陳思禮 ，陳　潔 ，吳匯蘭

( 中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，430074，武漢 )

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魚腥藻PCC7120染色體MazEF同源基因?qū)sr0757/alr0758的初步研究

陳思禮 ，陳潔 ，吳匯蘭

( 中南民族大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，430074，武漢 )

摘要魚腥藻PCC7120染色體上的基因?qū)sr0757/alr0758，經(jīng)NCBI比對顯示其與大腸桿菌中的毒素-抗毒素基因MazEF具有較高的同源性，且具有毒素-抗毒素系統(tǒng)基因的保守遺傳結(jié)構(gòu)，為研究其是否屬于MazEF家族系統(tǒng)基因，構(gòu)建同時含有asr0757和alr0758基因的雙啟動子選擇性表達(dá)載體，先選擇性誘導(dǎo)了該基因?qū)Φ谋磉_(dá)，再驗(yàn)證了其表達(dá)產(chǎn)物對細(xì)菌生長的影響. 結(jié)果顯示：成功誘導(dǎo)表達(dá)出了目的蛋白asr0757(13.5KD)和alr0758(17.5KD)，當(dāng)單獨(dú)誘導(dǎo)asr0757基因表達(dá)時，細(xì)菌生長狀況不受影響，單獨(dú)誘導(dǎo)alr0758表達(dá)時細(xì)菌生長明顯受到抑制，同時誘導(dǎo)asr0757和alr0758基因時細(xì)菌生長恢復(fù)正常，說明asr0757/alr0758構(gòu)成具有生物功能的MazEF家族系統(tǒng)基因?qū)?，具有毒性與抗毒性功能.

關(guān)鍵詞魚腥藻PCC7120; 毒素-抗毒素系統(tǒng); MazEF; asr0757/alr0758

A Preliminary Research of MazEF Homologous Gene Pair asr0757/ alr0758 on the Chromosome of Anabaena sp.PCC7120

ChenSili,ChenJie,WuHuilan

(College of Life Science, South-Central University for Nationalities, Wuhan 430074, China)

AbstractAnabaenasp. PCC7120 chromosomal genesasr0757/alr0758 were predicted to have high homology with the toxin-antitoxin genesMazEFinE.coliby comparing them on NCBI, and they both had the same conservative structure. To study whether they belonged to the MazEF family, selective expression vectors were built with double promoters, which contained bothasr0757 andalr0758 genes. Then geneasr0757 andalr0758 were induced separately to verify the influence of the selective expression product on the growth of bacteria. The results showed that the target proteins asr0757(13.5KD) and alr0758(17.5KD) were successfully induced. The growth of bacteria was not affected whenasr0757 gene was induced, whereas the growth was significantly suppressed whenalr0758 gene was induced. The growth of bacteria reversed to normal, however, whileasr0757 andalr0758 genes were induced at the same time. This result showed thatasr0757 andalr0758 together constituted a gene pair of MazEF family which bequeathed the toxicity and anti-toxicity functions.

KeywordsAnabaenasp. PCC7120; toxin-antitoxin system; MazEF;asr0757/alr0758

藍(lán)藻是一種光能自養(yǎng)型原核生物，兼具植物與細(xì)菌特征，其所屬中的水華魚腥藻PCC7120作為一種已于2001年由日本Kazusa研究所完成測序工作的模式生物[1]，主要存在于淡水湖泊或海水中，大量繁殖時會形成水華，破壞水體生態(tài)平衡，導(dǎo)致魚類死亡[2]，并產(chǎn)生大量毒素，毒性物質(zhì)通過食物鏈或者被污染的水源進(jìn)入動物和人體體內(nèi)會引起肝臟損傷[3]，甚至透過血腦屏障在腦部積累破壞人的大腦神經(jīng)[4]，嚴(yán)重時引起多器官衰竭導(dǎo)致死亡[5,6].

