劉曉梁

山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院科技中心　山西呂梁　032200

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誘騙受體3的二級結(jié)構(gòu)及B細(xì)胞表位預(yù)測

劉曉梁

山西醫(yī)科大學(xué)汾陽學(xué)院科技中心山西呂梁032200

[摘要]①目的預(yù)測誘騙受體3(Dcr3)蛋白的二級結(jié)構(gòu)及B細(xì)胞表位。②方法通過NCBI蛋白數(shù)據(jù)庫檢索到Dcr3蛋白的氨基酸序列，以此為基礎(chǔ)，通過SOPMA在線服務(wù)器預(yù)測其二級結(jié)構(gòu)，利用Lasergene軟件預(yù)測其親水性、表面可及性、柔韌性區(qū)域及抗原性指數(shù)，綜合分析，預(yù)測其可能的B細(xì)胞表位。③結(jié)果Dcr3的二級結(jié)構(gòu)由無規(guī)則卷曲(43.00%)、β折疊(10.33%)、 α螺旋(36.33%)和β轉(zhuǎn)角(10.33%)構(gòu)成，其可能的B細(xì)胞表位位于56-67(TFVQRPCRRDSP), 93-101(VLCGEREEE),56-167(GTFSASSSSSEQ), 255-261(LKLRRRL), 286-293(PGLERSVR)。④結(jié)論此結(jié)果為制備Dcr3表位特異性抗體肽段選擇提供了依據(jù)。

[關(guān)鍵詞]Dcr3二級結(jié)構(gòu)B細(xì)胞表位

誘騙受體3(Dcr3)是近年發(fā)現(xiàn)的腫瘤壞死因子受體超家族(TNFRSF)成員[1]，其基因位于人20號染色體20q13.3[2]，可編碼300個氨基酸的蛋白質(zhì),其中包含29個信號肽序列，經(jīng)加工處理后，分泌到細(xì)胞外發(fā)揮作用。成熟Dcr3相對分子量約為33kd[3]，結(jié)構(gòu)上與其他TNFRSF成員類似，含有4個半胱氨酸富集區(qū)形成的結(jié)構(gòu)域[4]。在該家族中，Dcr3是唯一能夠同時結(jié)合腫瘤壞死因子配體FasL、LIGHT和TL1A，并中和其效應(yīng)的成員。此外，Dcr3還能夠通過其C端的粘多糖結(jié)合結(jié)構(gòu)域與多種類型細(xì)胞表面的硫酸乙酰肝素蛋白多糖(HSPG)結(jié)合，從而在免疫調(diào)節(jié)，細(xì)胞粘附以及抗原提呈細(xì)胞的分化等方面發(fā)揮作用[5,6]。生理狀態(tài)下，在健康人的組織中可以檢測到Dcr3低水平的mRNA[7]，常規(guī)的檢測手段并不能檢出Dcr3蛋白的表達(dá)，但在某些自身免疫性疾病、腫瘤性疾病中其表達(dá)水平增高[4]。

Dcr3與腫瘤的研究表明，在消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)、泌尿生殖系統(tǒng)、血液淋巴系統(tǒng)等多種類型腫瘤中，Dcr3高表達(dá)[6,8～12]。除了腫瘤細(xì)胞，免疫細(xì)胞以及間質(zhì)細(xì)胞等都可以作為Dcr3的來源。Dcr3與腫瘤的發(fā)生發(fā)展及預(yù)后判斷密切相關(guān)。在神經(jīng)膠質(zhì)瘤、胰腺癌、肝細(xì)胞肝癌中，Dcr3可以抑制FasL介導(dǎo)的凋亡；Dcr3還可通過阻斷血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的TL1A而促進(jìn)腫瘤血管的形成；可以介導(dǎo)單核巨噬細(xì)胞向腫瘤灶的遷移浸潤，并誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞向腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(TAMs)分化，進(jìn)而逃避免疫監(jiān)視，發(fā)揮促進(jìn)腫瘤生長的作用。此外，腫瘤組織或血漿中Dcr3濃度升高往往與腫瘤分期較高、容易發(fā)生淋巴結(jié)浸潤以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)，從而被視為腫瘤預(yù)后的不良指標(biāo)。

在Crohn病、潰瘍性結(jié)腸炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等自身免疫性疾病中，Dcr3表達(dá)升高[10,13,14]。TL1A、LIGHT、 FasL等在膠原誘導(dǎo)的風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎發(fā)病中具有重要作用。Dcr3 可以通過其“誘騙”作用，減緩關(guān)節(jié)炎的發(fā)病，改善病情；Dcr3可以介導(dǎo)Th2細(xì)胞的免疫漂移，從而使得NOD小鼠對1型糖尿病具有一定的抵抗性[15]。另外一方面，Dcr3通過競爭性結(jié)合FasL可使增強(qiáng)免疫系統(tǒng)的活化程度，而加劇某些自身免疫病的發(fā)展[4]。

