葉曉鋒，張芳，朱軍莉，張蕾，謝杜梅浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310035

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EGCG抑制波羅的海希瓦氏菌生物被膜和腐敗活性的研究

葉曉鋒，張芳，朱軍莉*，張蕾，謝杜梅
浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310035

摘要：以海產(chǎn)品腐敗菌波羅的海希瓦氏菌（Shewanella baltica）為對象，評價(jià)了兒茶素單體抑制生物被膜的效果，并分析效果最佳的單體對該菌生物被膜和腐敗活性的影響。結(jié)果表明，5種兒茶素單體均能抑制S.baltica生物被膜形成，其中表沒食子兒茶素沒食子酸酯（Epigallocatechin gallate，EGCG）抑制率最高，其最小抑菌質(zhì)量濃度為40 μg·mL(-1)，亞抑菌質(zhì)量濃度10～30 μg·mL(-1)的EGCG對細(xì)菌生長無顯著影響。在30 μg·mL(-1)EGCG作用下，群體感應(yīng)（Quorum sensing，QS）信號分子呋喃酮酰硼酸二酯（Autoinducer-2，AI-2）、二酮哌嗪類化合物（Diketopiperazine，DKPs）cyclo-(L-Pro-L-Leu)和cyclo-(L-Pro-L-Phe)活性顯著下降（P<0.05），其抑制率分別為63.95%、27.43%和21.94%。亞抑菌濃度EGCG能顯著抑制S.baltica生物被膜形成、泳動(dòng)能力和蛋白酶活性（P<0.05），呈現(xiàn)濃度依賴性，在30 μg·mL(-1)時(shí)抑制率分別為55.18%，66.71%和46.67%。因此，EGCG在亞抑菌濃度下能夠干擾S.baltica的QS系統(tǒng)，有效抑制生物被膜形成，減弱致腐能力，研究為EGCG作為新型的QS抑制劑調(diào)控食品腐敗菌奠定基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：波羅的海希瓦氏菌；EGCG；生物被膜；腐敗；群體感應(yīng)；抑制

波羅的海希瓦氏菌（Shewanella baltica）為希瓦氏菌屬（Shewanella）、交替單胞菌科（Alteromonadaceae），革蘭氏陰性嗜冷菌，產(chǎn)H2S，具有還原氧化三甲胺為三甲胺的能力，是大黃魚等多種海產(chǎn)品在冷藏過程中品質(zhì)下降的特定腐敗菌[1-2]。生物被膜是指細(xì)菌嵌入自身分泌的多糖、蛋白質(zhì)和DNA等多聚物所組成的一種結(jié)構(gòu)化聚合體，是細(xì)菌為適應(yīng)自然環(huán)境而特有現(xiàn)象，極易在食品加工器材的表面形成。研究表明，希瓦氏菌、假單胞菌等水產(chǎn)品腐敗菌均以生物被膜形式生長，被膜菌對保鮮劑、抑菌劑及物理損傷的抵抗能力可以提高數(shù)百倍，很難被清除，從而導(dǎo)致持續(xù)性污染，給水產(chǎn)品加工和保鮮帶來嚴(yán)重危害[3-4]。

已有大量研究表明，群體感應(yīng)（Quorum sensing，QS）參與多種細(xì)菌的生物被膜形成以及調(diào)控致病和致腐能力[5-6]。QS是一種細(xì)菌種間和種內(nèi)信息交流的調(diào)控機(jī)制，細(xì)菌產(chǎn)生信號分子（Autoinducer，AI）并釋放到環(huán)境中去，當(dāng)環(huán)境中的信號分子濃度達(dá)到一定閾值后，開啟細(xì)胞密度依賴的特定基因的表達(dá)[7]。QS調(diào)控多種基因的表達(dá)，包括生物被膜形成、發(fā)光、毒力因子釋放、泳動(dòng)能力、蛋白酶活性等[8]。研究表明，大多數(shù)革蘭氏陰性菌能夠產(chǎn)高絲氨酸內(nèi)酯（N-acyl-L-homoserine lactones，AHLs）以及用于種間交流的AI-2。近年來，在S.baltica中還檢測到AI-2活性，并發(fā)現(xiàn)了新型信號分子——二酮哌嗪類化合物（Diketopiperazine，DKPs）[6,9]。

