賈敢敢，白 晨，張惠忠，李曉東，張 輝，付增娟，王 良

（內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010031）

甜菜是中國(guó)北方的重要的糖料作物，隨著雜種優(yōu)勢(shì)理論提出及其實(shí)踐效應(yīng)證明，雜交育種在各類農(nóng)作物育種過程中已屢見不鮮。因甜菜雌雄同體、花器較小等一系列原因造成的雜交育種過程中的困難就需要不育系來解決，普遍應(yīng)用甜菜CMS（Cytoplasmic Male Sterility）接受其對(duì)應(yīng)的保持系花粉進(jìn)行繁殖[1]。

在所發(fā)現(xiàn)的甜菜不育系類型中分為核不育、質(zhì)不育、質(zhì)核互作不育3種類型，其中質(zhì)核互作造成的不育植株在甜菜雜交育種中廣泛應(yīng)用。近年來對(duì)甜菜質(zhì)核互作不育植株（CMS）的研究成果也越來越多，結(jié)合前人對(duì)甜菜線粒體基因的特異序列研究及引物開發(fā)的成果，可以初步辨別不育系選育過程中出現(xiàn)的諸多類型。目前，對(duì)甜菜CMS植株的研究應(yīng)用集中表現(xiàn)在核質(zhì)基因特異序列的分子鑒定技術(shù)的廣泛應(yīng)用以及甜菜蛋白質(zhì)組學(xué)的差異蛋白分析。2009年黑龍江大學(xué)曹洪祥等[2]對(duì)甜菜M14品系的花期花器蛋白的雙向電泳差異分析檢測(cè)到1 000+的蛋白質(zhì)點(diǎn)，牛佳[3]等2013年也得到了高豐度的蛋白質(zhì)點(diǎn)圖譜，得到400+的蛋白質(zhì)點(diǎn)并對(duì)甜菜保持系及對(duì)應(yīng)不育系的差異蛋白進(jìn)行了初步分析，提出甜菜育性相關(guān)基因的開始表達(dá)時(shí)期和花期同育性相關(guān)的幾種蛋白。同時(shí)王有昭在2009年對(duì)國(guó)內(nèi)的55個(gè)甜菜品種的胞質(zhì)基因進(jìn)行VNTR序列電泳檢測(cè)并得到了準(zhǔn)確的多類型不育系甜菜植株的檢測(cè)結(jié)果及特異重復(fù)序列的測(cè)定[4]。且課題組在不久前對(duì)內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院特色作物所的現(xiàn)有不育系種質(zhì)資源進(jìn)行了不育植株類型的檢測(cè)[5]。

在很多物種中都已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了決定CMS的線粒體基因，例如，在日本野生蘿卜中發(fā)現(xiàn)的小倉(cāng)型（Ogura）細(xì)胞質(zhì)雄性不育[6]是由雄性不育誘導(dǎo)基因（orf138）決定[7-9]，且推測(cè)該基因是基因內(nèi)重組的結(jié)果，并且這個(gè)位點(diǎn)的特殊結(jié)構(gòu)決定了orf138基因的穩(wěn)定性。同時(shí)絕大多數(shù)的核恢復(fù)基因會(huì)影響CMS基因，導(dǎo)致CMS相關(guān)的雙順反mRNAs突變，進(jìn)而導(dǎo)致其伴侶基因表達(dá)的單順反mRNAs的增加。鑒于甜菜育種的兩系雜交特殊性在研究方面?zhèn)戎赜诓挥岛捅３窒档牟町惖鞍追蛛x、鑒定及各差異蛋白的相互關(guān)系。

本試驗(yàn)將田間調(diào)查和分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)相結(jié)合，對(duì)選育過程中多種類型不育系進(jìn)行雙向蛋白電泳差異比對(duì)，以1945年美國(guó)科學(xué)家F.Owen報(bào)道提出的雄性不育機(jī)制猜想為理論基礎(chǔ)，進(jìn)一步探究其在分子標(biāo)記技術(shù)上的差異是否存在對(duì)應(yīng)的蛋白表達(dá)差異，并尋求育性相關(guān)核基因的表達(dá)規(guī)律。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 以內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院特色作物所擬選育的甜菜CMS植株為材料，共取91株。

