李英英　陳　曦　宋鐵英（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所　福州　350003）

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屎腸球菌微膠囊制劑的穩(wěn)定性及對斷乳仔豬生產(chǎn)性能的影響

李英英陳曦宋鐵英※
（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所福州350003）

摘要本試驗(yàn)以自主篩選的一株屎腸球菌為對象，在抗逆性評估的基礎(chǔ)上，通過微囊化提高耐熱性和穩(wěn)定性，并進(jìn)行動(dòng)物田間小試，評價(jià)其對斷乳仔豬生長性能的影響。結(jié)果顯示，通過優(yōu)化保護(hù)劑與壁材的配方，改善噴霧干燥工藝參數(shù)，可使噴霧后獲得的干物質(zhì)中活菌數(shù)達(dá)到10(10)cfu/g；微囊化的屎腸球菌對高溫的耐受性增強(qiáng)，貯存時(shí)間更久，對胃液和腸液依然具備較好的耐受性。在仔豬生長性能方面，與空白組相比，飼喂屎腸球菌組仔豬的平均日增重和日采食量分別提高37%和15%，料肉比和腹瀉率分別下降16%和65%，說明該屎腸球菌微膠囊制劑可以改善仔豬生長性能。

關(guān)鍵詞屎腸球菌微膠囊制劑穩(wěn)定性斷乳仔豬生產(chǎn)性能

The stability of microencapsulated Enterococcus faecium probiotics and effects on growth performance of weaned piglets

Li Yingying Chen Xi Song Tieying*
(Institute of Biotechnology,Fujian Academy of Agricultural Science,Fuzhou 350003)

Abstract In this study,one strain of Enterococcus faecium from the preliminary work was investigated on its resistances and further be microencapsulated to improve the thermostability and storage stability.A pilot filed experiment was proceeded to evaluate its effect on the piglet growth performances.The results indicated that the amount of bacteria reach at the levels of 1010cfu/g after the optimization of protective agent,wall material,and process parameters.No change on the tolerance to succus gastricus and succus entericus but much better thermostability and storage stability were achieved by microencapsulated E.faecium.According to the result of the field experiment,the average daily gain (ADG) and average daily feed intake (ADFI) in E.faecium group were increased by 37% and 15%,respectively,while the feed conversion ratio (FCR) and total diarrhea times were reduced by 16% and 65% when compared to the control group,indicating the improvement on the growth performances by E.faecium.

Key words Enterococcus faecium microencapsulated probiotics stability weaned piglets growth performance

長期以來，人們依靠添加抗生素來降低斷乳時(shí)期仔豬的應(yīng)激反應(yīng)，從而維持?jǐn)嗳樽胸i的健康，但是濫用抗生素又引發(fā)藥物殘留和耐藥性的問題，因此，尋找抗生素的替代品成為養(yǎng)殖業(yè)亟待解決的問題[1]。乳酸菌制劑具有抑制腸道病原菌、改善腸道環(huán)境、促進(jìn)消化吸收、降低料重比、提高動(dòng)物免疫力、降低糞便污染等多種作用，是最具發(fā)展?jié)摿Φ目股靥娲分籟2]。但是，將乳酸菌直接添加于飼料中，常存在著菌株不耐飼料制備時(shí)的高溫、不耐儲存、對動(dòng)物的胃腸液耐受性差等問題[3-5]。因此，常采用微膠囊包被技術(shù)來提高益生菌在加工和儲藏過程中的成活率，并同時(shí)增強(qiáng)菌株對高溫和胃腸液的耐受性[6-9]。

屎腸球菌是乳酸菌中抗逆性較強(qiáng)[10]、培養(yǎng)和保存條件都較為容易的一類菌，因此，是制作乳酸菌微膠囊制劑時(shí)的首選菌種[1]。本研究以前期研究中篩選分離的豬源屎腸球菌為基礎(chǔ)，通過優(yōu)化后的包被配方和噴霧工藝制備微膠囊制劑，探討包被前后其在高溫耐受性、耐酸性、腸溶性和穩(wěn)定性等生物活性方面的變化，并將微膠囊制劑添加于飼料中進(jìn)行田間動(dòng)物小試，以評估該微膠囊的包被效果及實(shí)際的臨床應(yīng)用效果。

1　材料與方法

1.1試驗(yàn)材料

1.1.1試驗(yàn)菌株由本實(shí)驗(yàn)室在福建省某豬場周邊土壤自主分離到的屎腸球菌BBH201305001，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心CGMCC，菌種保藏代號：CGMCC No.8296。

1.1.2試驗(yàn)動(dòng)物21.0±2.6日齡、體重在7.1±0.26 kg的大三元斷乳仔豬50頭。

1.1.3試劑

人工腸液：取KH2PO46.8 g，加水500 mL溶解，用0.4%NaOH調(diào)節(jié)pH至6.8；另取胰酶10 g加水適量使溶解，將兩溶液混合后，加水定容至1 L。

