宋國(guó)林，母昌考，李榮華，王春琳

(寧波大學(xué) 海洋學(xué)院，浙江 寧波 315211)

?

Cd2+對(duì)三疣梭子蟹的毒性效應(yīng)研究

宋國(guó)林，母昌考*，李榮華，王春琳

(寧波大學(xué) 海洋學(xué)院，浙江 寧波 315211)

摘要:本研究以三疣梭子蟹Portunus trituberculatus為研究對(duì)象，通過急性和亞急性暴露試驗(yàn)，研究Cd(2+)對(duì)其肝胰腺和鰓的毒性效應(yīng)。結(jié)果表明：Cd(2+)對(duì)三疣梭子蟹的48、72和96 h半致死質(zhì)量濃度分別為6.55、4.33和3.12 mg/L，Cd(2+)對(duì)三疣梭子蟹的安全質(zhì)量濃度為0.31 mg/L；在安全質(zhì)量濃度和漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)量濃度(<0.005 mg/L)下，隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，三疣梭子蟹的肝胰腺和鰓中HSP70的表達(dá)量都出現(xiàn)“先升后降”的趨勢(shì)，與對(duì)照組相比，鰓中HSP70的表達(dá)量比肝胰腺的變化明顯。在安全質(zhì)量濃度以下，三疣梭子蟹的存活率并沒有明顯的變化，但是HSP70的誘導(dǎo)表達(dá)反映機(jī)體受到Cd(2+)的脅迫。因此HSP70基因可用作低質(zhì)量濃度Cd(2+)污染檢測(cè)的生物標(biāo)志物。

關(guān)鍵詞:三疣梭子蟹；Cd(2+)；急性毒性實(shí)驗(yàn)；HSP70

0引言

重金屬污染是漁業(yè)環(huán)境污染的公害之一。重金屬鎘是一種廢水中常見的污染物，當(dāng)水中含Cd2+0.1 mg/L時(shí)，就會(huì)抑制地面水的自凈作用[1]，對(duì)生物體的危害較大，可引起生物肝臟、泌尿系統(tǒng)等的功能變化，同時(shí)Cd2+還具有環(huán)境雌激素及環(huán)境內(nèi)分泌干擾物質(zhì)的效應(yīng)[2]。三疣梭子蟹Portunustrituberculatus是一種重要的海洋經(jīng)濟(jì)動(dòng)物，隸屬甲殼綱Crustacea、十足目Decapoda、梭子蟹科Portunidae，是中國(guó)沿海的重要經(jīng)濟(jì)蟹類。因其經(jīng)濟(jì)價(jià)值高、營(yíng)養(yǎng)豐富、生長(zhǎng)快等優(yōu)點(diǎn)，已成為目前我國(guó)沿海重要的海水養(yǎng)殖品種之一[3]。熱休克蛋白(heat shock protein, HSP)是生物體在環(huán)境因子刺激作用下發(fā)生熱休克反應(yīng)(heat shock response, HSR)時(shí)啟動(dòng)合成的一類蛋白。這類蛋白質(zhì)通過修復(fù)、重折疊變性蛋白以及解離聚集的蛋白，最終達(dá)到對(duì)細(xì)胞和機(jī)體的保護(hù)作用[4]。而HSP70是熱休克蛋白家族的重要成員，它在進(jìn)化上高度保守，作為主要的分子伴侶蛋白協(xié)助新生多肽的折疊、轉(zhuǎn)運(yùn)以及變性蛋白的修復(fù)和重折疊等，而且它在細(xì)胞保護(hù)、抗凋亡以及免疫治療等方面有獨(dú)特復(fù)雜的生物學(xué)功能。