1.1.2 引物 甜菜細(xì)胞質(zhì)育性相關(guān)的小衛(wèi)星分子標(biāo)記引物TR1、TR3，引物序列由國(guó)家甜菜產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系分子育種崗位提供，引物由南京金斯瑞生物公司完成。其引物序列見表1。

表1 對(duì)線粒體VNTR片段的擴(kuò)增引物序列

1.1.3 試劑 植物DNA提取試劑盒、丙酮、TCA、DTT、碘乙酰胺、SDS、尿素、甘氨酸等。

1.2 方法

1.2.1 CMS型選育過程中的單株出粉調(diào)查 從甜菜CMS植株的發(fā)現(xiàn)，人們一直對(duì)甜菜質(zhì)核互作的核基因調(diào)控情況存在疑惑。一種認(rèn)為其為兩對(duì)顯性基因X、Z控制，另一種則認(rèn)為其是由一組數(shù)量基因來控制的。本試驗(yàn)對(duì)選育過程中的P2代CMS系列進(jìn)行田間花粉調(diào)查并記錄。

1.2.2 PCR擴(kuò)增 利用TR1、TR3引物，對(duì)所調(diào)查的CMS系列植株的全基因組進(jìn)行擴(kuò)增。25 μL體系含12.5 μL 2×Tap Master Mix，1 μL 上游引物，1 μL 下游引物，2 μL 基因組 DNA，8.5 μL ddH2O。PCR 程序?yàn)?4℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸1 min，循環(huán)35；72℃延伸10 min，4℃保存。待PCR結(jié)束后將其擴(kuò)增產(chǎn)物于1.2%的瓊脂糖凝膠上電泳，凝膠成像儀上照相保存。

1.2.3 蛋白提取 采用丙酮（TCA）沉淀法分別對(duì)CMS系列植株進(jìn)行苗期葉片、花期花序的蛋白提取。

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等電聚焦：采用伯樂IEF等電聚焦儀進(jìn)行第一項(xiàng)水化蛋白等電聚焦，聚焦方案參考蛋白雙向電泳培訓(xùn)手冊(cè)并進(jìn)行優(yōu)化，已得到高通量蛋白圖譜。

SDS-PAGE凝膠電泳：將第一項(xiàng)等電聚焦完畢的IPG預(yù)制膠條轉(zhuǎn)入垂直板12%聚丙烯酰胺凝膠中電泳。電泳完畢后采用經(jīng)典考染法進(jìn)行蛋白凝膠染色，于凝膠成像儀中照相保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)來自同一系列的P2 CMS單株進(jìn)行花期花粉調(diào)查分類

受試植株于2015年4月1日播種窖藏母根，同年6月1日對(duì)抽薹開花植株進(jìn)行花粉出粉情況調(diào)查，見表2。

對(duì)內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院特色作物所選育中的不育系進(jìn)行二年生階段的田間植株性狀調(diào)查，種植母根由上年同系單株對(duì)應(yīng)編號(hào)分株收獲、窖存，次年栽植田間。由表2可知，選育過程中的不育系系列植株在花粉出粉情況方面存在一定的多樣性，能夠從中篩選出供后續(xù)試驗(yàn)選用的目的材料。

表2 甜菜不育系田間植株出苗、抽薹、花粉情況

2.2 對(duì)調(diào)查中不同類型的CMS單株進(jìn)行基因組DNA提取并對(duì)其進(jìn)行VNTR微衛(wèi)星分子標(biāo)記鑒定

從所選植株中選取具有代表性的植株進(jìn)行DNA提取以備其VNTR微衛(wèi)星分子標(biāo)記鑒定，部分DNA提取情況見圖1，其濃度符合鑒定所需的PCR模板濃度。