鑒于Dcr3蛋白在腫瘤、自身免疫性疾病中的病理生理意義，制備其單克隆抗體不僅可為疾病的病情判斷提供有效工具，而且有望為疾病的生物治療提供新的思路。在本研究中，我們利用計算機(jī)輔助技術(shù)，預(yù)測Dcr3蛋白的B細(xì)胞表位，期望為研制其表位特異性抗體肽段的選擇提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1人Dcr3的一級結(jié)構(gòu)根據(jù)NCBI提供的蛋白數(shù)據(jù)庫(NP_003814.1)獲得人Dcr3的氨基酸序列。序列如圖1。

圖1　人Dcr3的氨基酸序列

1.2人Dcr3二級結(jié)構(gòu)的預(yù)測采用較為流行的SOPMA法(Improvedself-optimized prediction method,https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.htm)對 Dcr3的二級結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測[16]。

1.3人Dcr3親水性、可及性、柔韌性區(qū)域的預(yù)測通常預(yù)測蛋白質(zhì)的親水性、可及性、柔韌性具有多種不同的方案可供選擇，各種方案各有優(yōu)劣。本研究中，我們分別采用Hopp&Woods親水性方案、Emini方案、Karplus-Schulz方案對Dcr3的親水性、可及性和柔韌性進(jìn)行預(yù)測[17]。

1.4人Dcr3抗原位點的預(yù)測及B細(xì)胞優(yōu)勢抗原表位采用Jameson-wolt方案對Dcr3抗原性位點進(jìn)行預(yù)測。綜合各種分析方法的結(jié)果，親水性強(qiáng)，表面可及性，柔韌性高，抗原指數(shù)高的肽段有可能是B細(xì)胞優(yōu)勢抗原表位[17]。

2結(jié)果

2.1人Dcr3的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果用SOPMA方法預(yù)測的Dcr3的二級結(jié)構(gòu)見圖2。預(yù)測結(jié)果顯示，Dcr3的二級結(jié)構(gòu)由無規(guī)則卷曲(43.00%)、β折疊(10.33%)、α螺旋(36.33%)和β轉(zhuǎn)角(10.33%)構(gòu)成。β轉(zhuǎn)角和無規(guī)則卷曲主要在第18-26,30-40,41-44,59-77,143-174,186-191,195-208,237-249,266-269,297-300區(qū)段。

圖2　預(yù)測的人Dcr3蛋白結(jié)構(gòu)

2.2Dcr3的親水性、可及性及柔韌性區(qū)域的預(yù)測結(jié)果采用Hopp&Woods的氨基酸親水性標(biāo)準(zhǔn)對Dcr3的親水性進(jìn)行分析，所得結(jié)果如圖3所示。氨基酸親水性較高的區(qū)域包括2-5,33-36,43-52,64-72,90-94,99-108,112-120,166-177,209-219,229-235,241-244,250-254,259-267,285-300。采用Emini方法對Dcr3的表面可及性區(qū)域進(jìn)行預(yù)測，所得結(jié)果如圖4。其可及性較高的區(qū)域包括37-48，65-70，78-85，101-106，112-115，146-153，165-177，189-193，231-236，243-253，260-265，294-299。采用Karplus-Schulz方案對Dcr3的柔韌性進(jìn)行預(yù)測，預(yù)測結(jié)果如圖5所示。其中，1-8，31-35，39-46，53-77，96-102，133-136，141-165，183-189，202-211,238-249,258-263，286-295。

圖3　Dcr3的親水性預(yù)測

圖4　Dcr3的可及性預(yù)測

圖5　Dcr3的柔韌性預(yù)測

2.3Dcr3的抗原位點預(yù)測及B細(xì)胞優(yōu)勢表位分析采用Jameson-Wolf方案對Dcr3抗原性位點進(jìn)行預(yù)測，結(jié)果如圖6。Dcr3可能的抗原位點是2-8， 31-46， 59-77， 86-91， 95-103， 109-116， 131-135， 143-150， 160-173， 184-190， 204-211， 225-230， 238-250， 256-261， 284-295。雖然上述各方案預(yù)測的區(qū)間不同，但存在一些共同的區(qū)間，如56-67(TFVQRPCRRDSP), 93-101(VLCGEREEE), 156-167(GTFSASSSSSEQ), 255-261(LKLRRRL), 286-293(PGLERSVR)，這些肽段有可能是B細(xì)胞優(yōu)勢抗原表位。

