肖新才, 鄧萌萌, 肖　咪，熊小翠，張瑞連

(中南民族大學(xué) 藥學(xué)院，武漢430074)

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自組裝法制備絲心蛋白微球

肖新才, 鄧萌萌, 肖咪，熊小翠，張瑞連

(中南民族大學(xué) 藥學(xué)院，武漢430074)

摘要采用自組裝法以脫膠天然蠶絲為原料，制備了絲心蛋白微球.對影響微球的成球效果的因素如攪拌速度、乙醇(EtOH)用量、絲心蛋白(SF)濃度和冷凍溫度進(jìn)行了初步探索.結(jié)果表明：當(dāng)V(EtOH) /V(SF)=1︰20，w(SF)=7.0%時(shí)，以n=100 r/min的速度進(jìn)行攪拌，再放入-20℃環(huán)境下冷凍24 h最后室溫融化，可獲得較理想的絲心蛋白微球.

關(guān)鍵詞自組裝；絲心蛋白；微球

Preparation of Fibroin Microspheres by Self-assembly Method

XiaoXincai,DengMengmeng,XiaoMi,XiongXiaocui,ZhangRuilian

(College of Pharmacy, South-Central University for Nationalities,Wuhan 430074,China)

AbstractFibroin microspheres of degummed natural silk were successfully prepared by self-assembly method. The effect of stirring speed, amount of ethanol, concentration of fibroin and freezing temperature on the forming of the microcapsules were investigated. The results indicated that well shaped fibroin microspheres could be prepared with a stirring speed of 100 r/min, aV(EtOH)︰V(SF) ratio of 1︰20,w(SF) = 7.0%, followed by freezing at -20℃ for 24 h, and finally melting at room temperature.

Keywordsself-assembly; fibroin; microspheres

絲心蛋白是以脫膠蠶絲為原料制成的纖維蛋白質(zhì)，由1條H鏈和1條L鏈通過 S-S 鍵結(jié)合而成，主要由甘氨酸、丙氨酸和絲氨酸組成[1].近年隨著生物技術(shù)的迅速發(fā)展和廣泛應(yīng)用，國內(nèi)外對絲心蛋白的研究利用越來越重視，為絲心蛋白及其水解產(chǎn)物在醫(yī)藥衛(wèi)生、生物技術(shù)、化妝品、食品等領(lǐng)域中的應(yīng)用展示了廣闊的前景.絲心蛋白在藥物緩釋，特別是價(jià)格昂貴、性質(zhì)敏感的蛋白質(zhì)、多肽以及基因藥物緩釋方面的應(yīng)用正成為一個(gè)新的研究熱點(diǎn)[2,4]，其作為燒傷創(chuàng)面覆蓋膜、抗凝血材料、骨修復(fù)支架等材料，具有無毒無刺激、穩(wěn)定較好性等特點(diǎn)，為藥物提供了有利的載體條件[5,6].從生物相容性、藥物相容性和可控釋性來看, 絲心蛋白均有望成為新一代的蛋白質(zhì)和基因藥物的控釋載體[7,8].

納米和微米級的微球因具有比表面積大、低密度、高穩(wěn)定性等特性而作為一種新的功能性材料，在藥物控釋領(lǐng)域具有廣泛應(yīng)用[9,10].隨著研究的不斷深入，國內(nèi)外對絲心蛋白微球的制備技術(shù)不斷發(fā)展，如乳化法、噴霧干燥法、相分離法、層流射流技術(shù)等[11,12]，但由于絲心蛋白屬于蛋白質(zhì)類，其性質(zhì)的不穩(wěn)定性導(dǎo)致其微球的制備效果不理想.

自組裝法[13]是如今制備絲心蛋白微球較有效且具有發(fā)展前景的方法，其中蛋白質(zhì)或多肽分子自組裝主要依靠氫鍵、靜電相互作用和疏水相互作用等次級鍵的作用[14]，以保證蛋白質(zhì)能夠在制備過程中有效避免使用乳化法、噴霧干燥法、相分離法、層流射流技術(shù)等方法中存在的高速攪拌、有毒有機(jī)溶劑等其他制備方式對蛋白質(zhì)活性的損害問題，保持了絲心蛋白良好的生物活性.本文用自組裝法初步探索了絲心蛋白微球的制備，研究了攪拌速度、乙醇(EtOH)用量、絲心蛋白(SF)濃度和冷凍溫度對影響微球的成球效果的影響，以期采用較簡捷的設(shè)備和常用藥品來制備圓球狀、粒徑約200 nm的絲心蛋白微球.

1實(shí)驗(yàn)部分

1.1試劑和儀器

氫氧化鈉(NaOH, 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，溴化鋰(LiBr, 阿拉丁試劑公司)， 無水乙醇(C2H5OH, 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)，天然蠶絲.

