劉　越，羅定強(qiáng)，康　榮，張國躍，王國海

(1.陜西省食品藥品檢驗所，陜西 西安　710065；2.西安醫(yī)學(xué)院，陜西 西安　710021)

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HPLC法測定口腔潰瘍含片(散)中靛藍(lán)和靛玉紅的含量

劉越1，羅定強(qiáng)1，康榮2，張國躍1，王國海1

(1.陜西省食品藥品檢驗所，陜西 西安710065；2.西安醫(yī)學(xué)院，陜西 西安710021)

摘要:目的 優(yōu)化樣品處理過程，建立口腔潰瘍含片(散)中同時測定靛藍(lán)和靛玉紅含量的方法。方法 以N，N-二甲基甲酰胺為溶劑，進(jìn)行超聲提取；色譜柱：Welch C(18)(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇—0.02%磷酸溶液(65∶35)，流速：1 mL·min(-1)，檢測波長：289 nm，柱溫35℃。結(jié)果 靛藍(lán)在69.12～1 728 ng范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.999 5)，含片和散劑中靛藍(lán)平均回收率分別為102.6%,RSD=1.0% (n=6)和96.6%，RSD=1.3% (n=6)，靛玉紅在19.44～486 ng范圍內(nèi)線性關(guān)系良好(r=0.999 5)，含片和散劑中靛玉紅平均回收率分別為102.3%,RSD=2.3% (n= 6)和101.5%，RSD=2.1% (n=6)。結(jié)論該方法準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好，并且可以同時測定靛藍(lán)和靛玉紅的含量，可用于口腔潰瘍系列制劑中青黛的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞:口腔潰瘍含片(散)；提取溶劑；N，N-二甲基甲酰胺；靛藍(lán)；靛玉紅

口腔潰瘍含片(散)由青黛、枯礬(白礬)、冰片三味中藥組成，具有清熱、消腫、止痛的功效[1]?？谇粷兩?biāo)準(zhǔn)最早收載于《衛(wèi)生部藥品標(biāo)準(zhǔn)》中藥成方制劑第一冊，標(biāo)準(zhǔn)號WS3-B-0017-89，現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)收載于《中國藥典》2015年版一部[2]。口腔潰瘍含片是在口腔潰瘍散的基礎(chǔ)上改劑型而來，經(jīng)國家局網(wǎng)站查詢，口腔潰瘍含片有兩個生產(chǎn)廠家，分別執(zhí)行兩個標(biāo)準(zhǔn)，均源自于國家食品藥品監(jiān)督管理局標(biāo)準(zhǔn)?，F(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)口腔潰瘍散含量測定項下規(guī)定青黛是以靛玉紅為指標(biāo)性成分進(jìn)行測定，而口腔潰瘍含片是以靛藍(lán)的含量進(jìn)行計算，而靛藍(lán)、靛玉紅均為青黛藥材中的主要藥效成分[3-5]，為保證成藥質(zhì)量，應(yīng)該對這兩種成分同時進(jìn)行測定。另外，靛藍(lán)和靛玉紅對溶劑的選擇性要求較高，不同的樣品處理方法導(dǎo)致其測定值差異較大，現(xiàn)行片劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)含量測定項下，樣品制備使用的溶劑為三氯甲烷或丙酮，而這兩種溶劑對靛藍(lán)的溶解性較差，使得對照品的配制及樣品的提取存在一定問題，并且樣品提取方法不合理，標(biāo)準(zhǔn)中規(guī)定將樣品在索氏提取器中提取至無色，缺乏提取時間的量化指標(biāo)。這些因素均影響測定結(jié)果的準(zhǔn)確性。同時，在處方量、制成總量相同的情況下，片劑的含量測定限度也不一致，其靛藍(lán)限度值每片分別為0.22 mg和0.5 mg?；谏鲜鲈颍斜匾獙谇粷兿盗兄苿┑馁|(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行提高完善。