水華魚腥藻PCC7120體內(nèi)存在著大量的毒素-抗毒素系統(tǒng)(TAS，toxin-antitoxin system)，TAS由2個基因組成，這2個基因具有數(shù)個重疊基因且位于同一個操縱子下，一個編碼穩(wěn)定的抗毒素蛋白，另一個編碼不穩(wěn)定的毒素蛋白[7]，根據(jù)編碼產(chǎn)物序列的相似性將已驗(yàn)證過的TA系統(tǒng)分為包括MazE/F，RelB/E，CcdA/B等在內(nèi)的8大家族，其中MazE/F是研究比較多的II型 TAS，正常情況下MazE和MazF形成異源六聚復(fù)合物，不危害菌體生存，但當(dāng)遭遇外界脅迫時，MazF從復(fù)合物中游離出來，并作為一種核酸內(nèi)切酶[8]，特異性地切割mRNA 上的ACA序列，抑制翻譯過程使細(xì)菌生長抑制或死亡[9]，抗毒素MazE能從兩個水平對TA 系統(tǒng)進(jìn)行調(diào)控：①通過與毒素蛋白結(jié)合形成復(fù)合體來直接抑制毒素蛋白活性；②與mazEF基因啟動子結(jié)合抑制TA 系統(tǒng)表達(dá)[10]，MazEF系統(tǒng)還可在環(huán)境脅迫條件下(如氧化環(huán)境，氨基酸缺乏，抗生素壓力等)介導(dǎo)細(xì)胞的程序性死亡[11].

自E.coil體內(nèi)第一個毒素-抗毒素系統(tǒng)被鑒定以來，其他細(xì)菌體內(nèi)的許多TAS系統(tǒng)基因也被相繼鑒定，但就已知的TAS來看，不同種屬的同源性和調(diào)控機(jī)制存在不同程度生物差異，魚腥藻PCC7120染色體上的基因?qū)sr0757/alr0758具有數(shù)個堿基的重疊區(qū)域且與MazEF具有較高的同源性，但該對基因只是TAS家族預(yù)測基因，無實(shí)驗(yàn)直接證明其確切屬于MazE/F家族并具有毒性與抗毒性功能，故本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建同時含有asr0757和alr0758基因的雙啟動子選擇性表達(dá)載體，通過對其進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)并研究表達(dá)產(chǎn)物對細(xì)菌的生長的影響，證明了魚腥藻PCC7120染色體上的基因?qū)sr0757/alr0758具有毒性抗毒性功能，構(gòu)成MazE/F家族的一個毒素-抗毒系統(tǒng).

1材料與方法

1.1材料與試劑

Anabaenasp. PCC7120購自中國科學(xué)院水生物研究所，E.coilDH5α 以及E.coilBL21(DE3)為本室保存菌種，限制性內(nèi)切酶、T4 DNA 連接酶、克隆載體pMD18-T(Takara 公司)，表達(dá)載體pET30a(+)，pBAD/HisA 為本室保存，瓊脂糖凝膠 DNA 回收試劑盒和質(zhì)粒 DNA 提取試劑盒(Axygene 公司)，PCR引物合成和克隆載體與表達(dá)載體測序(南京金斯瑞生物科技有限公司).

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1魚腥藻PCC7120全基因組 DNA 提取

魚腥藻PCC7120全基因組的提取方法參照文獻(xiàn)[12].

