郝永利，王慶生

(1.環(huán)境保護(hù)部固體廢物與化學(xué)品管理技術(shù)中心，北京 100029；2.中國環(huán)境科學(xué)研究院，北京 100012)

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一株耐氧耐酸堿高效異養(yǎng)硝化菌的篩選及其硝化特性研究

郝永利1，王慶生2

(1.環(huán)境保護(hù)部固體廢物與化學(xué)品管理技術(shù)中心，北京 100029；2.中國環(huán)境科學(xué)研究院，北京 100012)

摘要：通過專一性選擇培養(yǎng)基，從活性污泥中篩選到一株高效異養(yǎng)硝化菌，并對菌株進(jìn)行了鑒定及硝化特性研究。結(jié)果表明，篩選到的異養(yǎng)硝化菌株為芽胞桿菌屬(Bacillus sp.)，命名為GL2。碳源、有機(jī)氮源、C/N、溶解氧及初始pH值均對菌株硝化特性有較大影響，在丁二酸鈉為碳源、硫酸銨為氮源、C/N15、DO 3.8～8.5 mg/L及初始pH值為6～10、氨氮負(fù)荷為420 mg/L條件下，氨氮去除率達(dá)99.7%，顯示出該菌株高效硝化能力。菌株兼具好氧反硝化特性，可實現(xiàn)單級反應(yīng)器的同步硝化反硝化，具有潛在的工程廢水處理應(yīng)用價值。

關(guān)鍵詞：異養(yǎng)硝化；篩選；16S rDNA序列；硝化特性；去除率

在垃圾滲濾液等高氨氮有機(jī)廢水處理過程中，脫氮一直是處理的難點(diǎn)。生物脫氮因具有處理成本低、工藝調(diào)試簡單等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于各類高濃度有機(jī)廢水脫氮工藝中。而異養(yǎng)硝化是一類異養(yǎng)微生物在有氧條件下進(jìn)行硝化脫氮的過程，且異養(yǎng)硝化菌具有生長速度快、環(huán)境適應(yīng)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)[1-2]；因此，異養(yǎng)硝化作為生物脫氮新技術(shù)之一，引起了國內(nèi)外相關(guān)研究者的廣泛關(guān)注。

目前，一系列異養(yǎng)硝化菌被篩選出來，如木糖氧化無色桿菌(Achromobacter xylosoxidans)、糞產(chǎn)堿菌(Alcaligenes faecalis)等[3-4]；但篩選出的異養(yǎng)硝化菌在實際硝化過程中存在生長活性差、生存能力弱及硝化效率低等問題，如H. Y. Zheng等[5]篩選出的菌株，在硝化反應(yīng)過程中亞硝酸鹽嚴(yán)重積累。另外，研究者們在對篩選出的異養(yǎng)硝化菌進(jìn)行硝化特性研究時，多以無機(jī)氮源作為唯一氮源且氨氮起初負(fù)荷較低，因此上述菌株在處理高濃度有機(jī)廢水時，其硝化效果存在很大的不確定性。本研究篩選出一株高效異養(yǎng)硝化菌，并對其硝化特性進(jìn)行詳實的研究，以期為垃圾滲濾液等高氨氮有機(jī)廢水的脫氮處理提供理論支持和候選菌株。

1材料與方法

1.1菌株來源

菌株分離自垃圾滲濾液處理活性污泥。

1.2培養(yǎng)基

富集馴化培養(yǎng)基(L-1)：丁二酸鈉·6H2O 23.85 g；(NH4)2SO42.0 g ；維氏鹽溶液50 mL；pH=7.2。

異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基(L-1)：同富集馴化培養(yǎng)基。

LB活化培養(yǎng)基(L-1)：蛋白胨 10 g；酵母浸膏 5 g；NaCl 5 g；pH=7。

維氏鹽溶液(L-1)： K2HPO45.0 g； MgSO4·7H2O 2.5 g；NaCl 2.5 g； FeSO4·7H2O 0.05 g； MnSO4·H2O 0.05 g。

1.3異養(yǎng)硝化菌株的篩選

1.3.1菌株的富集、初篩

將5 mL打散的活性污泥轉(zhuǎn)接至滅菌富集培養(yǎng)基中，經(jīng)過一段時間的富集馴化培養(yǎng)之后，通過連續(xù)稀釋以及平板劃線純化，然后將單菌落轉(zhuǎn)接到斜面保存。