干擾細(xì)菌的QS來抑制生物被膜形成和致腐能力，這一途徑的利用為食品保鮮提供一了種嶄新、有效的思路。已有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，植物提取物能通過抑制細(xì)菌QS來減弱致病菌毒力或腐敗菌致腐能力[10-12]。表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）是綠茶中含量最豐富的一種多酚類抗氧化物，綠茶的抑菌、抗氧化等生物活性均與EGCG密切相關(guān)[13]。EGCG分子中有多個(gè)酚羥基，具有很強(qiáng)的抗氧化、清除自由基、抑菌和抑制細(xì)菌毒力的性能[14-15]。目前，針對EGCG的研究主要集中在抑菌和抗氧化活性方面，而鮮有報(bào)道EGCG對腐敗菌生物被膜形成以及QS的影響。鑒于此，本研究評價(jià)EGCG在亞抑菌濃度下對S.baltica生物被膜形成、QS活性、游動(dòng)能力、胞外蛋白酶活性的抑制效果，以期為EGCG在海產(chǎn)品貯藏保鮮中的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試劑和培養(yǎng)基

兒茶素（C）、表兒茶素（EC）、沒食子兒茶素（EGC）、表兒茶素沒食子酸酯（ECG）和表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）均為分析純（阿拉丁公司），DKPs化合物[cyclo-(L-Pro-L-Phe)，cyclo-(L-Pro-L-Leu)]（上海生工生物工程股份有限公司），純度高于98%。LB、TSB培養(yǎng)基、蛋白胨、瓊脂等培養(yǎng)基成分（青島海博生物有限公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

酶標(biāo)儀：VICTOR X，美國Perkin Elmer公司；氣相色譜儀：Agilent 6890N，美國Agilent公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：EYELA N-1100，東京理化公司；24孔平板：美國Costar公司；紫外可見分光光度計(jì)：UV-2550，日本島津公司；生化培養(yǎng)箱：LRH-250A，廣東省醫(yī)療器械廠；滅菌鍋：LDZM-40KCS，上海申安醫(yī)療器械廠。

1.3方法

1.3.1 菌種的活化

腐敗菌S.baltica XH2從大黃魚中分離，并鑒定為特定腐敗菌[16]。取S.baltica XH2甘油菌100 μL于5 mL無菌LB肉湯中，28℃，200 r·min-1搖床培養(yǎng)12 h，重復(fù)活化兩次，備用。

1.3.2 茶多酚單體篩選

將C、EC、EGC、ECG、EGCG 5種單體分別溶解于二甲基亞砜（DMSO）。取1%過夜活化菌接種于TSB培養(yǎng)基中，分裝至24孔板，加入質(zhì)量濃度為30 μg·mL-15種兒茶素單體，以DMSO為空白對照組，25℃靜置培養(yǎng)48 h后，采用結(jié)晶紫法定量測定生物被膜[10]。具體為：培養(yǎng)后的生物被膜棄去培養(yǎng)基，加入PBS漂洗3次去除浮游菌，在60℃固定30 min后，每孔加入0.2%的結(jié)晶紫溶液，染色15 min后棄去，再用PBS漂洗3次，干燥后，用33%冰乙酸溶解，于波長600 nm測定OD值，每組5個(gè)平行。

1.3.3 最小抑菌濃度（MIC）測定

參考王艷等[17]的方法，取1%過夜活化的菌液接種于LB肉湯，分別加入質(zhì)量濃度為5、10、20、40、80、160 μg·mL-1的EGCG，以DMSO為對照，于28℃培養(yǎng)24 h，在波長600 nm處測定吸光度，每組3個(gè)平行。

