高 天，鐵 英，王 妍 ，祁 智

（1.內(nèi)蒙古大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010021；2.內(nèi)蒙古和盛生態(tài)科技研究院有限公司，內(nèi)蒙古呼和浩特 010021）

擬南芥為十字花科植物，廣泛分布于歐亞大陸和非洲西北部。擬南芥作為一種模式植物，具有其他植物無法替代的優(yōu)點(diǎn)：生長周期短（從發(fā)芽到開花28～42 d）；基因組?。s為12500萬堿基對，包含約2.6萬個基因，編碼約2.5萬種蛋白質(zhì)），基因組僅由5對染色體組成，是目前已知植物基因組中最小的；擬南芥植株較小，在有限的空間內(nèi)可大量種植；結(jié)實(shí)多（每株植物可產(chǎn)生數(shù)千粒種子）；遺傳轉(zhuǎn)化操作簡單，易獲得突變體；自花授粉植物，基因高度純合；基于上述優(yōu)點(diǎn)，擬南芥成為植物分子遺傳學(xué)研究的模式材料，被科學(xué)家譽(yù)為“植物中的果蠅”，廣泛用于植物生命奧秘的研究探索[1-3]。

鈣是植物生長發(fā)育所必需的營養(yǎng)元素，在植物生長發(fā)育過程中起著非常重要的作用。鈣是細(xì)胞壁的重要組分，能夠維持細(xì)胞膜及膜結(jié)合蛋白的穩(wěn)定性，調(diào)節(jié)細(xì)胞pH值，穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)環(huán)境。鈣離子作為胞內(nèi)胞外信號分子參與多種信號途徑，許多刺激（包括鹽脅迫、氧化脅迫、低溫、高溫和干旱等）均能引起胞內(nèi)Ca2+水平改變，從而調(diào)控植物對刺激做出響應(yīng)。因此，通過對鈣的研究，有助于更好地揭示植物適應(yīng)其生存環(huán)境的機(jī)制[4-9]。

cDNA文庫的構(gòu)建是研究生物體功能基因組的主要技術(shù)手段。它是目前發(fā)現(xiàn)新基因和研究基因功能的基本工具。從cDNA文庫中可以篩選到目的基因，并直接用于該基因的表達(dá)。由于傳統(tǒng)cDNA文庫中克隆片段短、無效克隆多和全長率低，因而無法滿足大規(guī)模、高通量、高效的功能基因組研究需要。而全長cDNA文庫包含大量完整的閱讀框架，能高效地和大規(guī)模地獲得基因序列，這些序列大多數(shù)擁有5′和3′端非編碼區(qū)序列，因而彌補(bǔ)了傳統(tǒng)cDNA文庫構(gòu)建方法的缺陷，成為目前基因克隆的一種重要方法，為蛋白質(zhì)互作、表達(dá)和功能研究提供了更多和更可靠的信息，這對于基因組龐大，近期內(nèi)還不能進(jìn)行全基因組測序的生物來說，更是進(jìn)行基因組研究的有效途徑。目前有6種構(gòu)建全長cDNA文庫的方法，包括 Oligo-Capping、CAPture、SMART、CAP-trapper、Cap Select、CAP-jumping。這幾種方法在起始材料用量、文庫構(gòu)建技術(shù)、實(shí)驗(yàn)操作復(fù)雜程度和文庫構(gòu)建質(zhì)量等方面存在不同程度的優(yōu)缺點(diǎn)。但綜合比較而言，SMART和CAP-trapper這兩種方法比較有實(shí)際應(yīng)用價值。SMART法由Clonetech公司創(chuàng)建，文庫構(gòu)建是在酵母中進(jìn)行的，借助生物體自身的同源重組功能將cDNA克隆到pGADT7-Rec中。首先，使用SMART cDNA合成技術(shù)合成含有與pGADT7-Rec載體末端同源的cDNA，然后，將cDNA和pGADT7-Rec共轉(zhuǎn)入酵母菌株Y187中，通過同源重組構(gòu)建cDNA文庫，最后將所有克隆收集并分裝成1 mL的文庫用于雙雜交篩選。無須使用大腸桿菌克隆、擴(kuò)增和篩選文庫。利用SMART cDNA合成技術(shù)，能夠從低至100 ng的總RNA起始cDNA文庫的構(gòu)建，減少原始材料mRNA用量，無須酶切，實(shí)驗(yàn)快速、簡單，建成文庫的全長比例較高。本研究采用SMART cDNA合成技術(shù)成功構(gòu)建了擬南芥低鈣誘導(dǎo)的cDNA文庫，為篩選與研究鈣相關(guān)基因奠定了基礎(chǔ)[10-13]。