1.3.2斜面菌株復(fù)篩

將前期初篩菌株分別活化并轉(zhuǎn)接到異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基中進(jìn)行搖床恒溫培養(yǎng)，48 h后取樣測定培養(yǎng)基的氨氮去除率，根據(jù)培養(yǎng)基中氨氮去除率確定復(fù)篩菌株。

1.4菌株形態(tài)學(xué)及理化特性

復(fù)篩菌株的形態(tài)學(xué)特征及其理化特性研究可參照文獻(xiàn)[6-7]的方法實施。

1.5菌株16S rDNA序列分析

1.5.1基因組DNA的提取

基因組DNA的提取參考文獻(xiàn)[8]中的CTAB法。

1.5.216S rDNA序列測序

以基因組DNA為模板擴(kuò)增16S rDNA基因，采用通用引物，常規(guī)PCR反應(yīng)體系進(jìn)行擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)經(jīng)純化后外送測序。

1.5.3菌株系統(tǒng)發(fā)育分析

將測序得到的16S rDNA序列在National Center for Biotechnology Information中進(jìn)行序列相似性比對，選取多株模式菌16S rDNA序列，使用MEGA軟件進(jìn)行多序列比對分析，并構(gòu)建菌株系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.6異養(yǎng)硝化菌株GL2硝化特性研究

1.6.1碳源對菌株GL2硝化特性的影響

分別以乙酸鈉、檸檬酸鈉及丁二酸鈉為培養(yǎng)基唯一碳源，設(shè)置碳氮比(C/N)為10，以體積比為1%的接種量接種到100 mL培養(yǎng)液中，置于30 ℃搖床培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min。培養(yǎng)過程中每隔8 h取樣測定培養(yǎng)基中pH值、OD600及氨氮濃度。

1.6.2C/N對菌株GL2硝化特性的影響

改變培養(yǎng)基中丁二酸鈉的量，將C/N分別調(diào)整為2、4、8、10和15，以體積比為1%的接種量接種到培養(yǎng)液中，置于30 ℃搖床培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min。取樣及指標(biāo)測定同1.6.1節(jié)。

1.6.3初始pH值對菌株GL2硝化特性的影響

將培養(yǎng)基中的pH值分別調(diào)整為5、6、8、9和10，以體積比為1%的接種量，將菌株轉(zhuǎn)接至培養(yǎng)液中，置于30 ℃搖床培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min。取樣及指標(biāo)測定同1.6.1節(jié)。

1.6.4DO對菌株GL2硝化特性的影響

分別設(shè)定搖床轉(zhuǎn)速為100、140、180及220 r/min。對應(yīng)DO分別為3.8、5.2、7.0及8.5 mg/L。將菌株以1%接種量接入培養(yǎng)液中，置于30 ℃搖床培養(yǎng)，取樣及指標(biāo)測定同1.6.1節(jié)。

1.6.5有機(jī)氮源對菌株GL2硝化特性的影響

在異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基中分別添加1%的玉米漿、牛肉膏、蛋白胨以及酵母膏，以原異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基作為對照，取樣及指標(biāo)測定同1.6.1節(jié)。

1.6.6菌株GL2好氧反硝化特性考察

將菌株GL2轉(zhuǎn)接至異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基中，置于30 ℃搖床培養(yǎng)，搖床轉(zhuǎn)速為180 r/min，培養(yǎng)24 h后取樣，定量測定NH4+-N、NO2--N、NO3--N及羥胺濃度。

1.7分析方法[9-10]

本研究分析方法詳見表 1。

表1　分析方法

2結(jié)果與討論

2.1異養(yǎng)硝化菌株的篩選

通過對活性污泥連續(xù)數(shù)月的富集以及平板初篩，獲得初篩菌株102株，將初篩菌株分別接入異養(yǎng)硝化液體培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)定量測定氨氮去除率，獲得1株硝化效果最好的異養(yǎng)硝化菌株，編號GL2。選取該菌株進(jìn)行后續(xù)硝化特性研究。

2.2菌株GL2形態(tài)學(xué)和理化特性

將菌株GL2在瓊脂平板上培養(yǎng)48 h，菌落呈圓形，表面光滑，邊緣整齊，部分菌落呈半透明，部分菌落呈不透明。菌株GL2的形態(tài)學(xué)特征如圖1所示。觀察細(xì)胞大小為(0.3～0.5)μm×(1.0～2.5)μm，其理化特性見表2。