1.3.4 生物被膜定量分析

取1%過夜活化的菌液于TSB培養(yǎng)基，搖勻分裝至24孔板，分別加入質(zhì)量濃度為10、20、30 μg·mL-1的EGCG，以DMSO為空白對照，25℃靜置培養(yǎng)48 h，采用1.3.2方法定量測定生物被膜。

1.3.5 AI-2活性分析

參考趙二科等[18]的方法。具體為S.baltica在含有濃度為0、10、20、30 μg·mL-1EGCG的LB肉湯中搖床培養(yǎng)9 h后，離心（10 465 r·min-1，10 min），取上清，過膜（0.22 μm）。取過夜活化后的V.harveyi BB170報(bào)告菌株用AB培養(yǎng)基以1∶5 000進(jìn)行稀釋，取90 μL稀釋的報(bào)告菌液和10 μL上述無菌上清液加到96孔酶標(biāo)板中，AB培養(yǎng)基為空白對照。在熒光酶標(biāo)儀測定，模式為OPS，檢測熒光值，溫度選擇30℃，間隔時(shí)間為0.5 h，連續(xù)測定7 h。

1.3.6 DKPs活性分析

參考Gu等[9]的方法，稍作修改。將DKPs化合物[cyclo-(L-Pro-L-Phe）、cyclo-(L-Pro-LLeu)]配置成單一及混合標(biāo)準(zhǔn)液，采用氣相色譜（Gas chromatography，GC）測定其種類及濃度，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。GC條件：HP-5ms毛細(xì)柱（30 m×0.25 mm×0.25 nm，Agilent），高純氦氣（>99.999%）作為載氣，載氣恒流流速1.0 mL·min-1，分流比20∶1，進(jìn)樣口溫度為260℃，進(jìn)樣量為l μL。升溫程序?yàn)椋浩鹗紲囟?0℃，保持2 min，以15℃·min-1的速率上升至260℃，保持8 min。取1%活化菌液接種于50 mL LB培養(yǎng)基中，分別加入工作濃度為10，20，30 μg·mL-1EGCG，對照組加入等量DMSO，在28℃搖床培養(yǎng)12 h，離心（10 465 r·min-1，10 min），取上清液，用等體積氯仿萃取3次，收集有機(jī)相，37℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，用氯仿重新溶解，定容至1 mL，過膜后樣品經(jīng)GC分析，并計(jì)算DKPs的含量變化。

1.3.7 游動(dòng)能力分析

參考Packiavathy等[10]方法，略作修改。取20 mL Swimming培養(yǎng)基（蛋白胨1%，NaCl 0.25%，瓊脂0.3%），冷卻至45℃，分別加入質(zhì)量濃度為10、20、30 μg·mL-1的EGCG，以DMSO為對照，混合倒在平板上，待凝固干燥后，吸取5 μL活化菌液點(diǎn)在平板中央上，在25℃培養(yǎng)36 h觀察細(xì)菌泳動(dòng)性。

1.3.8 胞外蛋白酶測定

取20 mL的脫脂奶培養(yǎng)基（脫脂奶粉1%，瓊脂糖1%，105℃下滅菌10 min），冷卻至45℃，分別加入質(zhì)量濃度為10、20、30 μg·mL-1的EGCG，以DMSO為對照，混合倒在平板上，待凝固干燥后，吸取5 μL活化菌液點(diǎn)在平板中央上，在25℃培養(yǎng)36 h觀察透明圈。

1.3.9 數(shù)據(jù)分析

每組樣品至少3次重復(fù)，采用Microsoft Excel和Origin 8.5進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和作圖，并用SPSS17.0的ANOVA進(jìn)行方差分析，P<0.05為差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 茶多酚單體篩選

如圖1所示，兒茶素（C）、表兒茶素（EC）、兒茶素沒食子酸酯（ECG）、沒食子兒茶素（EGC）、沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）5種單體在質(zhì)量濃度30 μg·mL-1時(shí)對S.baltica生物被膜均具有抑制作用，抑制率分別為42.85%、18.73%、50.75%、51.86%和59.26%，其中EGCG的抑制作用最為顯著（P<0.05）。因此，選用EGCG為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的兒茶素單體。