傳統(tǒng)的海洋污染物監(jiān)測(cè)方法主要是通過檢測(cè)水體和沉積物中污染物的形態(tài)和含量[5]，或是通過評(píng)價(jià)污染物對(duì)生態(tài)系統(tǒng)的宏觀影響來實(shí)現(xiàn)，并不能闡明生物體對(duì)這些脅迫作用的生理反應(yīng)和機(jī)能變化。此外，低質(zhì)量濃度的污染物可能在生態(tài)系統(tǒng)層面上沒有明顯變化，但卻能夠在生物的細(xì)胞或分子水平上有所反映，而這種變化依靠傳統(tǒng)的監(jiān)測(cè)手段并不易檢出。本研究以三疣梭子蟹為研究對(duì)象，通過急性和亞急性暴露實(shí)驗(yàn)，通過半致死質(zhì)量濃度和HSP70的相對(duì)表達(dá)量研究Cd2+對(duì)其肝胰腺和鰓的毒性效應(yīng)，為建立基于三疣梭子蟹響應(yīng)特征的典型海洋污染物檢測(cè)技術(shù)體系奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料及條件

試驗(yàn)用三疣梭子蟹來自浙江寧波鑫億鮮活水產(chǎn)有限公司養(yǎng)殖場(chǎng)，平均體質(zhì)量30.67±4.12 g，平均甲長(zhǎng)4.15±0.51 cm，平均甲寬(全甲)8.32±1.34 cm。實(shí)驗(yàn)容器為100 L的聚乙烯塑料水槽。實(shí)驗(yàn)前在桶中暫養(yǎng)5 d，每天定時(shí)投喂新鮮的野雜魚，實(shí)驗(yàn)前停食1 d。實(shí)驗(yàn)用水為二級(jí)沙濾海水，pH為8.2±0.31，鹽度為23.3±2，水溫為23±1 ℃。CdCl2·25H2O(AR)用蒸餾水按Cd2+質(zhì)量濃度配成10 mg/L的母液使用。

1.2方法

1.2.1急性毒性實(shí)驗(yàn)

急性毒性實(shí)驗(yàn)參照《魚類急性毒性試驗(yàn)方法》[6]，在預(yù)試驗(yàn)中，以10倍級(jí)差配制5個(gè)質(zhì)量濃度組(0，0.1，1，10和100 mg/L)的CdCl2，對(duì)三疣梭子蟹處理24 h，得出Cd2+的100%致死質(zhì)量濃度和0致死質(zhì)量濃度。然后在此質(zhì)量濃度范圍內(nèi)設(shè)置了5個(gè)質(zhì)量濃度梯度，分別為2，4，6，10和20 mg/L，每個(gè)質(zhì)量濃度設(shè)置3個(gè)平行，每個(gè)平行組放15只蟹，并設(shè)置對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)持續(xù)96 h。試驗(yàn)過程中隨時(shí)撈出死亡個(gè)體，觀察并記錄三疣梭子蟹中毒后的癥狀以及48，72和96 h死亡個(gè)體數(shù)。判斷死亡的標(biāo)準(zhǔn)是對(duì)外界刺激無反應(yīng)，放入到自然海水中不能復(fù)活。

1.2.2Cd2+脅迫對(duì)三疣梭子蟹HSP70基因表達(dá)的影響

依據(jù)漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)(Cd2+<0.005 mg/L)和急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果(SC=0.31 mg/L)，Cd2+質(zhì)量濃度設(shè)置為3個(gè)質(zhì)量濃度梯度和1個(gè)空白對(duì)照，分別為0，0.005，0.015和0.3 mg/L，每一梯度設(shè)3個(gè)平行，每個(gè)平行組放15只蟹，分別在2，4，8，12和24 h取2只蟹的鰓和肝胰腺，液氮保存。各組織在液氮中研磨后按Trizol法提取總RNA，在確認(rèn)RNA完整后反轉(zhuǎn)成cDNA，反轉(zhuǎn)錄完成后于-20 ℃保存。

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)三疣梭子蟹鰓和肝胰腺中HSP70基因的表達(dá)情況，HSP70基因和內(nèi)參β-actin基因的PCR引物根據(jù)文獻(xiàn)[7]中的引物進(jìn)行設(shè)計(jì)。HSP70引物為P1(5′-CCGTATCCCTAAGACCCAGAAA-3′)和P2(5′-CAGCCTCAGACTTATCA CCACAAA-3′)；β-actin引物為P3(5′-TCACACACTGTCCCCATCTACG-3′)和P4(5′-ACCACGCTCGGTCAGGATTTTC-3′)。采用Eppendorf Mastercycler ep realplex實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀進(jìn)行基因表達(dá)檢測(cè)，并設(shè)立空白對(duì)照。試驗(yàn)所用體系為SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ(TaKaRa公司)。反應(yīng)體系為10 μL，即5 μL SYBR Green Master Mix Ⅱ，2 μL cDNA(100 ng/μL)模板，0.2 μL ROX Reference Dye(50×)，引物各0.4 μL(包括β-actin和HSP70)，2 μL ddH2O，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃,30 s；95 ℃,5 s;60 ℃,34 s;進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，按2-△△CT方法[8]進(jìn)行結(jié)果計(jì)算。