1 材料和方法

1.1 供試材料

1.1.1 植物材料 哥倫比亞生態(tài)型擬南芥（Arabidopsis thaliana，ecotype Columbia），本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 菌株及質(zhì)粒 酵母菌Y187、pGADT7-Rec購自Clontech公司。

1.1.3 主要試劑 Trizol、苯酚、氯仿、DEPC，Make Your Own“Mate＆PlateTM”Library System User Manual（Cat.No.630490） 購 自 Clontech公 司 ，Advantage 2 Polymerase Mix（ Cat.No.639201）購自Clontech 公司，Recombinant DNase I（RNase-free）試劑盒、Premix Taq購自TaKaRa公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 MQA培養(yǎng)基 MQA CK培養(yǎng)基配比見表1，MQA 0Ca培養(yǎng)基配比見表2。

表1 MQA CK培養(yǎng)基①

表2 MQA 0Ca培養(yǎng)基①

1.2.2 低鈣誘導(dǎo)擬南芥 首先將擬南芥消毒播種到MQA CK培養(yǎng)基上，當(dāng)根長到2 cm時將幼苗移到MQA 0Ca培養(yǎng)基上，低鈣處理4 d，所有幼苗提取總RNA。

1.2.3 總RNA的提取[14-16]利用Trizol提取植物RNA，具體實(shí)驗(yàn)方法如下：（1）將適量的液氮盛于研缽中，充分預(yù)冷研缽，直至液氮不沸騰四濺，將收集好的植物放入液氮中（保證液氮或粉末氮浸過根即可）。（2）加入液氮后，用杵將植物搗成碎塊，待液氮揮發(fā)至僅能蓋住研缽底部時，迅速研磨，及時補(bǔ)加液氮，研磨過程重復(fù)2～3次。（3）將準(zhǔn)備盛放研缽粉末的離心管在液氮中預(yù)冷：順序?yàn)楣艿?管壁-管口（不要將管體與管蓋連接部分伸入液氮中，以免斷裂）。（4）用經(jīng)過液氮充分冷卻的離心管從研缽中挖取粉末（1.5 mL離心管粉末體積小于50 μL），迅速加入1 mL Trizol提取液，加入提取液時沖擊離心管底部粉末，并迅速在振蕩器上混勻（使提取液在30 s內(nèi)溶解RNA，以便保護(hù)RNA）。確保粉末在融入Trizol之前不融化（粉末與提取液的體積比約為1∶10到 1∶15），室溫放置不少于 5 min。（5）1000×g，4 °C離心30 min，離心時間長一些，可以使RNA同其他沉淀分離得更好，在RNA相內(nèi)污染更少。（6）取80%左右的上清液倒入一個新的離心管內(nèi)，加入1/5體積的氯仿，充分渦旋振蕩。（7）1000×g，4 °C 離心15 min。這是檢測RNA提取是否有可能成功的關(guān)鍵。（8）取80%上清液倒入一個新的離心管。注意避免吸取中間層物質(zhì)。加入等體積的在-20℃保存的異丙醇，充分渦旋振蕩。-20 °C 靜置 1 h。（9）1000×g，4°C離心20 min，棄上清。（10）用1 mL 75%乙醇（DEPC水配制）。充分渦旋振蕩，使RNA沉淀完全破碎，只有這樣才能達(dá)到用乙醇溶解鹽的目的。1000×g，4 °C 離心 10 min。（11）緩慢倒掉大部分上清，倒置離心管在滅菌的濾紙上，吸凈殘液。室溫干燥 5～10 min。（12）加 20～30 μL RNase free H2O 回溶。（13）取5 μL電泳，觀察帶型。高壓電，時間控制在10 min以內(nèi)。（14）RNA中殘余DNA的去除參照Recombinant DNase I（RNase-free）試劑盒。