2.2 EGCG對S.baltica的最小抑菌濃度

如圖2所示，通過二倍稀釋法測定EGCG 對S.baltica的最小抑菌濃度。結(jié)果顯示EGCG 對S.baltica最小抑菌質(zhì)量濃度為40 μg·mL-1，隨著濃度的增加抑制效果顯著增強(qiáng)。5～20 μg·mL-1的EGCG對細(xì)菌生長無顯著影響，因此，選取10、20、30 μg·mL-1亞抑菌濃度的EGCG進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖1　5種兒茶素單體對S.baltica生物被膜的抑制Fig.1 Inhibition of five catechin monomers on S.baltica biofilm

2.3 EGCG對S.baltica AI-2信號分子的影響

亞抑菌濃度下EGCG對S.baltica AI-2信號分子的影響如圖3所示。在質(zhì)量濃度10、20、30 μg·mL-1時(shí)，EGCG對S.baltica AI-2活性的抑制率分別為44.53%、50.09%和63.95%。與DMSO對照組相比，亞抑菌濃度下的EGCG對S.baltica AI-2活性表現(xiàn)出顯著的抑制作用（P<0.05），呈現(xiàn)濃度依賴性。

2.4 EGCG對S.baltica DKPS信號分子的影響

圖4為DKPs化合物[(cyclo-(L-Pro-L-Phe)，cyclo-(L-Pro-L-Leu)]混合標(biāo)準(zhǔn)溶液和S.baltica上清液中DKPs的氣相色譜圖譜。在該GC條件下樣品中cyclo-(L-Pro-L-Leu)和cyclo-(L-Pro-L-Phe)得到有效分離，保留時(shí)間分別為15.26、18.73 min，且基線穩(wěn)定，干擾峰少。亞抑菌濃度EGCG對S.baltica DKPS信號分子的影響，結(jié)果如圖3所示，在30 μg·mL-1EGCG作用下，cyclo-(L-Pro-L-Leu)和cyclo-(L-Pro-L-Phe)抑制率分別為27.43%、21.94%。

2.5 EGCG抑制S.baltica生物被膜形成

通過結(jié)晶紫染色法評價(jià)亞抑菌濃度下EGCG對S.baltica生物被膜形成的影響，如圖5所示。結(jié)果發(fā)現(xiàn)EGCG對S.baltica生物被膜形成起顯著的抑制作用（P<0.05）。經(jīng)48 h培養(yǎng)后，10、20、30 μg·mL-1的EGCG對S.baltica生物被膜抑制率分別達(dá)到了16.15%、32.55%、55.18%。

2.6 EGCG抑制S.baltica的游動(dòng)能力

圖6為亞抑菌濃度下EGCG對S.baltica泳動(dòng)能力的影響。EGCG對S.baltica游動(dòng)能力具有抑制作用，并且隨著濃度的增加，抑制作用更加明顯。S.baltica對照組在平板上擴(kuò)散圈直徑約為(64±0.3)mm，10、20、30 μg·mL-1的EGCG作用后，S.baltica游動(dòng)能力明顯受到抑制，其抑制率分別為8.34%、20.86%和66.71%。

圖2　EGCG對S.baltica的最小抑菌濃度Fig.2 MIC of EGCG against S.baltica

圖3　亞抑菌濃度EGCG對S.baltica AI-2活性的影響Fig.3 Effect of EGCG at sub-MIC on AI-2 activities in S.baltica

圖4　DKPs混合標(biāo)準(zhǔn)品和S.baltica上清液中DKPs氣相色譜圖Fig.4 Gas chromatography of DKPs mixed standards and DKPs in S.baltica cell supernate

圖5　亞抑菌濃度EGCG對S.baltica生物被膜的影響Fig.5 Effect of EGCG at sub-MIC on biofilm development of S.baltica