人工胃液：取稀HCl 16.4 mL，加水約800 mL及胃蛋白酶10 g，攪勻后加水定容至1 L。

MRS培養(yǎng)基：麥芽糖5 g，蛋白胨10 g，牛肉膏10 g，酵母膏5 g，葡萄糖20 g,磷酸氫二鉀2 g，乙酸鈉5 g，硫酸鎂0.2 g，硫酸錳0.05 g，檸檬酸三胺2 g，吐溫-80 1mL，加水至l L，調(diào)節(jié)pH至6.5。

卵黃粉：由福建省金華龍飼料有限公司提供。

1.2試驗(yàn)方法

1.2.1屎腸球菌穩(wěn)定性檢測

1.2.1.1屎腸球菌的高溫耐受性檢測取保藏的屎腸球菌接種于MRS培養(yǎng)基中，37℃、200 rpm/min培養(yǎng)16～20 h復(fù)蘇，取復(fù)蘇后菌液1 mL，分別置于50、80、100℃下，30、60 min后取出，進(jìn)行涂板計(jì)數(shù)。

1.2.1.2屎腸球菌的貯存穩(wěn)定性檢測取復(fù)蘇后菌液1 mL，置于47.5℃下，7 d后取出進(jìn)行涂板計(jì)數(shù)。1.2.1.3屎腸球菌的耐酸性試驗(yàn)取復(fù)蘇后菌液0.1 mL，加入0.9 mL人工胃液中，37℃、200 rpm/min下放置30、60、90、120 min后取出涂板計(jì)數(shù)。

1.2.1.4屎腸球菌的腸溶性試驗(yàn)取復(fù)蘇后菌液0.1 mL，加入0.9 mL pH6.8的人工腸液中，37℃恒溫水浴攪拌，37℃、200 rpm/min條件下放置，分別在30、60、90、120 min后取出進(jìn)行涂板計(jì)數(shù)。

1.2.2屎腸球菌微膠囊制劑的制備將屎腸球菌菌種接種于MRS液體培養(yǎng)基，37℃、200 rpm/min培養(yǎng)16 h，成為種子液；將種子液按1%比例接種于發(fā)酵罐中擴(kuò)大培養(yǎng)，37℃、200 rpm/min厭氧條件下培養(yǎng)20 h。

向獲得的發(fā)酵液中加入干燥保護(hù)劑（阿拉伯膠5%，β-糊精15%、蔗糖3%、淀粉7%）和卵黃粉，添加方式為：先向發(fā)酵液中加入0.5%吐溫-80，再加入10%卵黃粉，邊加邊攪拌；然后緩緩加入干燥保護(hù)劑，邊加邊攪拌，直至混勻制成菌液混合物，繼續(xù)攪勻后進(jìn)行噴霧干燥制成菌粉。

噴霧干燥工藝指標(biāo)：進(jìn)口溫度控制在155～165℃，出口溫度控制在50～70℃，風(fēng)壓指數(shù)控制在25～30 Mpa，噴霧頭變頻為400 Hz。

1.2.3屎腸球菌微膠囊制劑的穩(wěn)定性檢測取制備好的屎腸球菌微膠囊制劑，加無菌水10倍稀釋，振蕩使其完全溶解后取稀釋液按照1.2.1.1-1.2.1.4提供的方法檢測其穩(wěn)定性。

1.2.4屎腸球菌微膠囊制劑的田間小試試驗(yàn)在福建省閩清縣后洋養(yǎng)豬場進(jìn)行，將50頭斷乳仔豬隨機(jī)分成兩組，分別為試驗(yàn)組和對照組，試驗(yàn)組日糧中按0.3‰比例添加制備好的屎腸球菌微膠囊制劑，對照組中不添加。從22日齡斷乳開始試驗(yàn)，持續(xù)2周；試驗(yàn)期間按常規(guī)飼養(yǎng)管理，提供足量的清潔飲水和飼料，自由采食，所用飼料為福建省金華龍飼料有限公司所提供的豬寶寶斷乳仔豬教槽料。

2　結(jié)果與分析

2.1屎腸球菌與屎腸球菌微膠囊制劑的生物穩(wěn)定性比較

2.1.1屎腸球菌與屎腸球菌微膠囊制劑的高溫耐受性比較屎腸球菌在50～100℃下，該菌株在30 min后均無存活。而制成微膠囊后，其存活率顯著提高，50℃下60 min后可達(dá)95%，80℃下30 min后依然有50%存活率。因此，認(rèn)為該菌株對高溫的耐受性較差；微囊化后，提高了該菌的高溫耐受性（見表1）。

表1　不同溫度熱處理菌液和微膠囊制劑后屎腸球菌存活率比較

2.1.2屎腸球菌與屎腸球菌微膠囊制劑的貯存穩(wěn)定性檢測結(jié)果將菌液在47.5℃下避光存放7 d后，菌液中未發(fā)現(xiàn)活菌。而屎腸球菌微膠囊制劑在47.5℃下放置7 d后，檢測到樣品中的屎腸球菌存活率為45%（見表2）。