1.3數(shù)據(jù)分析及公式

數(shù)據(jù)分析采用Excel和SPSS 13.0軟件，采用probit回歸求得48，72及96 h的半致死質(zhì)量濃度(LC50)和相應(yīng)時(shí)間下的95%置信區(qū)間，由公式:SC=96hLC50×0.1計(jì)算出安全質(zhì)量濃度(SC)。采用單因素方差分析的Duncan多重比較法對(duì)轉(zhuǎn)錄組結(jié)果進(jìn)行組間差異顯著性檢驗(yàn)，P<0.05為差異顯著。

2結(jié)果與分析

2.1急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1三疣梭子蟹對(duì)Cd2+暴露的反應(yīng)

三疣梭子蟹中毒后，會(huì)發(fā)生一系列變化。開始時(shí)表現(xiàn)為躁動(dòng)不安，四處亂爬，逐漸頭胸甲顏色會(huì)發(fā)黃，活力逐漸下降，到最后變得僵硬。Cd2+的質(zhì)量濃度越高癥狀越明顯，出現(xiàn)的時(shí)間越早。

2.1.2Cd2+對(duì)三疣梭子蟹的半致死質(zhì)量濃度

Cd2+暴露后，除了對(duì)照組外，其余各組均出現(xiàn)死亡。并且死亡率隨著Cd2+質(zhì)量濃度的增加與實(shí)驗(yàn)時(shí)間的延長(zhǎng)而提高，呈現(xiàn)較為明顯的劑量-效應(yīng)和時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。計(jì)算得到48 h的LD50為6.55 mg/L，95%置信區(qū)間為4.78～9.03 mg/L；72 h的LD50為4.33 mg/L，95%置信區(qū)間為3.05～5.91 mg/L；96 h的LD50為3.12 mg/L，95%置信區(qū)間為2.11～4.34 mg/L，SC為0.31 mg/L(表1)。

2.2Cd2+脅迫對(duì)三疣梭子蟹HSP70表達(dá)的影響

2.2.1Cd2+脅迫對(duì)三疣梭子蟹肝胰腺中HSP70表達(dá)的影響

Cd2+暴露后，三疣梭子蟹肝胰腺中HSP70的表達(dá)呈現(xiàn)出先升高再降低的趨勢(shì)(圖1)，Cd2+質(zhì)量濃度越高，這種趨勢(shì)越明顯，Cd2+質(zhì)量濃度為安全質(zhì)量濃度(SC=0.3 mg/L)時(shí)，HSP70在4 h表達(dá)量最高，為對(duì)照組的6倍，與其他各組均表現(xiàn)出顯著差異(P<0.05)，隨后持續(xù)下降，至24 h降至初始水平。Cd2+質(zhì)量濃度為1/20SC(0.015 mg/L)時(shí)，HSP70的表達(dá)量在2～8 h顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，在4 h達(dá)到峰值，高出對(duì)照組2倍。在漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)下(Cd2+質(zhì)量濃度為0.005 mg/L)，三疣梭子蟹肝胰腺中HSP70的表達(dá)量仍然表現(xiàn)為先上升后下降，在12 h達(dá)到最大值，此時(shí)表達(dá)量顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，幾乎達(dá)到了安全質(zhì)量濃度下的表達(dá)量(P>0.05)。

表1　Cd2+對(duì)三疣梭子蟹急性毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1　不同暴露時(shí)間下三疣梭子蟹肝胰腺中HSP70表達(dá)量Fig.1　Transcription of HSP70 gene in hepatopancreas of P. trituberculatus after exposure of Cd2+