2.7 EGCG抑制S.baltica胞外蛋白酶活性

采用脫脂奶平板法初步評價(jià)S.baltica蛋白酶活性。如圖7所示，S.baltica對照組在脫脂奶平板上形成的水解透明圈直徑約有(30±0.2)mm，而添加10、20、30 μg·mL-1EGCG的脫脂奶平板中，形成的水解透明圈直徑明顯減小，分別為(30±0.2)mm、(22±0.2)mm、(16±0.2)mm，抑制率最大達(dá)到46.67%。提示亞抑菌濃度的EGCG能夠有效抑制S.baltica胞外蛋白酶活性，并且也呈現(xiàn)濃度依賴性。

3 討論

S.baltica是多種海產(chǎn)品中的特定腐敗菌，生物被膜和QS系統(tǒng)在其腐敗過程中起著重要作用，因此急需尋找一種良好的抗S.baltica生物被膜及抗QS活性的物質(zhì)。本研究發(fā)現(xiàn)茶多酚5種單體在亞抑菌濃度下均表現(xiàn)出一定的生物被膜抑制作用，其中EGCG抑制能力最強(qiáng)。Asahi等[19]也發(fā)現(xiàn)EGCG能夠有效抑制生物被膜形成，其中10 μg·mL-1的EGCG亞抑菌濃度對牙齦卟啉單胞菌（Porphyromonas gingivalis）生物被膜抑制率達(dá)到60%。

圖6　不同濃度EGCG對S.baltica游動(dòng)能力影響Fig.6 Effect of EGCG at sub-MIC on swimming motility of S.baltica

圖7　不同濃度EGCG對S.baltica胞外蛋白酶活性的影響Fig.7 Effect of EGCG at sub-MIC on exoprotease activity of S.baltica

信號分子是細(xì)菌QS系統(tǒng)中的重要組成部分。本研究發(fā)現(xiàn)亞抑菌濃度下EGCG對S.baltica的AI-2和DKPs化合物[cyclo-(L-Pro-L-Phe)和cyclo-(L-Pro-L-Leu)]信號分子均有顯著抑制，特別是抑制AI-2活性。Lee等[11]報(bào)道在亞抑菌濃度下（25 μg·mL-1）的EGCG對大腸桿菌（Escherichia coli）O157：H7 AI-2的抑制率達(dá)到了85%。然而，EGCG對細(xì)菌DKPs的抑制報(bào)道仍較少。許多植物提取物在亞抑菌濃度下均有QS抑制活性，如姜黃素、肉桂醛等，通過減少胞外上清液中信號分子的含量，以達(dá)到減弱致病菌毒力或腐敗菌腐敗能力的目的[10,12]。

生物被膜的形成與細(xì)菌QS密切相關(guān)。本研究表明S.baltica經(jīng)EGCG處理后，其生物被膜的形成受到顯著抑制，并且其抑制效果呈現(xiàn)明顯的濃度依賴效應(yīng)。該趨勢與S.baltica信號分子的抑制呈現(xiàn)一定相關(guān)性，提示了EGCG對S.baltica生物被膜形成的抑制可能通過干擾QS系統(tǒng)實(shí)現(xiàn)。Packiavathy等[10]也報(bào)道姜黃素抗生物被膜與QS干擾能力存在相關(guān)性。鞭毛調(diào)控的泳動(dòng)能力參與細(xì)菌在介質(zhì)表面粘附，與生物被膜的形成聯(lián)系緊密，并且在腐敗過程中也起著重要的作用[20]。研究發(fā)現(xiàn)，EGCG對S.baltica游動(dòng)能力具有很強(qiáng)的抑制作用，推測EGCG可能影響S.baltica粘附至介質(zhì)表面，減少生物被膜的形成。Niu等[21]也發(fā)現(xiàn)肉桂醛能夠通過干擾大腸桿菌的泳動(dòng)能力來減少生物被膜的形成。研究認(rèn)為細(xì)菌的泳動(dòng)能力受QS系統(tǒng)的調(diào)控[22]，并且通過干擾細(xì)菌QS系統(tǒng)可以減弱細(xì)菌的泳動(dòng)性。Rader 等[23]發(fā)現(xiàn)敲除幽門螺桿菌的LuxS基因能顯著抑制由AI-2調(diào)控的泳動(dòng)能力。