聚熱式恒溫加熱磁力攪拌器(DF-101S型, 鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)，透射電子顯微鏡(TecnaiG2 20S-TWIN, FEI公司)，電子天平(AR2140型, 上海奧豪斯儀器有限公司)，數(shù)顯電動(dòng)攪拌器(DW-3型,鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司)，動(dòng)靜態(tài)激光散射儀(BI-200SM/BI-200SM, 美國布魯克海文).

1.2方法和原理

1.2.1制備原理

蠶絲是由絲心蛋白(SF)和絲膠兩部分組成，絲膠包裹在絲心蛋白的外部，絲心蛋白是蠶絲的主要組成部分，約占重量的70%. 絲心蛋白以反平行折疊鏈構(gòu)象為基礎(chǔ)，形成直徑約10 nm的微纖維，無數(shù)微纖維密切結(jié)合成直徑約為1 μm的細(xì)纖維，約100根細(xì)纖維沿長軸排列構(gòu)成直徑約10 ～18 μm的單纖維，即蠶絲蛋白纖維.絲心蛋白纖維分子在乙醇作用下，使絲心蛋白由無規(guī)則卷曲，轉(zhuǎn)換成β-折疊結(jié)構(gòu)形成微晶，隨后在冷凍過程中，提供的剪切力誘導(dǎo)絲心蛋白構(gòu)象發(fā)生改變，形成一種微型球體.

1.2.2蠶絲的脫膠處理

稱取一定量的蠶絲，置于1.0 mol/L NaOH調(diào)節(jié)至pH 10.5的蒸餾水中，浴比(質(zhì)量比)1︰100，溫度100℃，在電熱恒溫槽中脫膠30 min.換液保持同樣條件重復(fù)煮沸4次，煮后用約40℃的去離子水反復(fù)洗滌后于烘箱(50℃)中烘干備用.

1.2.3絲心蛋白的預(yù)處理

將脫膠后的蠶絲用9.5 mol/L的LiBr溶液在60℃下溶解，將少許不溶物過濾除去，剩余溶液放入透析袋中用去離子水透析4 d以除去其中的LiBr，將透析好的絲心蛋白溶液放入4000 r/min的離心機(jī)中離心10 min，取上清液放入4℃冰箱備用.

1.2.4絲心蛋白微球的制備

取一定體積的上述絲心蛋白溶液并稀釋到100 mL，取40 mL該溶液于100 mL的三頸燒瓶中，通過滴液漏斗向絲心蛋白溶液中緩慢滴加乙醇溶液，低速攪拌30 min，隨后再將溶液放入低溫下冷凍24 h，拿出后常溫下融化，制得絲心蛋白微球.表1歸納了制備絲心蛋白微球的各種條件參數(shù).

表1　制備絲心蛋白微球的實(shí)驗(yàn)參數(shù)

1.2.5微球形貌和粒徑的分析表征

微球的形貌和粒徑是其兩個(gè)重要的參數(shù)，實(shí)驗(yàn)中采用透射電子顯微鏡(TEM)觀察微球的結(jié)構(gòu)和粒徑.

2結(jié)果與討論

2.1冷凍溫度對絲心蛋白成球的影響

a) t=-10℃; b) t=-15℃; c) t=-20℃圖1　不同的冷凍溫度下的微球的TEM圖Fig.1　TEM images of the microspheres under different freezing temperatures

冷凍溫度對絲心蛋白的成球效果有影響，絲心蛋白首先在乙醇的作用下，構(gòu)象由無規(guī)則卷曲轉(zhuǎn)換成β-折疊結(jié)構(gòu)，在這個(gè)過程中絲心蛋白分子鏈彼此纏繞，形成一個(gè)物理交聯(lián)的凝膠，低溫冷凍能導(dǎo)致絲心蛋白分子鏈的運(yùn)動(dòng)受限，在有限的空間內(nèi)凝膠粒子被擠壓成微型球狀體，當(dāng)冷凍溫度較低時(shí)，其成球效果較好.如圖1所示，當(dāng)冷凍溫度在-20℃時(shí)更利于成球，故后續(xù)的冷凍條件均設(shè)置為-20℃. 2.2不同絲心蛋白溶液濃度對絲心蛋白微球成球的影響在制備的過程中絲心蛋白可以在乙醇的作用下形成一種微晶結(jié)構(gòu)，隨著絲心蛋白濃度的增加形成的微晶和游離狀態(tài)的絲心蛋白纖維的作用大大增加，微晶與自由絲素分子反應(yīng)機(jī)會(huì)以及微球間的反應(yīng)都增加，在有限的空間中，絲心蛋白的濃度較大時(shí)其成球的效果較好.圖2 是不同的絲心蛋白濃度下形成的微球的TEM圖片，從圖可見，得到的結(jié)果與分析相符.