圖1　菌株GL2形態(tài)學(xué)特征

理化指標(biāo)結(jié)果理化指標(biāo)結(jié)果葡萄糖氧化+色氨酸脫氨酶-接觸酶+精氨酸雙水解酶-氧化酶+鳥氨酸脫羧酶-V-P+明膠液化+甲基紅+Tween80-4℃生長+硫化氫+42℃生長+酪素水解+淀粉水解-吲哚-

注：表中“+”表示陽性；“-”表示陰性。

2.3菌株GL2系統(tǒng)發(fā)育分析

菌株GL2系統(tǒng)發(fā)育樹如圖2所示。將獲得的GL2 16S rDNA序列在數(shù)據(jù)庫EzTaxon server 2.1中進(jìn)行比對，比對結(jié)果發(fā)現(xiàn)，菌株GL12的16S rDNA基因序列與Bacillus(屬)中多數(shù)菌種的16S rDNA基因序列相似度>99%。其中與菌株Bacillus pumilus ATCC 7061(T)的16S rDNA基因序列的相似度達(dá)到99.9%，結(jié)合GL12形態(tài)學(xué)特征和理化特征，初步認(rèn)定GL2屬于Bacillus sp.，將其命名為Bacillus sp.GL2。

圖2　菌株GL2系統(tǒng)發(fā)育樹

2.4異養(yǎng)硝化菌株GL2硝化特性研究

2.4.1碳源對菌株GL2硝化特性的影響

在異養(yǎng)硝化過程中，碳源為微生物的生長提供能量及合成產(chǎn)物的碳架，對微生物硝化過程具有重要的影響[11]。結(jié)合國內(nèi)外研究者針對異養(yǎng)硝化菌硝化所需碳源的選擇，研究選取乙酸鈉、丁二酸鈉及檸檬酸鈉等3種碳源進(jìn)行菌株GL2異養(yǎng)硝化特性研究。碳源對菌株GL2硝化特性的影響如圖3所示。由圖3可知，3種碳源對GL2的生長及脫氮特性影響較大，檸檬酸鈉和丁二酸鈉能顯著促進(jìn)GL2的生長及氨氮的去除，且丁二酸鈉效果好于檸檬酸鈉，氨氮去除率分別達(dá)92.2%和88.1%。培養(yǎng)基的pH值也隨著碳源的利用產(chǎn)生OH-而呈現(xiàn)不斷升高的趨勢。而在乙酸鈉的培養(yǎng)基中則沒有效果，甚至氨氮濃度反而有所上升，這與吳建江等[12]的研究結(jié)果類似，分析原因可能是前兩類碳源作為速效碳源，大大有利于微生物相關(guān)代謝循環(huán)的進(jìn)行，而底物乙酸鈉不能夠及時誘導(dǎo)菌株GL2產(chǎn)生相關(guān)代謝酶系，導(dǎo)致菌株不能進(jìn)行正常的新陳代謝，出現(xiàn)老化裂解死亡，從而釋放胞內(nèi)氮，使培養(yǎng)基氨氮濃度升高。綜上所述，在后續(xù)研究中應(yīng)以丁二酸鈉作為異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基中唯一碳源。

圖3　碳源對菌株GL2硝化特性的影響

2.4.2C/N對菌株GL2硝化特性的影響

相關(guān)研究表明，在菌株異養(yǎng)硝化過程中，培養(yǎng)基的碳氮比越高，菌株獲得的能量越充足，菌株的生長及異養(yǎng)硝化活性越好[13]，研究異養(yǎng)硝化菌株GL2硝化反應(yīng)所需的最適碳氮比對其在實際廢水硝化脫氮應(yīng)用中具有重要意義。碳氮比對菌株GL2生長及異養(yǎng)硝化特性的影響如圖4所示。由圖4可知，培養(yǎng)基中C/N比越高越有利于菌株GL2的生長，菌株異養(yǎng)硝化活性越高，同時培養(yǎng)基內(nèi)pH值升高趨勢也越顯著。在C/N為2時，由于菌體生長所需碳源嚴(yán)重不足，導(dǎo)致菌體生長緩慢，同時培養(yǎng)基中pH值后期出現(xiàn)下降的現(xiàn)象，這可能是由于菌體自溶后，釋放出胞內(nèi)的酸性物質(zhì)所致。隨著培養(yǎng)基C/N的不斷升高，菌株GL2的生長特性及異養(yǎng)硝化特性得以恢復(fù)并加強(qiáng)，尤其在C/N為15時，培養(yǎng)基中氨氮?dú)埩袅績H為2.1 mg/L，氨氮去除率高達(dá)99.5%，無論在氨氮負(fù)荷耐受能力方面，還是在氨氮去除率方面，菌株GL2均優(yōu)于目前分離出的絕大多數(shù)異養(yǎng)硝化菌[14-15]。垃圾滲濾液等高濃度有機(jī)廢水的C/N一般均>15，因此，菌株GL2對于此類廢水的脫氮處理具有很大的潛在應(yīng)用價值。