2.2.2Cd2+脅迫對(duì)三疣梭子蟹鰓中HSP70表達(dá)的影響

在Cd2+脅迫下，三疣梭子蟹鰓中HSP70的表達(dá)量變化趨勢(shì)與肝胰腺中相似，也呈現(xiàn)出先升高再降低的趨勢(shì)(圖2)。初始階段(2 h)，各質(zhì)量濃度下HSP70的表達(dá)量與對(duì)照組均沒有顯著差異(P>0.05)。隨后各處理組的表達(dá)量均出現(xiàn)不同程度的增加，在4 h，安全質(zhì)量濃度組(SC=0.3 mg/L)三疣梭子蟹鰓中HSP70的表達(dá)量遠(yuǎn)高于對(duì)照組和漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)組(Cd2+質(zhì)量濃度為0.005 mg/L)，與1/20SC組(0.015 mg/L)也存在顯著差異(P<0.05)。在8 h，除對(duì)照組外，其余各組HSP70的表達(dá)量均增加，且組間差異顯著(P<0.05)。12 h后進(jìn)入下降階段，除了漁業(yè)水質(zhì)組HSP70的表達(dá)量與對(duì)照組相似，其余兩組仍與對(duì)照組間存在顯著差異(P<0.05)。

圖2　不同暴露時(shí)間下三疣梭子蟹鰓中HSP70表達(dá)量Fig.2　Transcription of HSP70 gene in gill of P. trituberculatus after exposure of Cd2+

3討論

3.1Cd2+對(duì)三疣梭子蟹的半致死質(zhì)量濃度和安全質(zhì)量濃度

鎘是水遷移性元素，除了硫化鎘外，其他鎘的化合物均能溶于水，是《污水綜合排放標(biāo)準(zhǔn)》中的第一類污染物，在自然界中常以化合物狀態(tài)存在，一般含量很低，不會(huì)影響人體健康。當(dāng)環(huán)境受到Cd2+污染后，Cd2+可在生物體內(nèi)富集，通過食物鏈進(jìn)入機(jī)體引起慢性中毒[9]。本研究結(jié)果表明，在高質(zhì)量濃度Cd2+(2～20 mg/L)脅迫下，三疣梭子蟹的死亡率隨著Cd2+質(zhì)量濃度的增大和時(shí)間的延長(zhǎng)而遞增。呈現(xiàn)較為明顯的劑量-效應(yīng)和時(shí)間-效應(yīng)的關(guān)系。Cd2+對(duì)三疣梭子蟹48，72和96 h的半致死質(zhì)量濃度分別為6.55，4.33和3.12 mg/L，理論安全質(zhì)量濃度為0.31 mg/L。Cd2+對(duì)菲律賓蛤仔Ruditapesphilippinarum48，72和96 h的半致死質(zhì)量濃度分別為11.15，7.58和4.74 mg/L[10]，鯉魚Cyprinuscarpiocarpio幼魚Cd2+的96 h半致死質(zhì)量濃度為2.51 mg/L[11]， Cd2+對(duì)可口革囊星蟲Phasolosmaesculenta的48和96 h半致死質(zhì)量濃度分別為501和175 mg/L[12]。采用本文中的安全質(zhì)量濃度算法，可以得出Cd2+對(duì)菲律賓蛤仔，鯉魚幼魚和可口革囊星蟲的理論安全質(zhì)量濃度分別為0.47，0.25和17.5 mg/L，相比之下，三疣梭子蟹對(duì)Cd2+的耐受性介于雙殼類和魚類之間。一般在實(shí)驗(yàn)和養(yǎng)殖水質(zhì)管理中測(cè)得的Cd2+質(zhì)量濃度比底泥中的要低[5]，三疣梭子蟹為底棲生物，在池塘養(yǎng)殖中接觸到的實(shí)際質(zhì)量濃度可能會(huì)高于水中測(cè)定結(jié)果，因此。在制定三疣梭子蟹的養(yǎng)殖規(guī)范時(shí)，應(yīng)將Cd2+質(zhì)量濃度要求定得更低。