2.3攪拌速度對絲心蛋白微球成球的影響

a) w(SF)=1.0%; b) w(SF)=3.0%; c) w(SF)=5.0%; d) w(SF)=7.0%圖2　不同的絲心蛋白濃度下形成的微球的TEM圖Fig.2　TEM images of the microspheres with different concentration of fibroin

a) n=100 r/min; b) n=200 r/min;c) n=300 r/min圖3　不同攪拌速度時(shí)微球的TEM圖Fig.3　TEM images of the microspheres with different stirring speed

圖3 為不同攪拌速度時(shí)微球的TEM圖片.當(dāng)攪拌速度增加時(shí)，制備出的微球效果較差.隨著攪拌速度的增大，剪切力增大，而在巨大的剪切力長時(shí)間作用下微球的粒徑減小，但微球表面容易破裂，導(dǎo)致成球效果差，同時(shí)絲心蛋白是蛋白質(zhì)類，在高速攪拌的過程中會(huì)形成大量泡沫并不易散去，使一些顆粒吸附在泡沫中，影響成球性.為了獲得更均一、成球性較好的微球，在整個(gè)過程中均以n=100 r/min的速度進(jìn)行攪拌.

2.4不同乙醇和SF的體積比對絲心蛋白微球成球的影響

a) V(EtOH)/V(SF) = 1∶20; b) V(EtOH)/V(SF) = 3∶20; c) V(EtOH)/V(SF) = 4∶20圖4　不同乙醇的加入量下形成微球的TEM圖Fig.4　TEM images of the microspheres with different amount of ethanol

雖然絲心蛋白從無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)到在乙醇作用下變成β-片微晶是一個(gè)自發(fā)過程，但這個(gè)過程的轉(zhuǎn)變率依賴于加入乙醇的體積，同時(shí)大劑量的乙醇能迅速導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，經(jīng)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)乙醇與SF溶液的體積比會(huì)影響絲心蛋白微球成球的效果.不同體積比的成球效果見圖4，由圖4可見隨著乙醇量的增加其成球效果變差，當(dāng)V(EtOH) /V(SF) = 1︰20時(shí)較容易成球.

2.5影響絲心蛋白微球成球的因素

綜上影響因素，當(dāng)V(EtOH) /V(SF) = 1∶20，CSF=7.0%(w/w)，攪拌的速度為n=100 r/min，并t=-20℃的冷凍溫度冷凍的條件下能制備出形態(tài)和大小較理想的微球.由圖5a可見，合成出來的納米粒為均勻的圓球形，由圖5b可見，用動(dòng)靜態(tài)散射激光儀進(jìn)行粒徑大小的表征，粒徑為198 nm的納米粒所占比例最大，達(dá)到了本實(shí)驗(yàn)所預(yù)期的采用較簡捷的設(shè)備和常用藥品來制備圓球狀、粒徑約200 nm的絲心蛋白微球的效果.

V(EtOH)/V(SF) = 1∶20；w(SF)=7.0%; n=100 r/min；t =-20℃圖5　絲心蛋白微球的TME圖及其粒徑分布Fig.5　TEM image(a) and particle size distribution(b) of SF microspheres

3結(jié)語

本文采用自組裝法以脫膠蠶絲作為原料制備了絲心蛋白微球，對影響絲心蛋白微球的成球效果的條件如乙醇用量、絲心蛋白濃度、冷凍溫度和攪拌速度進(jìn)行了初步探索.結(jié)果表明：當(dāng)V(EtOH)/V(SF) = 1∶20，w(SF)=7.0%，攪拌速度為n=100 r/min，并以t=-20℃的冷凍溫度冷凍24 h,最后在室溫融化的條件下，能較成功地制備出絲心蛋白微球，其中采用了常見的試劑乙醇和最簡易的裝置，簡便安全地制備出了絲心蛋白微球.

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中圖分類號TQ028.8; R944.5

文獻(xiàn)標(biāo)識碼A

文章編號1672-4321(2016)01-0050-05

基金項(xiàng)目國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(21276287,20976202)；中央高?；鹂蒲袠I(yè)務(wù)費(fèi)專項(xiàng)資金資助項(xiàng)目(CZW15017)；中南民族大學(xué)學(xué)術(shù)團(tuán)隊(duì)資助項(xiàng)目(XTZ15013)

作者簡介肖新才(1971-)，男，教授，博士，研究方向：生物醫(yī)用材料，E-mail：xcxiao71@yahoo.com.cn

收稿日期2015-09-14