圖4　C/N對菌株GL2硝化特性的影響

2.4.3初始pH值對菌株GL2硝化特性的影響

環(huán)境中的pH能夠影響微生物營養(yǎng)物質(zhì)的可給性，同時也會影響到微生物細(xì)胞內(nèi)代謝酶系的活性，對菌株生長和異養(yǎng)硝化過程有著較大的影響，菌株對pH值的適應(yīng)性將會成為其能否進(jìn)行高效脫氮反應(yīng)的關(guān)鍵[16]。pH值對GL2異養(yǎng)硝化特性的影響如圖5所示。當(dāng)pH值為5時，GL2幾乎不能進(jìn)行生長及進(jìn)行硝化反應(yīng)，說明低pH值條件抑制了菌體誘導(dǎo)酶的合成，同時大大降低了菌體合成酶的活性，導(dǎo)致GL2既不能正常生長又不能進(jìn)行硝化代謝。當(dāng)pH值為6～10時，GL2能很好地生長并進(jìn)行硝化反應(yīng)，平均氨氮去除率>99.0%，最大的氨氮去除率高達(dá)99.7 %。而目前分離出的異養(yǎng)硝化菌大都只能在中性偏堿性的條件下才能進(jìn)行較好的硝化反應(yīng)，如李衛(wèi)芬等[17]的研究表明，菌株F1在pH>8時就表現(xiàn)出菌株長勢減弱、反硝化硝化效率降低的現(xiàn)象。吳建江等篩選出的異養(yǎng)硝化菌XS76雖然也能適應(yīng)較寬的pH域，但是其氨氮去除率較低，最高為99.0%。GL2上述特性表明其具有較廣的pH適應(yīng)力，在pH值為6～10時，均可以進(jìn)行快速生長脫氮，其pH耐受范圍優(yōu)于目前分離出的絕大多數(shù)異養(yǎng)硝化菌株。

圖5　初始pH值對菌株GL2硝化特性的影響

2.4.4DO對菌株GL2硝化特性的影響

DO的大小直接影響菌株生長及代謝活性，在微生物生長環(huán)境中，DO過低或過高均會減緩或抑制菌體的生長[18-20]。本研究通過改變搖床轉(zhuǎn)速來調(diào)節(jié)培養(yǎng)基中的DO。對菌株GL2硝化特性的影響如圖6所示。由圖6可知，在其他因素相同的條件下，當(dāng)搖床轉(zhuǎn)速越高，菌株生長及氨氮去除活性越高。當(dāng)DO為3.8 mg/L時，GL2的生長及氨氮去除出現(xiàn)一定程度延遲，但當(dāng)DO分別為5.2、7.0及8.5 mg/L時，菌株GL2的菌體密度、培養(yǎng)基pH值以及氨氮去除率相差無幾，氨氮去除率均能達(dá)到99.0%以上，說明菌株GL2在一定范圍內(nèi)不受DO大小的影響，具有較好的DO耐受性；因此，在實際工程廢水處理中，只要能夠?qū)O值控制在5.2～8.5 mg/L，GL2就能夠進(jìn)行快速生長及高效硝化反應(yīng)，縮短廢水脫氮工藝的調(diào)試周期，節(jié)省調(diào)試投入成本。