將提取的模板DNA按1.2.2中所列的PCR體系模式進(jìn)行擴(kuò)增，其電泳檢測(cè)結(jié)果分別見圖1-B，圖1-C，圖1-D。圖1-B是在選育系列中趨于穩(wěn)定并已進(jìn)行擴(kuò)繁的材料，其所用引物為TR1、TR3，標(biāo)號(hào)1，2分別為保持系及對(duì)應(yīng)不育系；圖1-C是各類型受試植株TR1引物檢測(cè)圖；圖1-D是各類型受試植株TR3引物檢測(cè)圖。選取能進(jìn)行普遍鑒定甜菜Owen型胞質(zhì)的兩種引物TR1、TR3，并對(duì)已經(jīng)趨于穩(wěn)定符合育種標(biāo)準(zhǔn)的不育保持系進(jìn)行模板對(duì)照檢測(cè)。檢測(cè)依據(jù)為對(duì)應(yīng)引物下質(zhì)基因特異性片段的重復(fù)數(shù)不同，其中Owen型不育系胞質(zhì)的重復(fù)特異性片段重復(fù)數(shù)分別是TR1為4，TR3為2[6]。圖1-C，1-D中標(biāo)號(hào)1，2為穩(wěn)定不育系及對(duì)應(yīng)保持系，標(biāo)號(hào)3～9則為調(diào)查結(jié)果中選取具代表性出粉情況的不育系植株。兩種引物的檢測(cè)結(jié)果有一定的統(tǒng)一性和差異性，表明了在甜菜田間育種過程中存在多種不同胞質(zhì)類型的不育系體系，同時(shí)也顯露出目前胞質(zhì)鑒定引物的局限性。

表3為代表性不育系試驗(yàn)材料編號(hào)及對(duì)應(yīng)VNTR鑒定結(jié)果。材料2為穩(wěn)定保持系，鑒定結(jié)果為可育胞質(zhì)，材料 4，5，6，7，9 則為 Owen 型不育胞質(zhì)有粉植株，3為鑒定結(jié)果爭(zhēng)議植株，8為Owen型不育胞質(zhì)敗育植株。

表3 代表性受試材料編號(hào)、出粉情況、胞質(zhì)類型

2.3 對(duì)不同類型的CMS單株花序蛋白雙向蛋白圖譜比對(duì)分析

對(duì)受試植株中的參考組，提取其苗期葉片蛋白進(jìn)行雙向蛋白圖譜Image Master 2D Platinum 5.0軟件分析，并在參考組內(nèi)不育系間及保持系間進(jìn)行2DE蛋白圖譜比對(duì)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在選定的參考組內(nèi)385個(gè)蛋白點(diǎn)圖譜中發(fā)現(xiàn)差異點(diǎn)12個(gè)，在參考組內(nèi)的保持系間及不育系間的多對(duì)比對(duì)發(fā)現(xiàn)蛋白差異點(diǎn)總和23個(gè)，并且包含前者發(fā)現(xiàn)的12個(gè)蛋白差異點(diǎn)。也就是說在苗期保持系與不育系的雙向蛋白電泳圖譜有較高的匹配率，并且此類差異能夠在不育系間和保持系間重復(fù)顯現(xiàn)。進(jìn)一步得出無論甜菜的胞質(zhì)基因還是核基因在育性相關(guān)上，在苗期的蛋白表達(dá)均不表現(xiàn)差異表達(dá)。之后又對(duì)編號(hào)3～9的7種類型差異表達(dá)，在甜菜植株雄蕊原基分化期的花蕾提取蛋白進(jìn)行蛋白提取及雙向蛋白電泳，各自的蛋白圖譜同參考組中的不育圖譜進(jìn)行比對(duì)分析，再將其差異同參考組內(nèi)的差異進(jìn)行比對(duì)，其結(jié)果見圖2。其中各不育系同參考不育系對(duì)比發(fā)現(xiàn)差異點(diǎn)數(shù)分別為 7，5，4，6，8，11，18 個(gè)；參考組間的差異蛋白點(diǎn)數(shù)為13個(gè)，在各個(gè)差異中所共存的差異蛋白點(diǎn)數(shù)2個(gè)。初步推測(cè)在雄蕊原基分化期甜菜育性基因已經(jīng)參與調(diào)控表達(dá)，且質(zhì)核基因?qū)е碌牟町愒诒磉_(dá)調(diào)控上存在共同之處，但對(duì)最終表達(dá)的差異上又存在不同，導(dǎo)致了在性狀上所表現(xiàn)的花藥顏色、出粉程度上的不同。

3 討論

整個(gè)試驗(yàn)首先在苗期對(duì)內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科院特色作物所選育過程中的不育系及選育成型的不育保持系對(duì)進(jìn)行VNTR分子標(biāo)記檢測(cè)；在受試材料花期中的雄蕊原基分化期花蕾進(jìn)行取樣預(yù)留；對(duì)花期花粉出粉情況及花藥顏色進(jìn)行田間調(diào)查統(tǒng)計(jì)；最后在田間花粉情況和分子標(biāo)記檢測(cè)的共同基礎(chǔ)上將取樣預(yù)留的花蕾分類進(jìn)行2DE蛋白電泳，并將所得蛋白圖譜通過Image Master 2D Platinum 5.0軟件分析，得出甜菜質(zhì)核基因在育性表達(dá)上的推測(cè)，為質(zhì)核互作不育的機(jī)理探究指明方向。