3.2Cd2+對(duì)三疣梭子蟹肝胰腺中HSP70表達(dá)的影響

HSPs廣泛存在于從原核生物到哺乳動(dòng)物的整個(gè)生物界，是進(jìn)化上高度保守、功能上至關(guān)重要的一類蛋白[13]。正常情況下，HSPs的表達(dá)量較少，主要起到分子伴侶的作用。在應(yīng)激條件下，HSP能夠在細(xì)胞核和胞液之間轉(zhuǎn)運(yùn)，修復(fù)錯(cuò)誤折疊蛋白，加快正常蛋白質(zhì)合成以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞功能的恢復(fù)，同時(shí)增強(qiáng)機(jī)體的應(yīng)激耐受性，提高細(xì)胞生存率[14]。因此，環(huán)境脅迫會(huì)引起生物體的應(yīng)激蛋白(HSPs)表達(dá)水平的提高[15]。HSP家族中的HSP70因在受到環(huán)境刺激時(shí)表達(dá)量最多且對(duì)環(huán)境刺激敏感而在環(huán)境脅迫研究中受到廣泛關(guān)注。鎘暴露能引起野生貽貝消化道內(nèi)HSP70的表達(dá)量呈直線上升[16]。氯化鎘誘導(dǎo)L929細(xì)胞株中HSP70的表達(dá)明顯增高[17]，草蝦Palaeomonetespugio受鎘脅迫后HSP70的表達(dá)顯著增加[18]。RAJESHKUMAR et al[19]發(fā)現(xiàn)受鎘污染的遮目魚Chanoschanos肝細(xì)胞內(nèi)HSP70表達(dá)上升與水污染的程度有關(guān)。當(dāng)甲殼動(dòng)物受到脅迫時(shí)，肝胰腺是重金屬積累的主要場(chǎng)所，在毒理學(xué)研究中，甲殼動(dòng)物的肝胰腺常被用作檢測(cè)的靶標(biāo)器官[20]。因此，可以通過甲殼動(dòng)物肝胰腺中HSP70的表達(dá)量來反應(yīng)環(huán)境中Cd2+的污染情況。本研究中，三疣梭子蟹肝胰腺中HSP70的表達(dá)量受到Cd2+的影響，隨時(shí)間變化先上升后下降，表現(xiàn)為倒“U”型趨勢(shì)，并且效應(yīng)與Cd2+質(zhì)量濃度呈現(xiàn)正相關(guān)，這與上述文獻(xiàn)中其他物種在Cd2+脅迫下HSP70表達(dá)增高的結(jié)論一致。在理論安全質(zhì)量濃度(SC)時(shí)，HSP70表達(dá)量是對(duì)照組的6倍；在漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)要求質(zhì)量濃度下，三疣梭子蟹肝胰腺中HSP70的表達(dá)量仍然顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，這說明低質(zhì)量濃度的Cd2+仍能影響三疣梭子蟹肝胰腺HSP70基因的表達(dá)，因此，我們認(rèn)為，漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)中Cd2+的允許質(zhì)量濃度還需要降低。

3.3Cd2+對(duì)三疣梭子蟹鰓中HSP70表達(dá)的影響

重金屬在水生生物體內(nèi)的積累與分布與不同組織的生理功能密切相關(guān)，鰓是三疣梭子蟹最重要的呼吸器官和滲透壓調(diào)節(jié)器官，也是外界污染物的早期靶點(diǎn)。盧敬讓 等[21]報(bào)道過鎘暴露導(dǎo)致中華絨螯蟹Eriocheirsinensis鰓組織和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的損傷。與肝胰腺相比鰓更早地接觸到鎘污染，鰓中含鈣較多，鈣元素和鎘元素化學(xué)性質(zhì)相似，具有相同的電荷數(shù)和相近的離子直徑，鎘離子可替代鈣離子進(jìn)入鰓中[22]。鰓中HSP70為了維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)，緩解機(jī)體受到的應(yīng)激損傷，在鰓中大量表達(dá)。本研究中，三疣梭子蟹鰓中HSP70的表達(dá)量隨時(shí)間呈現(xiàn)出先升高后降低的趨勢(shì)。在鎘脅迫下鰓中HSP70的表達(dá)量總體大于肝胰腺中，但對(duì)照組中HSP70表達(dá)量低于肝胰腺中，這可能是由于肝胰腺是三疣梭子蟹主要的解毒器官，在正常的代謝過程中會(huì)伴隨產(chǎn)生活性氧，活性氧過度積累會(huì)影響細(xì)胞的正常呼吸，HSP70可抑制產(chǎn)生氧自由基的關(guān)鍵酶即煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶，又能提高內(nèi)源性過氧化酶如SOD水平，從而加快氧自由基的消除[23]。肝胰腺作為營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的代謝中心，需要較強(qiáng)的抗氧化系統(tǒng)清除肝胰腺中的多余活性氧。