圖6　Dcr3抗原性預(yù)測

3討論

腫瘤壞死因子及其受體超家族對哺乳動物免疫系統(tǒng)具有重要的調(diào)節(jié)作用。TNFRSF至少有19個成員，大多數(shù)成員通過與配體特異性結(jié)合而介導(dǎo)增生/凋亡等重要的生理反應(yīng)。Dcr3是TNFRSF中重要成員，它與“配體”的結(jié)合不具有嚴(yán)格的特異性[18]。由于Dcr3是一種可溶性蛋白，不具有信號轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，因而當(dāng)其結(jié)合“配體”后，可以阻斷“配體”的作用，具有廣泛的病理生理學(xué)用。研究表明，Dcr3與腫瘤、自身免疫病等炎性疾病密切相關(guān)[4]。為了明確Dcr3的功能特性，以及通過基因工程的方法人工制備其變異體可能用于相關(guān)疾病的治療，有必要確定其與“配體”結(jié)合的殘基。而表位特異性的抗體是實現(xiàn)此目標(biāo)的重要工具之一。表位是抗原分子中能特異性結(jié)合抗原的特殊化學(xué)基團(tuán)。一個蛋白質(zhì)中的氨基酸殘基能否誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生抗體與它是否在蛋白質(zhì)表面、是否具有與抗體結(jié)合的空間有關(guān)。近年來，計算機(jī)技術(shù)的發(fā)展，使得人們可以預(yù)測蛋白中的B細(xì)胞表位。目前，有多種方案可以預(yù)測蛋白質(zhì)的B細(xì)胞表位，主要有二級結(jié)構(gòu)、親水性、表面可及性、柔韌性、抗原性等[19]。

由于α螺旋和β折疊化學(xué)鍵的鍵能比較高， 對于蛋白質(zhì)高級結(jié)構(gòu)的維持起重要作用， 同時它們與抗體嵌合比較困難， 并且它們經(jīng)常處于蛋白質(zhì)的內(nèi)部， 因而該區(qū)域幾乎不可能成為抗原表位;而β 轉(zhuǎn)角及無規(guī)則卷曲結(jié)構(gòu)等柔韌性比較松散，容易發(fā)生扭曲，大多盤旋并展示在蛋白質(zhì)的表面，易與抗體嵌合，所以它們成為抗原表位的可能性比較大[20]。由SOMPA方法預(yù)測的 Dcr3 的二級結(jié)構(gòu)中，無規(guī)則卷曲與β 轉(zhuǎn)角占大約53%，表明其可能存在多個抗原表位。

根據(jù)Hopp&Woods親水性方案, Emini蛋白質(zhì)的表面可能性方案和Karplus-Schulz柔韌性方案，Jameson-Wolf抗原性指數(shù)方案預(yù)測結(jié)果,進(jìn)行綜合評判，提示在Dcr3蛋白的56-67(TFVQRPCRRDSP) ,93-101(VLCGEREEE), 156-167(GTFSASSSSSEQ) ,255-261(LKLRRRL), 286-293(PGLERSVR)可能存在B細(xì)胞表位，且這些區(qū)域位于無規(guī)則卷角或β 轉(zhuǎn)角區(qū)或其附近。

計算機(jī)輔助技術(shù)大大減少了制備單克隆抗體肽段選擇的盲目性，但其預(yù)測的肽段是否是B細(xì)胞表位，尚有待進(jìn)一步驗證。本研究中，我們根據(jù)NCBI提供的Dcr3蛋白的氨基酸序列，利用生物信息網(wǎng)絡(luò)資源與軟件，對Dcr3的二級結(jié)構(gòu)和B細(xì)胞表位就行了預(yù)測，為人工制備Dcr3表位特異性單克隆抗體肽段的選擇提供了線索。

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(岳靜玲編輯)

讀者·作者·編者

計量資料中有效數(shù)字的確定

Prediction of secondary structure and B-cell epitope of decoy receptor 3

LIUXiaoliang

(ShanxiMedicalUniversityFenyangCollege,ShanxiLvliang032200,China)

[ABSTRACT]ObjectivePrediction the secondary structure and B-cell epitope of Dcr3(decoy receptor 3).MethodsThe amino acid sequence of Dcr3 protein was retrieved by NCBI protein database.Based on this，the secondary structure was predicted by online service SOPMA;We use software of Lasergene for hydrophilicity，flexibility，accessibility index．Combined the results，we predicted the B cell epitopes of Dcr3．ResultsThe second structure of Dcr3 contained random coil(43.00%)，extended strand(10.33%),alpha helix(36.33%)，beta turn(10.33%),and the most possible epitopes of Dcr3 were located in 56-67(TFVQRPCRRDSP),93-101(VLCGEREEE),156-167(GTFSASSSSSEQ),255-261(LKLRRRL),286-293(PGLERSVR).ConclusionThese results provide a theory basis for developing epitope-specific monoclonal antibodies against Dcr3．

[KEYWORDS]Dcr3.Secondary structure.B-cell epitope

[中圖分類號]R 392

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]2095-2694(2016)02-92-04

【作者簡介】劉曉梁(1985-)，男，醫(yī)學(xué)碩士，助教。研究方向:腫瘤免疫。