3.1 甜菜不育系選育過程中的花粉情況分析

受試植株在花期除未出苗和未抽薹外共有38株在同一時(shí)期到達(dá)雄蕊原基分化期，其中分為：白敗、黃敗、不育I型白敗、不育I型黃敗、不育II型白敗、不育II型黃敗、不育黃色有粉7種類型，各自的植株數(shù)分別為 7，8，6，4，5，5，3 株。這就說明在內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院特色作物所提供的選育中不育系核基因會(huì)分離出不同的類型，但對(duì)于前人提出甜菜質(zhì)核互作雙隱性核基因調(diào)控或是數(shù)量基因調(diào)控并不能得到推測(cè)認(rèn)定。若想驗(yàn)證不育系核育性核基因類型還需要進(jìn)一步的大量統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)。

3.2 關(guān)于VNTR甜菜不育胞質(zhì)特異序列的分類鑒定

對(duì)得到的38株重點(diǎn)植株進(jìn)行已有引物TR1、TR3的PCR特異序列檢測(cè)見圖1-C，圖1-D，其中對(duì)于前面提到的7種類型的檢測(cè)結(jié)果顯示前6種均屬于Owen型不育胞質(zhì)，對(duì)于不育有粉植株中存在Owen型保持系胞質(zhì)見圖1-D及表3，對(duì)比可以看出標(biāo)號(hào)5同參考組中的保持系即標(biāo)號(hào)2一致，屬于育種過程中的混雜現(xiàn)象，編號(hào)9結(jié)合圖1-D和表3發(fā)現(xiàn)其是擁有不育胞質(zhì)的有粉植株。同時(shí)成功體現(xiàn)現(xiàn)有引物對(duì)Owen型甜菜不育系列鑒定上的參考價(jià)值，也為后期蛋白圖譜比對(duì)過程中除去胞質(zhì)基因調(diào)控引起差異的干擾。

3.3 7種類型間雙向蛋白圖譜比對(duì)分析討論

對(duì)蛋白圖譜存在的差異結(jié)果分析不難得出不育I，不育II在基因調(diào)控上同參考組不育系調(diào)控上存在一定的一致性，同時(shí)各自也有自身的特點(diǎn)，推測(cè)為核恢復(fù)基因在改變育性上的決定性作用，也可能是花粉顏色基因引起的差異。如要排除此類影響還需在對(duì)同一穩(wěn)定系列甜菜品種的花藥顏色進(jìn)行參考對(duì)比。而對(duì)于不育有粉植株則均屬于黃色花藥，且不育有粉型存在的差異點(diǎn)不僅包含了對(duì)照組共有大多數(shù)差異，還出現(xiàn)了其他各類型均不存在的差異點(diǎn)5個(gè)，推測(cè)為全部核恢復(fù)基因共同調(diào)控的結(jié)果，并且是在質(zhì)基因調(diào)控的基礎(chǔ)上出現(xiàn)的核基因表達(dá)，而不是核恢復(fù)基因抑制質(zhì)基因的表達(dá)，這同2004年在大豆中鑒定出的一些在乙烯合成，細(xì)胞程序化死亡，ATP合成，淀粉合成過程中起關(guān)鍵作用的蛋白在導(dǎo)致雄性不育的協(xié)作關(guān)系相似。

試驗(yàn)為甜菜不育蛋白質(zhì)組學(xué)中差異蛋白質(zhì)組學(xué)提出了研究方向和大膽推測(cè)，為后續(xù)對(duì)蛋白差異點(diǎn)的質(zhì)譜分析、不育質(zhì)核互作機(jī)理的完善做準(zhǔn)備。

致謝：

感謝白晨老師對(duì)試驗(yàn)的指導(dǎo)意見和資金支持，感謝內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院特色作物所提供的試驗(yàn)材料以及試驗(yàn)過程中的幫助，感謝李曉東、張輝等的試驗(yàn)指導(dǎo)。

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