4結(jié)論

本文通過Cd2+對(duì)三疣梭子蟹急性和亞急性暴露試驗(yàn)分析，得出以下結(jié)論：

(1)Cd2+對(duì)三疣梭子蟹的毒性作用很強(qiáng)，在高質(zhì)量濃度Cd2+脅迫下，呈現(xiàn)較為明顯的劑量-效應(yīng)和時(shí)間-效應(yīng)關(guān)系。Cd2+對(duì)三疣梭子蟹48，72和96 h的半致死質(zhì)量濃度分別為6.55，4.33和3.12 mg/L，理論安全質(zhì)量濃度為0.31 mg/L。

(2)在低質(zhì)量濃度Cd2+脅迫下，利用高保守性分子HSP70檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在國(guó)家漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)(<0.005 mg/L)時(shí)，仍能引起三疣梭子蟹HSP70的顯著表達(dá)(P<0.05)。因此，從三疣梭子蟹養(yǎng)殖和食品安全的角度，漁業(yè)水質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)的Cd2+允許質(zhì)量濃度需要進(jìn)一步降低。

參考文獻(xiàn)(References)：

[1] NAN Xu-yang. Effects of heavy metals Cu, Zn and Cd on toxic effect and white blood cell phagocytosis ofOrientalweatherfish[J]. Shanxi Journal of Agricultural Sciences,2009(2):40-53.

南旭陽.重金屬Cu、Zn和Cd對(duì)泥鰍毒性效應(yīng)和白細(xì)胞吞噬能力的影響[J].陜西農(nóng)業(yè)科學(xué),2009(2):40-53.

[2] ZHANG Jing, GUO Shao-hua. Effects of environmental estrogen on the fish immune system[J]. Science & Technol,2012(5):266.

張靜,郭少華.環(huán)境雌激素對(duì)魚類免疫系統(tǒng)的影響[J].科技信息,2012(5):266.

[3] XU Jin-rong, WANG Chun-lin, MU Chang-kao, et al. Relationship between oxygen consumption and oxygen consumption rate and the bodymass ofPortunustrituberculatusat its early development stage[J]. Journal of Marine Sciences,2012,30(1):102-106.

許金榮,王春琳,母昌考，等.三疣梭子蟹早期發(fā)育階段的耗氧量、耗氧率與體質(zhì)量的關(guān)系[J].海洋學(xué)研究,2012,30(1):102-106.

[4] LIU Mu, ZHANG Xiao-yan, YANG Ling, et al. Cloning the heat shock protein 70(HSP70) ofPortunustrituberculatus[J]. Journal of Zao Zhuang University,2009,26(2):76-81.

劉牧,張曉燕,楊嶺,等.三疣梭子蟹熱休克蛋白70的基因克隆[J].棗莊學(xué)院學(xué)報(bào),2009,26(2):76-81.

[5] BAI You-cheng, GAO Sheng-quan, JIN Hai-yan, et al. Potential ecological risk assessment of heavy metals in the sediments of Changjiang River Estuary and its adjacent sea area[J]. Journal of Marine Sciences,2011,29(4):32-42.

白有成,高生泉,金海燕，等.長(zhǎng)江口及鄰近海域沉積物重金屬潛在生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)[J].海洋學(xué)研究,2011,29(4):32-42.

[6] General Administration of Quality Supervision, Inspection and Quarantine of the People’s Republic of China. GB/T 21814-2008 Testing methods for industrial wastewater-fish acute toxicity[S]. Beijing: Standards Press of China,2008.

中華人民共和國(guó)國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局．GB/T 21814-2008工業(yè)廢水的試驗(yàn)方法魚類急性毒性試驗(yàn)[S].北京:中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008.