1.2.2重組克隆載體pMD-8T-PBAD，pMD-18T-asr0757 和 pMD-18T-alr0758的構(gòu)建

基因的克隆嚴(yán)格參照分子生物學(xué)操作標(biāo)準(zhǔn)方法[13]，引物設(shè)計按照表1進(jìn)行. 依次添加酶切位點(diǎn)，配成20 μM/L 的溶液，分裝于-20℃保存.以魚腥藻PCC7120全基因組DNA為模板，運(yùn)用Touch-Down PCR擴(kuò)增目的基因?qū)sr0757與alr0758，反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃變性4 min; 94 ℃ 1 min, 60 ℃ (0.5 ℃↓) 40 s, 72 ℃ 40 s，15個循環(huán); 94℃ 1min, 55 ℃ 40 s, 72 ℃ 40 s, 20個循環(huán); 72 ℃ 7 min. 基因araC和PBAD的擴(kuò)增以質(zhì)粒 PBAD/HisA 為模板，PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃變性4 min; 94 ℃ 1 min, 56 ℃ (0.5 ℃↓)30 s, 72 ℃ 90 s, 15個循環(huán); 94 ℃ 1 min, 50 ℃ 30 s, 72 ℃ 90 s, 20個循環(huán); 72 ℃ 7 min.PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測后純化后直接與克隆載體pMD18-T連接16 ℃過夜，轉(zhuǎn)入活化的E.coilDH5α中，經(jīng)藍(lán)白斑篩選挑取陽性克隆，經(jīng)菌落PCR檢測與質(zhì)粒雙酶切檢測后的陽性菌送往測序[14]. 測序正確的克隆制作成甘油菌保存，命名為pMD-18T-PBAD，pMD-18T-asr0757 和 pMD-18T-alr0758，并提取質(zhì)粒同時保存于-20℃.

表1　PCR 引物的序列

1.2.3重組選擇性表達(dá)載體的構(gòu)建

將測序正確的克隆菌質(zhì)粒按照表2中的酶進(jìn)行雙酶切，回收酶切的目的片段保存于-20℃，表達(dá)載體的構(gòu)建方法與命名按圖1進(jìn)行，重組表達(dá)載體pMJ0700含有araC+PBAD片段，重組表達(dá)載體pMJ0757含有抗毒素基因asr0757，重組表達(dá)載體pMJ0758載體同時含有抗毒素基因asr0757，毒素基因alr0758.構(gòu)建完的表達(dá)載體菌經(jīng)過雙酶切檢測，菌落PCR檢測送往測序，測序正確的菌制作成甘油菌保存于-20℃?zhèn)溆?

表2　陽性克隆質(zhì)粒雙酶切

圖1　雙啟動子表達(dá)載體構(gòu)建流程圖Fig.1　Flowchart of the construction of the expressionvector with double promoters

1.2.4目的基因asr0757和alr0758的誘導(dǎo)表達(dá)

重組選擇性表達(dá)菌質(zhì)粒中：抗毒素基因asr0757位于PT7控制下，由 IPTG 誘導(dǎo)表達(dá) ，毒素基因alr0758位于PBAD控制之下，受 L-(+)-阿拉伯糖誘導(dǎo)表達(dá).將重組表達(dá)菌pMJ0758-0757-BL21接種于含有Kana抗性的LB液體培養(yǎng)基中，在37℃，220 r/min搖床過夜[15]，轉(zhuǎn)入新的LB液體培養(yǎng)基(含有Kana，0.2%葡萄糖抑制本底表達(dá))活化3 h，使OD600=0.4～0.6 后：①加入0.8 mmol/L 的 IPTG誘導(dǎo)PT7啟動，抗毒素基因asr0757表達(dá)；②加入0.2 % L型阿拉伯糖誘導(dǎo)PBAD啟動，毒素基因alr0758表達(dá)，誘導(dǎo)10 h收集菌體SDS- PAGE 電泳檢測重組蛋白的表達(dá)，同時設(shè)置對照組即含PET-30a空載的BL21誘導(dǎo)，pMJ0758-0757-BL21不誘導(dǎo).

1.2.5毒素基因alr0758對菌體細(xì)胞的毒性作用和抗毒性基因asr0757對毒素基因毒性的抑制作用

將重組菌pMJ0700，pMJ0758，pMJ0758-0757每種菌分別接種于3種含不同誘導(dǎo)物的M9基本培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)，3種含不同添加物的培養(yǎng)基為： ① M9基本培養(yǎng)基+卡那霉素，② M9基本培養(yǎng)基+卡那霉素+0.2%L-阿拉伯糖，③ M9基本培養(yǎng)基+卡那霉素+0.2%L-阿拉伯糖+0.1mM/L IPTG，于37℃培養(yǎng)18 h后觀察結(jié)果.

2結(jié)果與分析

2.1目的基因PCR擴(kuò)增

運(yùn)用Touch-down PCR擴(kuò)增的目基因片段：asr0757,alr0758,araC+PBAD，PCR產(chǎn)物經(jīng)0.1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測顯示出現(xiàn)的條帶大小與預(yù)測大小一致(見圖2)，asr0757大小為210 bp(泳道3)，alr0758為342 bp(泳道2)，araC+PBAD為1300 bp(泳道1).