圖6　DO對菌株GL2硝化特性的影響

2.4.5有機(jī)氮源對菌株GL2硝化特性的影響

在垃圾滲濾液一類高濃度有機(jī)廢水中，有機(jī)氮會在氨化細(xì)菌的作用下發(fā)生氨化反應(yīng)，導(dǎo)致廢水中氨氮濃度的升高。何霞等[21]研究發(fā)現(xiàn)，在菌株Bacillus sp. LY培養(yǎng)過程中，由于氨化反應(yīng)產(chǎn)生的氨氮的量大于菌株LY利用量，導(dǎo)致氨氮濃度增加了98.0 mg/L。由圖7可知，在GL2培養(yǎng)初期，蛋白胨和牛肉膏有機(jī)氮源組，尤其是蛋白胨有機(jī)氮源組氨化作用要顯著強(qiáng)于硝化作用，因而對應(yīng)培養(yǎng)基中的氨氮濃度迅速上升，而此后則主要通過異養(yǎng)硝化作用而使氨氮濃度不斷下降，表明菌株的有機(jī)氮去除能力相對較強(qiáng)。且相比于無機(jī)氮源，GL2在有機(jī)氮源中生長更快，硝化活性更高。這表明GL2氮源底物利用范圍較廣，有利于高濃度廢水脫氮處理應(yīng)用。

圖7 有機(jī)氮源對菌株GL2硝化特性的影響

2.4.6菌株GL2好氧反硝化特性考察

目前，分離出的少數(shù)異養(yǎng)硝化菌具有好氧反硝化特性[22]。為考察菌株GL2是否具有好氧反硝化特性，本研究對菌株GL2進(jìn)行了培養(yǎng)基氮素平衡的考察。由表3可知，GL2經(jīng)過24 h的培養(yǎng)，被GL2同化吸收的氨氮約為57.7 %，同時通過GL2反硝化作用去除的氨氮約為40.7 %，反應(yīng)末期硝酸鹽氮積累僅約為2.8 mg/L。上述結(jié)果表明，異養(yǎng)硝化菌株GL2具有好氧反硝化特性，可實現(xiàn)單一反應(yīng)器內(nèi)同步硝化反硝化脫氮反應(yīng)。

表3　菌株GL2的反硝化功能

3結(jié)語

綜上所述，可以得出如下結(jié)論。

1)通過傳統(tǒng)微生物學(xué)技術(shù)從活性污泥中篩選到1株高效異養(yǎng)硝化菌GL2，經(jīng)過菌種鑒定，初步認(rèn)定菌株GL2為芽孢桿菌屬(Bacillus sp.)，命名為Bacillus sp.GL2。

2)碳源、C/N、溶解氧(DO)、初始pH值及有機(jī)氮源均對菌株硝化特性有較大影響，在丁二酸鈉為碳源、硫酸銨為氮源、碳氮比為15、溶解氧為3.8～8.5 mg/L和pH值為6～10的條件下，氨氮去除率最高達(dá)99.7%，顯示出該菌株耐氧耐酸堿的高效硝化能力。

3)菌株GL2經(jīng)過24 h的培養(yǎng)，培養(yǎng)基中約40.7%的氮通過反硝化作用以氣體的形式釋放，具有同步硝化反硝化特性，可實現(xiàn)單一反應(yīng)器內(nèi)同步硝化反硝化脫氮反應(yīng)，可作為實際廢水硝化處理的備用菌源。

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責(zé)任編輯馬彤

Research on Screening and Nitrification Characteristics of a Efficiently Heterotrophic Nitrifier Resistanting Oxygen, Acid and Alkali

HAO Yongli1, WANG Qingsheng2

(1.Solid Waste and Chemicals Management Center, MEP, Beijing 100029， China；2.Chinese Research Academy of Environmental Sciences, Beijing 100012， China)

Abstract：A heterotrophic nitrifier is isolated from the activated sludge of landfill leachate through specific select medium. It is identified as Bacillus sp. named as GL2. Its nitrification function is studied to show that the factors including carbon source, C/N, pH, DO and organic nitrogen are important for nitrification of strain GL2. The optimized condition for nitrification is as follows: sodium succinate as the carbon resource, C/N of 15, pH of 6-10, DO of 3.8-8.5 mg/Land the initial ammonia nitrogen of 420 mg/L. Combining these conditions, the removal rate of ammonia nitrogen reaches 99.7%. The strain has the capability to achieve aerobic denitrification. These results show that strain GL2 with highly effective heterotrophic nitrification could achieve simultaneous nitrification and denitrification.Hence, the strain GL2 could have high potential in practical wastewater treatment.

Key words:heterotrophic nitrification， screening， 16S rDNA sequence, nitrification characteristics， removal rate

收稿日期：2015-12-01

作者簡介：郝永利(1976-)，男，工程師，碩士，主要從事固體廢物及水污染防治技術(shù)研究及管理等方面的研究。

中圖分類號：X 172

文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A