1.2.4 cDNA的合成 按照Advantage 2 PCR Enzyme System User Manual和 Make Your Own“Mate&Plate”Library System User Manual說明書進(jìn)行操作。

cDNA整個合成過程包括三步：

第一步，第一鏈cDNA的合成。（1）準(zhǔn)備：高質(zhì)量總RNA；（2）在離心管中混勻試劑RNA樣本2.0 μL（0.1～2.0 μg 總 RNA），CDSIII/6 引物 1.0 μL，ddH2O 1.0 μL，在做對照實(shí)驗(yàn)時，請使用 1.0 μL（1.0 μg）的對照總 RNA，CDSⅢ/6=隨機(jī)引物；（3）72 °C，孵育 2 min；（4）冰上冷卻 2 min，然后 14000 r/min，10 s，瞬時離心；（5）混合表3所示試劑，再將該混合液加入（4）中的經(jīng)過變性且結(jié)合有引物的RNA樣本中，輕拍混勻。（6）25 °C，10 min，室溫孵育。（7）42 °C，10 min，孵育。注意：孵育在熱蓋PCR儀中進(jìn)行。若用非熱蓋的PCR儀或水浴，請在反應(yīng)管中加入一滴礦物油來避免水分蒸發(fā)。（8）加入 1 μL SMARTⅢ-modified oligo，混勻，42 °C，1 h 孵育。（9）75 °C，10 min終止第一鏈合成反應(yīng)。（10）室溫冷卻，加入1 μL RNase H（2 units）。37 °C，20 min，孵育。繼續(xù)進(jìn)行LD-PCR擴(kuò)增。注意：若現(xiàn)在不立即進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，請將第一鏈合成反應(yīng)管保存于-20°C冰箱，最長可保存90 d。

第二步，長距離PCR（LD-PCR）擴(kuò)增雙鏈cDNA[19-23]（1）準(zhǔn)備：第一鏈cDNA、預(yù)熱的PCR儀。（2）建立兩管100 μL的擴(kuò)增體系（表4），一個是實(shí)驗(yàn)組，另一個是對照組。（3）PCR 程序：95 °C 30 s，x Cycles，a，95 °C 10 s，68 °C 6 min，b，68 °C 5 min，a表示參考表5設(shè)定PCR循環(huán)數(shù)，b表示擴(kuò)增程序每過一個循環(huán)時延伸時間增加5 s。例如，在第二輪循環(huán)中，延伸時間應(yīng)該是6 min和5 s，在第三輪循環(huán)中，延伸時間應(yīng)該是6 min 和10 s，如此疊加（表5）。（4）取5 μL PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行分析。

表3 第一鏈cDNA合成反應(yīng)體系 μL

表4 PCR反應(yīng)體系 μL

第三步，CHROMA SPIN TE-400柱子純化ds Cdna，按照 CHROMA SPIN Columns User Manual說明書進(jìn)行操作。使用CHROMA SPIN TE-400純化柱分選分子量大于200 bp的DNA。

表5 RNA起始量與PCR循環(huán)數(shù)的關(guān)系

1.2.5 酵母雙雜交文庫構(gòu)建 第一步，準(zhǔn)備：按照YeastmakerYeastTransformation System 2 User Manual說明書制備酵母菌株Y187感受態(tài)細(xì)胞；20 μL ds cDNA（ds cDNA 的量在 2～5 μg）；SD 固體培養(yǎng)基：SD/-Leu固體培養(yǎng)基（100×150 mm板）、SD/-Leu固體培養(yǎng)基（10×100 mm板）；YPDA/25%甘油（冷凍劑）；無菌的玻璃珠酵母菌株（5 mm）[24-27]。

第二步，按照Yeastmaker Yeast Transformation System 2 User Manual說明書制備酵母菌株Y187感受態(tài)細(xì)胞。（1）從平板上或保種管中，挑少許酵母，在YPDA平板上劃單克隆，30°C培養(yǎng)3 d左右。（2）從平板上分別挑取單克?。ㄖ睆?～3 mm）到含有3 mL YPDA的玻璃試管中（平行做3管）。（3）30 °C，250 r/min，培養(yǎng) 8～12 h。（4）取 200 μL 菌液，測OD600。（5）選取OD600值最大的一個試管（即活力最高的一個），吸取5 μL轉(zhuǎn)移至50 mL新鮮的YPDA培養(yǎng)基中（培養(yǎng)基裝在250 mL三角瓶中），30 °C，230 r/min，培養(yǎng) 16～20 h，直至 OD600=0.15～0.30。（6）將培養(yǎng)好的菌液轉(zhuǎn)入2個50 mL離心管，室溫離心，）（700～1000）×g，5 min，棄上清，用100 mL新鮮的YPDA懸起管底的菌體，并倒入干凈的三角瓶中。（7）30 °C，230 r/min培養(yǎng)直到 OD600=0.4～0.5（3～5 h）。（8）將菌液倒入2個50 mL 離心管，室溫離心，（700～1000）×g，5 r/min，棄上清，每個離心管用 30 mL ddH2O重懸。（9）再次離心，（700～1000）×g，5 min，棄上清，每管用1.4 mL 1.1×TE/LiAc重懸。（10）將重懸的菌液轉(zhuǎn)移到2個2 mL離心管中，12000 r/min，15s。棄上清，每管用600μL1.1×TE/LiAc重懸，將兩管重懸菌液并入一管，準(zhǔn)備進(jìn)行轉(zhuǎn)化（立即使用，不要在冰上保存）。