M) DL2000 標(biāo)準(zhǔn) Marker; 1) araC+PBAD PCR 產(chǎn)物; 2) alr0758 PCR 產(chǎn)物; 3) asr0757 PCR 產(chǎn)物圖2　PCR產(chǎn)物電泳檢測Fig.2　Examination of PCR products by agarose electrophoresis

2.2重組克隆載體 pMD-18T-PBAD，pMD-18T-asr0757 和 pMD-18T-alr0758的構(gòu)建

各克隆載體經(jīng)過雙酶切檢測(見圖3)和菌落PCR檢測(見圖4)，均在預(yù)測大小處出現(xiàn)了目的條帶，菌落PCR電泳檢測時在100 bp處出現(xiàn)的條帶為引物二聚體.雙酶切檢測電泳圖顯示每個泳道均出現(xiàn)了2個條帶，小的條帶為酶切下來的目的條帶，大的條帶為切下來的空載PMD-18T空載(大小約2700 bp)，菌落PCR檢測均在預(yù)測位置出現(xiàn)了目的條帶，送往測序，測序結(jié)果經(jīng)NCBI的Blast比對顯示堿基完全匹配，克隆載體構(gòu)建成功.

M) DL2000 標(biāo)準(zhǔn) Marker; 1) pMD-18T-PBAD雙酶切產(chǎn)物; 2) pMD-18T-asr0757雙酶切產(chǎn)物; 3) pMD-18T-alr0758雙酶切產(chǎn)物圖3　重組克隆載體pMD-18T-PBAD，pMD-18T-asr0757 和 pMD-18T-alr0758雙酶切檢測　　　Fig.3　Examination of cloning vectors pMD18-T-asr0757andpMD18-T-alr0758 with the double enzyme digestion

M) DL2000 標(biāo)準(zhǔn) Marker; 1) 重組克隆菌pMD-18T-alr0758菌落PCR產(chǎn)物; 2) 重組克隆菌pMD-18T-asr0757菌落PCR產(chǎn)物;3) 重組克隆菌pMD-18T-PBAD菌落PCR產(chǎn)物圖4　重組克隆菌pMD-18T-PBAD，pMD-18T-asr0757 和 pMD-18T-alr0758 菌落PCR檢測Fig.4　Colony PCR detection of the recombinant bacteria pET-30a-asr0757 and pET-30a-alr0758

2.3重組選擇性表達(dá)載體的構(gòu)建

將測序正確的克隆載按照表2所列的酶雙酶切，純化回收酶切的目的片段，按照圖1所示的方法構(gòu)建選擇性表達(dá)載體pMJ0700, pMJ0758, pMJ0758-0757后對重組選擇性表達(dá)菌進(jìn)行雙酶切檢測(見圖5)，pMJ0700含有araC+PBAD片段，用XhoI/EcoR1雙酶切檢測，泳道3為其雙酶切后的產(chǎn)物電泳結(jié)果，在1300 bp處出現(xiàn)與目標(biāo)片段大小相符的條帶；泳道2為pMJ0758雙酶切產(chǎn)物，pMJ0758含有araC+PBAD和asr0758片段，用EcoR1/BamH1雙酶切檢測，在342 bp處出現(xiàn)與alr0758片段大小相符的目標(biāo)條帶；泳道1為pMJ0758-0757雙酶切產(chǎn)物，含有araC+PBAD,asr0757,alr0758片段，用NdeI/BamH1雙酶切檢測，在210 bp處出現(xiàn)目標(biāo)條帶，選擇性表達(dá)載體pMJ0758-0757分別用3組引物進(jìn)行菌落PCR檢測，結(jié)果顯示均在目標(biāo)處出現(xiàn)條帶(未附圖)，經(jīng)測序后結(jié)果顯示3段目標(biāo)片段均完整地整合入質(zhì)粒中，選擇性表達(dá)載體構(gòu)建成功.