[7] CUI Zhao-xia, LIU Yuan, LUAN Wei-sha, et al. Molecular cloning and characterization of a heat shock protein 70 gene in swimming crab (Portunustrituberculatus)[J]. Fish & Shellfish Immunology,2010,28(2):56-64.

[8] LIVAK K J, SCHMITTGEN T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) method[J]. Methods,2001,25(4):402-408.

[9] LI Mei, SUN Jia-long, QU Li-ya. A survey of cadmium pollution in Hezhang County and its effects on human health[J]. Journal of Guiyang Medical College,2007,32(5):464-470.

李梅,孫嘉龍,瞿麗雅.赫章縣鎘污染調(diào)查及人體健康的影響[J].貴陽醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2007,32(5):464-470.

[10] XU Yan, WANG You, ZHOU Bin, et al. Study on single and joint toxic effects of cadmium and lead onRuditapesphilippinarum[J]. Marine Environmental Science,2013,32(1):6-10.

徐彥,王悠,周斌,等.Cd2+和Pb2+的單一和復(fù)合作用對(duì)菲律賓蛤仔的急性毒性效應(yīng)研究[J].海洋環(huán)境科學(xué),2013,32(1):6-10.

[11] ZHOU Hui-ming, WU Zhi-qiang, YUAN Le-yang, et al. Toxicity and accumulation of three heavy metals inlarvalcarps[J]. Journal of Nanchang University,2005,29(3):292-295.

周輝明,吳志強(qiáng),袁樂洋,等.三種重金屬對(duì)鯉魚幼魚的毒性和積累[J].南昌大學(xué)學(xué)報(bào),2005,29(3):292-295.

[12] ZENG Hai-xiang, ZHU Jun-quan, DING Li-fa. Heavy metals Cu, Zn and Cd on toxic effect ofPhascolosomaesculenta[J]. Reservoir Fisheries,2006,144(26):96-99.

曾海祥,竺俊全,丁理法.重金屬鎘和鋅對(duì)可口革囊星蟲的毒性試驗(yàn)[J].水利漁業(yè),2006,144(26):96-99.

[13] QU Ling-yun, SUN Xiu-qin, XIANG Jian-hai, et al. Advances in study on Heat Shock Protein[J]. Advances in Marine Science,2004，22(3):385-391.

曲凌云,孫修勤,相建海，等.熱休克蛋白研究進(jìn)展[J].海洋科學(xué)進(jìn)展，2004,22(3):385-391.

[14] LI Yi-dong. The mechanisms and biological significance of small G protein RhoB expression induced by non-genotoxic stress[D]. Shanghai: Second Military Medical University,2008.

李憶東.非基因毒應(yīng)激對(duì)小G蛋白R(shí)hoB表達(dá)的誘導(dǎo)作用、機(jī)制及生物學(xué)意義[D].上海：第二軍醫(yī)大學(xué),2008.

[15] SHEN Hua, WANG Xiao-rong, ZHANG Jing-fei, et al. Western blotting responses of Heat Shock Protein(HSP70) in the liver of young fish,CarassiusAuratusto lower concentration of zinc(Zn2+)[J]. Journal of Agro-Environment Science,2004,23(3):441-443.

沈驊,王曉蓉,張景飛，等.低濃度Zn對(duì)幼齡鯽魚肝臟組織應(yīng)激蛋白HSP70誘導(dǎo)的影響[J].農(nóng)業(yè)環(huán)境科學(xué)學(xué)報(bào)，2004，23(3):441-443.

[16] MICOVIC V, BULOG A, KUCIC N, et al. Metallothioneins and heat shock proteins 70 in marine mussels as sensors of environmental pollution in Northern Adriatic Sea[J]. Environ Toxicol Phar,2009,28(3):439-447.

[17] GIBNEY E, GAULT J, WILLIAMS J. A novel immunohistochemistry technique to measure hsp70 induction in L929 cells exposed to cadmium chloride[J]. Biomarkers,2004,9(7):353-363.

[18] DOWNS C A，F(xiàn)AUTH J E, WOODLEY C M. Assessing the health of grass shrimp (Palaeomonetespugio) exposed to natural and anthropogenic stressors: a molecular biomarker system [J]. Marine Biotechnology,2001,3(4):380-397.