第三步，按照Yeastmaker Yeast Transformation System 2 User Manual說明書向酵母菌株Y187感受態(tài)中共轉(zhuǎn)化下列組分：20 μL ds cDNA（2～5 μg）、6 μL pGADT7-Rec（0.5 μg/μL）。（1）取一支潔凈 15 mL離心管，置冰上，加入20 μL預(yù)先變性的Yeastmaker Carrier DNA，100 ℃煮沸5 min 后，立即冰浴。（2）加入 20 μL ds cDNA、6 μL pGADT7-Rec（0.5 μg/μL），輕輕混勻。（3）加入600 μL酵母感受態(tài)細(xì)胞，輕輕混勻。（4）加入 2.5 mL PEG/LiAc，輕輕混勻后，30 ℃孵育45 min，期間每隔15 min輕輕混勻一次。（5）加入 160 μL DMSO，輕輕混勻后，42 ℃孵育 20 min，期間每隔 10 min 輕輕混勻一次。（6）700×g，離心 5 min，棄上清。（7）用3 mL YPD plus Liquid Medium重懸細(xì)胞，30 ℃，240 r/min 孵育 90 min。（8）700×g，離心5 min，棄上清，重懸于 15 mL 0.9%NaCl溶液中。（9）取100 μL轉(zhuǎn)化液涂布于10 cm SD/-Leu平板上，涂2個板，其中轉(zhuǎn)化液按 1∶10 和 1∶100 稀釋。（10）30 ℃倒置培養(yǎng)3～4 d，直至菌落出現(xiàn)。

第四步，確定文庫的庫容，獨(dú)立克隆數(shù)=No.of cfu/mL on SD/-Leu x重懸液體積（15 mL），這個值表示轉(zhuǎn)化效率。若建立2×107庫容的文庫，那么在1/100稀釋板上應(yīng)當(dāng)有133個獨(dú)立克隆。若這時候有1×107個獨(dú)立克隆，則可以直接進(jìn)行下一步。

第五步，將剩下的懸浮液鋪板于150 mm SD/-Leu選擇培養(yǎng)基上，每板150 μL懸浮液，約使用100板，30°C 孵育3～4 d。

第六步，收獲上一步中的轉(zhuǎn)化子，（1）4°C ，3～4 h冷卻培養(yǎng)板。（2）加入 5 mL 的凍存液。（3）使用無菌的玻璃珠將板中的菌落分離下來（緩緩地?fù)u晃培養(yǎng)板，玻璃珠均勻地滾動于培養(yǎng)基表面將分離菌落，分離后的菌落溶于凍融液中）。（4）將所有的液體收集于無菌的單管中。（收集后的體積要達(dá)到0.5 L）。（5）用血球計數(shù)板來計算細(xì)胞密度。若細(xì)胞密度小于2×107cfu/mL，離心來減少懸浮液的體積。（6）將文庫1 mL分裝幾管待短期使用，剩下的50 mL分裝待長期使用，-80°C貯存。注意：當(dāng)復(fù)蘇貯存文庫時，每次務(wù)必重新計算文庫的滴度，確保文庫滴度大于1×107cfu/mL。

1.2.6 菌落PCR鑒定cDNA文庫質(zhì)量 從上述1/100稀釋板上隨機(jī)挑選24個單菌落進(jìn)行菌落PCR。將挑取的單菌落溶于40 μL ddH2O中，于液氮中冷凍7 min，然后沸水浴7 min，如此反復(fù) 3 次，取 4 μL 酵母菌液進(jìn)行酵母菌落PCR（注意：吸取酵母菌液之前將菌液用移液器吹打均勻）。