M) DL5000 標(biāo)準(zhǔn) Marker; 1) 選擇性表達(dá)載體pMJ0758-0757用Nde I /BamH1雙酶切產(chǎn)物; 2) 選擇性表達(dá)載體pMJ0758用EcoR1/BamH1雙酶切產(chǎn)物; 3) 擇性表達(dá)載體pMJ0700用Xho I/EcoR1雙酶切產(chǎn)物圖5　重組選擇性表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切電泳檢測Fig.5　Electrophoresis detection of selective expression vectorswith double enzyme digestion

2.4目的基因asr0757和alr0758的誘導(dǎo)表達(dá)

選擇性表達(dá)菌pMJ0758-0757-BL21按照1.2.4中的①②兩種誘導(dǎo)方式誘導(dǎo)目的基因表達(dá)后，SDS-PAGE電泳檢測結(jié)果如圖6所示，泳道1與4為實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)組，分別誘導(dǎo)目的基因alr0758和asr0757的表達(dá)，圖中橢圓標(biāo)注的地方即為目的基因誘導(dǎo)產(chǎn)物，大小與基因表達(dá)產(chǎn)物預(yù)測大小一致，蛋白asr0757為13.5 KD，alr0758為17.5 KD，泳道2與3為實(shí)驗(yàn)對照組，在目的基因大小處未出現(xiàn)條帶，泳道1中誘導(dǎo)產(chǎn)物是毒素蛋白，由于其本身對菌體有毒害作用，故表達(dá)量較低，泳道4中的抗毒素蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)量較高，蛋白誘導(dǎo)表達(dá)成功.

M) 蛋白預(yù)染Marker ；1)選擇性表達(dá)菌pMJ0758-0757-BL21目的基因alr0758的誘導(dǎo)表達(dá)；2)選擇性表達(dá)菌pMJ0758-0757-BL21菌未誘導(dǎo)；3)含PET-30a空載-BL21菌誘導(dǎo)；4)選擇性表達(dá)菌pMJ0758-0757-BL21目的基因asr0757的誘導(dǎo)表達(dá)圖6　目的基因asr0757和alr0758的誘導(dǎo)表達(dá)SDS-PAGE檢測Fig.6　Examination of expression products induced from genes asr0757/alr0758 by SDS- PAGE

2.5毒素基因alr0758對菌體細(xì)胞的毒性作用和抗毒性基因asr0757對毒素基因毒性的抑制作用

選擇性表達(dá)載體誘導(dǎo)毒素基因表達(dá)對細(xì)胞的毒性作用和抗毒素表達(dá)時對毒性的抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖7所示，當(dāng)M9培養(yǎng)基只作抗性篩選加入Kana并用H2O替代誘導(dǎo)劑時，3種含有重組質(zhì)粒大的大腸桿菌均能正常生長；當(dāng)向M9培養(yǎng)基中加入0.2%L-阿拉伯糖作為誘導(dǎo)劑時，PBAD啟動子啟動，位于阿拉伯糖啟動子PBAD調(diào)控下的基因alr0758表達(dá)，含重組質(zhì)粒pMJ0700的大腸桿菌細(xì)胞能夠正常生長，含有重組質(zhì)粒pMJ0758和pMJ0758-0757的大腸桿菌細(xì)胞生長明顯受到抑制，說明誘導(dǎo)基因alr0758表達(dá)后，其產(chǎn)物具有細(xì)胞毒性，對E.coli細(xì)胞的生長有明顯的抑制作用；當(dāng)向M9培養(yǎng)基中同時添加0.2%L-阿拉伯糖和0.1mM IPTG 誘導(dǎo)劑時，PBAD啟動子和T7啟動子啟動，基因asr0757，alr0758均可表達(dá)，含有重組質(zhì)粒pMJ0758的大腸桿菌細(xì)胞生長明顯受到抑制，而含重組質(zhì)粒pMJ0700和pMJ0758-0757大腸桿菌細(xì)胞能夠正常生長，說明基因alr0758表達(dá)產(chǎn)物對細(xì)胞具有毒性作用，而基因asr0757表達(dá)產(chǎn)物能抑制這種毒性作用，上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：基因alr0758是毒性基因，基因asr0757是抗毒性基因，兩者共同構(gòu)成魚腥藻PCC7120染色體上的一個毒素-抗毒素系統(tǒng).