[19] RAJESHKUMAR S, MUNUSWAMY N. Impact of metals on histopathology and expression of HSP 70 in different tissues of Milk fish (Chanoschanos) of Kaattuppalli Island, South East Coast, India[J]. Chemosphere,2011,83(4):415-421.

[20] LI Yan-dong. Studies on toxic effects of water-borne Cadmium on matured Chinese Mitten-handed crab,Eriocheirsinensis[D]. Shanghai: East China Normal University,2007.

李艷東.水體鎘對(duì)中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)親體毒性作用研究[D].上海：華東師范大學(xué),2007.

[21] LU Jing-rang, LAI Wei. Effects of cadmium on tissue and ultrastructure of gill ofEriocheirsinensis[J]. Oceanologia et Limnologia Sinica,1991,22(6):565-570.

盧敬讓,賴偉．鎘對(duì)中華絨螯蟹鰓組織亞顯微結(jié)構(gòu)的影響[J].海洋與湖沼,1991,22(6):565-570.

[22] JENNING J R, RAINBOW P S. Studies on the uptake of cadmium by the crabCarcinusmaenasin the laboratory. I. Accumulation from seawater and a food source[J]. Marine Biology,1979,50(2):131-139.

[23] LIU Ying-hua, FU Qing-jie, LI Ming-chun. Regulation mechanism and expression of HSP70 under stress and damage[J]. Prac J Med & Pharm,2011,28(12):1 129-1 131.

柳迎華,付青姐,李明春.應(yīng)激及其損傷時(shí)HSP70表達(dá)及調(diào)控機(jī)制[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志,2011,28(12):1 129-1 131.

Study on toxic effect of cadmium onPortunustrituberculatus

SONG Guo-lin, MU Chang-kao*, LI Rong-hua, WANG Chun-lin

(SchoolofMarineSciences,NingboUniversity,Ningbo315211,China)

Abstract:In this study, acute and sub-acute experiments were conducted to elucidate the toxic effect of cadmium on Portunus trituberculatus. The results show that the median lethal dose of cadmium are 6.55, 4.33 and 3.12 mg/L for 48 h，72 h and 96 h respectively, and the safe concentration of this metal is 0.31 mg/L. As the extension of exposure time, the expressions of HSP70 in hepatopancreas and gill are increased at the beginning, and then decreased significantly under the safe concentration and fishery water quality standard. Compared with control group, the expression of HSP70 in gill is more obvious than that in hepatopancreas. Under the safe concentration, the survival rate of Portunus trituberculatus is not changed obviously, but the excessive expression of HSP70 reflects that the crab is stressed by Cd(2+) exposure, so HSP70 indicators can be reflected more sensitive than the median lethal concentration at low concentration of Cd(2+ )pollution.

Key words:Portunus trituberculatus；Cd(2+)；acute toxicity test；HSP70

Doi:10.3969/j.issn.1001-909X.2016.01.008

中圖分類號(hào):S917.4

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼:A

文章編號(hào):1001-909X(2016)01-0061-06

作者簡(jiǎn)介:宋國(guó)林(1991-)，男，甘肅秦安縣人，主要從事水產(chǎn)動(dòng)物健康養(yǎng)殖方面的研究。 E-mail：nbusgl@sina.cn*通訊作者:母昌考(1976-)，男，副教授，主要從事甲殼動(dòng)物養(yǎng)殖方面的研究。E-mail：muchangkao@nbu.edu.cn

基金項(xiàng)目:寧波市重大科技攻關(guān)計(jì)劃項(xiàng)目資助(2013C11017)；浙江省公益性技術(shù)應(yīng)用研究計(jì)劃資助(2011C33025)

收稿日期:2015-04-22修回日期:2015-10-11

宋國(guó)林，母昌考，李榮華，等. Cd2+對(duì)三疣梭子蟹的毒性效應(yīng)研究[J]. 海洋學(xué)研究,2016,34(1):61-66, doi:10.3969/j.issn.1001-909X.2016.01.008.

SONG Guo-lin, MU Chang-kao, LI Rong-hua，et al. Study on toxic effect of cadmium onPortunustrituberculatus[J]. Journal of Marine Sciences, 2016,34(1):61-66, doi:10.3969/j.issn.1001-909X.2016.01.008.