所用引物為：5'LD primer：CTATTCGATGATGA AGATACCCCACCAAACCC，3'LD primer：GTGAACT TGCGGGGTTTTTCAGTATCTACGAT。 PCR反應(yīng)體系Premix Taq25 μL，5'LD primer（10 umol/L）0.5 μL，3'LD primer（10 umol/L），菌液 4 μL，加 50 μL ddH2O至總體積反應(yīng)程序98°C變性5 min，98°C變性 10 s，59 °C 退火 30 s，72 °C 延伸 3 min，35 個循環(huán)，72 °C 后延伸10 min，15 °C 1 h。

2 結(jié)果與分析

2.1 總RNA的提取

取經(jīng)低鈣誘導(dǎo)處理的擬南芥幼苗，液氮研磨，提取總RNA。經(jīng)測定，OD260/OD280=1.95，RNA濃度為1.22 μg/μL，表明 RNA 純度較高，無蛋白質(zhì)及其他鹽離子等雜質(zhì)的污染。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果分析，28 S和18 S電泳條帶清晰，表明RNA質(zhì)量較好。綜上所述，RNA質(zhì)量及完整性較好，可以用來構(gòu)建cDNA文庫。

2.2 cDNA的合成

采用SMART方法合成cDNA第一條鏈，cDNA第二條鏈合成采用LD-PCR的方法，經(jīng)電泳檢測見圖2，ds cDNA分布200～5000 bp，呈彌散狀，表明cDNA質(zhì)量良好，可用于cDNA的構(gòu)建。

2.3 酵母雙雜交文庫構(gòu)建及質(zhì)量鑒定

經(jīng)檢測，文庫滴度為3×109cfu/mL，文庫總量為4.5×1010cfu。隨機(jī)挑選24個酵母文庫單克隆進(jìn)行菌落PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示見圖3，cDNA文庫重組率為79.2%（4個pGADT7-Rec空載體，擴(kuò)增片段大小291 bp，1個無擴(kuò)增條帶），重組片段大小在200～2700 bp，插入片段平均大小為760 bp。表明cDNA文庫質(zhì)量較好，適用于互作蛋白的篩選。

3 結(jié)論與討論

鈣是植物所必需的營養(yǎng)元素，在植物生長發(fā)育過程中起著非常重要的作用。近年來，鈣的研究逐漸成為人類研究的熱點(diǎn)。一方面，隨著我國經(jīng)濟(jì)的快速發(fā)展，工業(yè)化進(jìn)程的加劇，工業(yè)源SOx和NOx氣體的排放導(dǎo)致的酸雨現(xiàn)象日益嚴(yán)重[28]。酸雨長期作用的結(jié)果是導(dǎo)致土壤酸化，進(jìn)而導(dǎo)致土壤中陽離子特別是鈣離子的流失[29]。當(dāng)土壤中的鈣離子含量降低時，植物所能吸收的鈣含量也隨之降低，導(dǎo)致植物缺鈣，對植物的正常生長發(fā)育產(chǎn)生嚴(yán)重的影響。另一方面，盡管有的地方土壤含鈣豐富，但果樹和蔬菜缺鈣十分普遍。此外，鈣具有獨(dú)特的信使作用，在植物體內(nèi)參與多種生理過程的調(diào)節(jié)。因此，鈣的研究不僅能夠給人類帶來巨大的經(jīng)濟(jì)效益，而且有利于自然的保護(hù)。

cDNA文庫構(gòu)建和篩選是基因克隆的重要方法之一，cDNA便于克隆和大量表達(dá)，不像基因組含有內(nèi)含子而難于表達(dá)，從cDNA文庫能夠篩選到所需的目的基因，并直接用于該目的基因的表達(dá)，是目前發(fā)現(xiàn)新基因和研究基因功能的基本工具。本研究采用SMART cDNA合成技術(shù)成功構(gòu)建了擬南芥低鈣誘導(dǎo)的cDNA文庫。經(jīng)檢測，文庫滴度為3×109cfu/mL，文庫插入片段大小在200～2700 bp，插入片段平均大小為760 bp，陽性克隆率為79.2%，完全符合cDNA文庫的基本要求，可以用來進(jìn)行下一步的酵母雙雜交篩選，有助于進(jìn)一步詮釋Ca2+在植物體內(nèi)的調(diào)控機(jī)制。

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