圖7　基因asr0757/alr0758在不同誘導(dǎo)物誘導(dǎo)下誘導(dǎo)產(chǎn)物對大腸桿菌細(xì)胞生長影響Fig.7　Effects of the products induced under different inducers of genes asr0757/alr0758 on the growth of E.coli cells

3討論

藍(lán)藻是存在于多種環(huán)境中的原核生物，能適應(yīng)多變的環(huán)境，魚腥藻是其所屬的引起水華的最主要的藻種之一，作為一種水華優(yōu)勢種，其抗對環(huán)境壓迫的能力與其體內(nèi)染色體和質(zhì)粒上存在的大量的毒素-抗毒素系統(tǒng)密切相關(guān)，而魚腥藻PCC7120的染色體上的TA系統(tǒng)大多數(shù)是基于同源序列比對預(yù)測的無直接的實(shí)驗(yàn)依據(jù). 因此，通過對Anabaenasp.PCC7120染色體上的毒素-抗毒素系統(tǒng)基因的研究，了解其調(diào)控機(jī)制，通過人工干涉，有利于減少水華魚腥藻的危害.

隨著TAS研究的日益增多，許多不同種屬細(xì)菌中的TAS基因也被相繼鑒定，但尚缺乏TAS在各種屬細(xì)胞中作用機(jī)制及其生理功能等的深入研究. 本文運(yùn)用分子生物學(xué)手段對藍(lán)藻Anabaenasp. PCC7120染色體上的預(yù)測的II型MazEF同源基因?qū)sr0757/alr0758進(jìn)行了初步研究，構(gòu)建雙啟動子表達(dá)載體：即含T7和PBAD，基因asr0757位于T7啟動子下，alr0758位于PBAD的啟動子下，兩基因分別誘導(dǎo)和同時誘導(dǎo)，觀察不同誘導(dǎo)條件下表達(dá)產(chǎn)物對E.coilBL21的影響.本研究首次針對魚腥藻PCC7120染色

體上asr0757/alr0758，通過構(gòu)建選擇性表達(dá)載體，在大腸桿菌中鑒定了這兩對基因的毒性和抗毒性功能，在毒素基因誘導(dǎo)表達(dá)時宿主菌的生長明顯較對照組慢，且基因alr0758誘導(dǎo)表達(dá)量較少，在一定程度上說明了基因alr0758表達(dá)產(chǎn)物的毒性作用，對魚腥藻PCC7120 染色體上TAS基因的研究鑒定是對TAS的補(bǔ)充，同時有利于其分子機(jī)制的研究.

盡管基因alr0758的誘導(dǎo)產(chǎn)物對E.coliBL21具細(xì)胞毒性，能顯著抑制細(xì)胞生長，但alr0758未導(dǎo)入其來源菌株魚腥藻PCC7120中，故其在魚腥藻中的作用機(jī)制和生理功能均未知，尚需要更深入的研究. 本研究結(jié)果補(bǔ)充了TAS中MazEF大家族，為進(jìn)一步了解II型毒素-抗毒素應(yīng)答各種環(huán)境脅迫并調(diào)節(jié)魚腥藻PCC7120的生長奠定了基礎(chǔ)，使進(jìn)一步闡明藍(lán)藻應(yīng)對環(huán)境脅迫成為可能.

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中圖分類號Q78

文獻(xiàn)標(biāo)識碼A

文章編號1672-4321(2016)01-0029-05

基金項(xiàng)目國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(31001099/C190101); 中央高校自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(CJSl3003, CJS13004); 中南民族大學(xué)微生物與生物轉(zhuǎn)化重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室資助項(xiàng)目(XJS09002)

作者簡介陳思禮( 1955-) , 男, 教授, 博士, 研究方向: 分子病原生物學(xué), E-mail: sili.chen@163.com

收稿日期2015-09-03