胞外蛋白酶活性是評價(jià)高蛋白食品中腐敗菌腐敗能力的重要指標(biāo)。Lokender等[24]報(bào)道姜油酮能夠通過減少信號分子的產(chǎn)生以及干擾信號分子受體蛋白等方式干擾銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）QS系統(tǒng)，從而進(jìn)一步減弱蛋白酶活性。本研究中也發(fā)現(xiàn)，EGCG對S.baltica胞外蛋白酶活性的抑制趨勢與EGCG對信號分子的抑制趨勢相似。因此，推測EGCG可能可以作為QS抑制劑降低S.baltica蛋白酶活性。

綜上所述，研究以QS信號分子為切入點(diǎn)分析EGCG對S.baltica生物被膜和腐敗活性的抑制能力，發(fā)現(xiàn)亞抑菌濃度下的EGCG能有效地減少生物被膜形成，降低AI-2和DKPs的活性干擾其QS系統(tǒng)，并顯著抑制細(xì)菌泳動(dòng)性和胞外蛋白酶活性等腐敗表型。本研究為富含EGCG的植物多酚在海產(chǎn)品腐敗菌調(diào)控和貯藏保鮮中的應(yīng)用奠定一定的理論基礎(chǔ)。

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Inhibition of Biofilm Development and Spoilage Potential in Shewanella baltica by Epigallocatechin Gallate

YE Xiaofeng,ZHANG Fang,ZHU Junli*,ZHANG Lei,XIE Dumei

College of Food Science and Biotechnology,Zhejiang Gongshang University,Hangzhou 310035,China

Abstract:The anti-biofilm activity of catechin monomers from tea polyphenols against S.baltica,as the specific spoilage organism in marine product,was investigated.Effects of catechin monomer with the highest inhibitory activity on biofilm formation and spoilage potential of S.baltica were further assessed.The results showed that all five monomer of catechins significantly repressed biofilm formation of S.baltica,in which epigallocatechin gallate(EGCG)exhibited the highest activity.The minimum inhibitory concentration(MIC)of EGCG against S.baltica was 40 μg·mL(-1),and EGCG at the sub-inhibitory concentration of 10-30 μg·mL(-1)had no effect on its growth.EGCG at 30 μg·mL(-1)inhibited significantly the activity of quorum sensing(QS)autoinducers,AI-2,cyclo-(L-Pro-L-Leu)and cyclo-(L-Pro-L-Phe)(P<0.05),with reduction by 63.95%,27.43% and 21.94% respectively.The biofilm development,swimming motility and protease activity also decreased considerably after incubation with sub-MIC of EGCG,and exhibited a dose dependent effect,which presented the reduction by 55.18%,66.71% and 46.67% in thebook=202,ebook=95presence of 30 μg·mL(-1)EGCG.Hence,our results indicated that the sub-MIC of EGCG could interfere with S.baltica QS system,and inhibit the biofilm formation and spoilage potential of S.baltica.The present study suggested the potential of EGCG as QS inhibitor in controlling food spoilage bacterial.

Keywords:Shewanella baltica,EGCG,biofilm,spoilage,quorum sensing,inhibition

作者簡介：葉曉鋒，男，碩士研究生，主要從事水產(chǎn)品品質(zhì)與安全控制研究。*通訊作者：junlizhu0305@163.com

基金項(xiàng)目：國家自然科學(xué)基金（31271954）、浙江省自然科學(xué)基金（LY15C200001）、研究生創(chuàng)新項(xiàng)目（14060101014）。

收稿日期：2015-11-23

修訂日期：2015-12-16

中圖分類號：TS272；Q946.84+1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號：1000-369X（2016）02-201-09