表2　屎腸球菌菌液和微膠囊制劑貯存穩(wěn)定性結(jié)果比較

2.1.3屎腸球菌及屎腸球菌微膠囊的耐酸性檢測結(jié)果見表3，菌液和微膠囊制劑經(jīng)人工胃液處理120 min后屎腸球菌存活率依然較高，說明該菌株自身對于胃酸及胃蛋白酶具有較好的耐受性，而在制備微膠囊后，其耐受性未發(fā)生改變。

表3　人工胃液處理菌液和微膠囊制劑后屎腸球菌存活率比較

表4　人工腸液處理菌液和微膠囊制劑后屎腸球菌存活率比較

2.1.4屎腸球菌及微膠囊腸溶性檢測結(jié)果見表4，菌液和微膠囊制劑經(jīng)人工腸液處理120 min后屎腸球菌存活率依然較高，因此，認(rèn)為該菌株自身對于胰酶具有較好的耐受性，而在制備微膠囊后，其耐受性未發(fā)生改變。

2.2屎腸球菌微膠囊田間小規(guī)模試驗(yàn)結(jié)果見表5，可以看出，添加屎腸球菌微膠囊的試驗(yàn)組與空白對照組相比，平均增重、采食量分別提高37%和15%，料肉比和腹瀉率分別下降16%和65%。

表5　田間小規(guī)模試驗(yàn)結(jié)果

3　討論

3.1屎腸球菌微膠囊制劑的穩(wěn)定性檢測益生菌添加于飼料中，存活率是影響其作用的關(guān)鍵因素[11]。本試驗(yàn)通過篩選抗逆性較好的菌株、改良培養(yǎng)基、調(diào)整保護(hù)劑與壁材配方、改善噴霧干燥工藝參數(shù)，使制備的屎腸球菌微膠囊活菌數(shù)達(dá)到109-10cfu/g，高于益生菌制劑所要求的有效活菌量3.8×108cfu/g[12]；同時(shí)，對微囊化前后的屎腸球菌進(jìn)行高溫耐受性、貯存穩(wěn)定性、腸溶性及耐酸性試驗(yàn)，結(jié)果表明：微囊化的屎腸球菌對溫度的耐受性提高，可以耐受短時(shí)間的高溫，這樣更有利于其在飼料中的應(yīng)用和自身的貯存；所選用的菌株在微囊化前后對胃液和腸液都有較好的耐受性，使動(dòng)物飼用該制劑后到達(dá)腸道時(shí)仍有較高的活菌量。說明本試驗(yàn)所選用的菌株及所采用的微膠囊制備方法適合制備屎腸球菌微膠囊制劑。

3.2屎腸球菌微膠囊田間小規(guī)模試驗(yàn)在斷乳仔豬保育階段，由于仔豬消化道發(fā)育尚未完全，免疫系統(tǒng)亦不完善，斷乳后抗病力低，斷乳引起的應(yīng)激常導(dǎo)致腹瀉，嚴(yán)重影響仔豬的生長。而乳酸菌是腸道的益生菌，在動(dòng)物體內(nèi)既能抑制病原菌生長、增強(qiáng)機(jī)體免疫力，又能增強(qiáng)營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，促進(jìn)動(dòng)物生長[13-14]。因此，若在斷乳仔豬日糧中添加乳酸菌，可增加其腸道內(nèi)益生菌數(shù)量，改善腸道微生態(tài)環(huán)境，從而增強(qiáng)免疫力，降低腹瀉率，促進(jìn)生長[1]。本試驗(yàn)將制備的屎腸球菌微膠囊以0.3‰劑量添加于斷乳仔豬日糧中，與飼喂同樣日糧但不添加屎腸球菌微膠囊的空白對照組相比，試驗(yàn)組仔豬料肉比和腹瀉率明顯降低，平均增重和采食量有明顯提高，說明本試驗(yàn)制備的屎腸球菌微膠囊對于斷乳仔豬具有明顯的促生長和降低腹瀉率的作用，具有較強(qiáng)的應(yīng)用前景和實(shí)用價(jià)值。

4　結(jié)　論

通過篩選抗逆性較好菌株、改善工藝參數(shù)及配方等方法，所得到的屎腸球菌微膠囊制劑活菌數(shù)較高，可在一定的條件下保存一段時(shí)間，同時(shí)在田間小規(guī)模試驗(yàn)中取得了較好的效果，這為屎腸球菌微膠囊的制備及在動(dòng)物日糧中的推廣應(yīng)用都提供了一些參考數(shù)據(jù)。

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通信作者：＊宋鐵英（1963-），女，研究員，主要從事動(dòng)物營養(yǎng)新技術(shù)研究。E-mail:tieyingsong@163.com。

作者簡介：李英英（1987-），女，碩士，研究實(shí)習(xí)員，主要從事動(dòng)物營養(yǎng)新技術(shù)研究。E-mail:liyingying80@126.com。

基金項(xiàng)目：福建省科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014R1019 -12、2014R1019-5、2015R1019-9)、福州市科技計(jì)劃項(xiàng)目(2014-N-106)、福建省農(nóng)科院青年創(chuàng)新人才基金(2014CX-11)資助。

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1003-4331（2016）02-0014-04