(yōu)勢菌群是厚壁菌門，其次是擬桿菌門[9,13-15]。本研究中，錦江牛瘤胃內(nèi)最主要的優(yōu)勢菌是擬桿菌門(64.37%)，厚壁菌門占第2位(21.20%)。也有部分關(guān)于荷斯坦奶牛的研究結(jié)果[7,16]與我們一致，這可能是因為飼糧差異的影響。李亞丹[17]發(fā)現(xiàn)持續(xù)喂養(yǎng)芒草18個月后，湘西黃牛瘤胃中擬桿菌門比例由16.33%上升到28.15%，厚壁菌門比例由68.88%下降到60.92%。當(dāng)給安格斯和荷斯坦牛飼喂高纖維的狗牙根時，也發(fā)現(xiàn)瘤胃細(xì)菌的擬桿菌門增加[10]。低厚壁菌門與擬桿菌門比例可能更常見于高纖維飼糧。與北方牧草相比，南方牧草普遍存在更加易粗老，粗纖維含量高的特點[18]，長期高纖維飼糧可能導(dǎo)致錦江牛瘤胃內(nèi)擬桿菌門數(shù)量增加。

瘤胃微生物在種及亞種的水平上具有較高的多樣性，在屬的階元不多。Jami等[7]采集了16頭泌乳期的奶牛瘤胃內(nèi)容物樣品，通過焦磷酸測序分析，發(fā)現(xiàn)不同個體中有51%的細(xì)菌分類相似，核心菌屬僅有32個。本研究中，有44個屬存在所有個體瘤胃中，其中普雷沃氏菌屬是數(shù)量最多的屬(28.97%)。普雷沃氏菌屬遺傳多樣性高[19-20]，它在瘤胃中發(fā)揮著重要作用，是重要的淀粉降解菌，同時還具有降解蛋白質(zhì)、小肽、多糖等多種代謝產(chǎn)物的能力[21-22]。因此，在牦牛[9]、奶牛[10,15]及其他反芻動物，如馴鹿[23]與山羊[24-25]中，都發(fā)現(xiàn)普雷沃氏菌屬是瘤胃最重要的菌屬。

4結(jié)論

本研究通過MiSeq高通量測序技術(shù)分析了飼喂低精料飼糧的錦江牛瘤胃細(xì)菌區(qū)系。結(jié)果證明，相對其他大品種牛而言，錦江牛瘤胃細(xì)菌多樣性較低；錦江牛瘤胃中最優(yōu)勢菌門為擬桿菌門，其次是厚壁菌門；普雷沃氏菌屬是錦江牛瘤胃中最優(yōu)勢細(xì)菌屬。

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(責(zé)任編輯王智航)

Analysis of Rumen Bacterial Diversity inJinjiangCattle Using MiSeq Sequencing Technology

GAO YufeiOUYANG Kehui*QU MingrenXIONG XiaowenWEN QingqiXU Lanjiao

(Jiangxi Province Key Laboratory of Animal Nutrition, Engineering Research Center of Feed Development, Jiangxi Agricultural University, Nanchang 330045, China)

Abstract:The present study was designed to reveal the rumen bacterial diversity in Jinjiang cattle using MiSeq high-flux sequencing technology. Ruminal liquid samples were obtained from three Jinjiang cattles (bull) weighted (400±20) kg with permanent rumen cannulas. Total DNA was extracted and the 16S rDNA V4 to V5 of bacteria was sequenced by MiSeq sequencing technology. The abundance, distribution and α-diversity index of species were analyzed. The results showed that a total of 56 763 valid 16S rDNA sequences and 946 operational taxonomic unit (OTU) across 3 samples were obtained. The richness indexes, Chao and Ace indexes, of ruminal bacterial were 836 and 841, respectively; and alpha diversity indexes, Shannon and Simpson indexes were 4.96 and 0.021 5, respectively. Fifteen phyla, 23 classes, 26 families and 44 genera were identified via taxonomic summary. The dominant phyla among them were Bacteroidetes (64.37%), Firmicutes (21.20%) and Proteobacteria (7.59%). The most abundant classes were Bacteroidia (52.88%), Clostridia (17.03%), and Prevotellaceae (36.26%). Ruminococcaceae (9.33%) and Lachnospiraceae (4.89%) were the predominant family. At genus level, the high abundance of genera were Prevotella (28.97%), Paraprevotella (3.08%), Rikenella (2.28%), Clostridium Ⅳ (1.77%), Succiniclastium (1.62%) and Ruminococcus (1.53%). In conclusion, the diversity of rumen bacterial community in Jinjiang cattle is low. Bacteroidetes is the predominant phylum and Firmicutes is the second most abundant phylum. Prevolla is the most abundant genus in the rumen bacterial community.[Chinese Journal of Animal Nutrition, 2016, 28(1)：244-248]

Key words:Jinjiang cattle; rumenal bacteria; diversity; MiSeq sequencing

*Corresponding author, professor, E-mail: ouyangkehui@sina.com

中圖分類號：S823；S852.2

文獻標(biāo)識碼：A

文章編號：1006-267X(2016)01-0244-05

作者簡介：高雨飛(1990—)，男，安徽淮北人，碩士研究生，從事反芻動物營養(yǎng)的研究。E-mail： nihaogyf@sohu.com*通信作者：歐陽克蕙，教授，碩士生導(dǎo)師，E-mail： ouyangkehui@sina.com

基金項目：國家自然科學(xué)基金(31260561)；國家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系(nycytx-38)

收稿日期：2015-07-13

doi：10.3969/j.issn.1006-267x.2016.01.031