本研究重點選擇優(yōu)化提取溶劑以及樣品制備過程，參考文獻(xiàn)方法[6-12]，采用高效液相色譜法[13-14],同時測定口腔潰瘍含片(散)中靛藍(lán)和靛玉紅的含量，能夠較為全面地控制該系列制劑的質(zhì)量。

1儀器與試藥

1.1儀器島津LC-20AD 高效液相色譜儀，配有二極管陣列檢測器(日本島津公司)；BS224S 電子分析天平、BP211D 電子分析天平(德國塞多利斯公司)；KQ-500DE 型高功率數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2試藥靛藍(lán)和靛玉紅標(biāo)準(zhǔn)品(中國食品藥品檢定研究院，批號分別為110716-201111和110717-200204；純度分別為98.3%和100%，供含量測定用)；口腔潰瘍散和口腔潰瘍含片樣品均來源于市場抽樣，樣品信息見表1；N，N-二甲基甲酰胺，三氯甲烷，丙酮，甲醇，乙酸乙酯，均為分析純；甲醇(色譜純，Merck)；水為超純水。

表1　不同批次樣品信息表

2方法與結(jié)果

2.1色譜條件色譜柱(Welch C18，5 μm，250 mm×4.6 mm)；流速1 mL·min-1；流動相：甲醇—0.02%磷酸溶液(65∶35)；柱溫：35℃；檢測波長：289 nm；分析時間40 min，進(jìn)樣量10 μL。理論板數(shù)按靛藍(lán)峰計算不低于2 000，靛藍(lán)峰與靛玉紅峰的分離度應(yīng)大于2.0。

2.2溶液配制

2.2.1對照品溶液配制 精密稱取靛藍(lán)對照品8.64 mg，置于25 mL量瓶中，加N，N-二甲基甲酰胺使溶解，定容至刻度，搖勻，作為對照品儲備溶液；精密稱取靛玉紅對照品9.72 mg，置于100 mL量瓶中，加N，N-二甲基甲酰胺使溶解，定容至刻度，搖勻，作為對照品儲備溶液；分別從靛藍(lán)、靛玉紅對照品儲備溶液中精密量取10 mL溶液置于50 mL量瓶中，加N，N-二甲基甲酰胺使溶解，定容至刻度，搖勻，作為混合對照品溶液，其濃度分別為：69.12 mg·L-1和19.44 mg·L-1。

2.2.2供試品溶液配制 片劑：取本品10片，研細(xì)，取約0.6 g，精密稱定，置25 mL量瓶中，加N，N-二甲基甲酰胺約20 mL，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)10 min，放冷，加N，N-二甲基甲酰胺至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

散劑：取本品適量，研細(xì)，取約0.3 g，精密稱定，置25 mL量瓶中，加N，N-二甲基甲酰胺約20 mL，超聲處理(功率250 W，頻率40 kHz)10 min，放冷，加N，N-二甲基甲酰胺至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.3專屬性試驗取對照品溶液、供試品溶液、溶液按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣，見圖1。

圖1　專屬性實驗色譜圖

注：A.混合對照品(1.靛藍(lán) 2.靛玉紅)；B.口腔潰瘍散；C.口腔潰瘍含片；D.散劑空白；E.片劑空白。

2.4線性范圍考察分別精密吸取上述制備好的混合對照品溶液各1、2、5、10、20、25 μL，按上述色譜條件進(jìn)行測定，以對照品的進(jìn)樣量(ng)為橫坐標(biāo)，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，靛藍(lán)回歸方程為：Y=2 749X-82 539，r=0.999 5，靛玉紅回歸方程為：Y=1055X-13 327，r=0.999 5，結(jié)果表明，靛藍(lán)在69.12～1 728 ng范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，靛玉紅在19.44～486 ng范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5精密度試驗 取同一供試品溶液，按照上述色譜條件，連續(xù)測定6 次，靛藍(lán)和靛玉紅峰面積的RSD分別為0.9 %和0.2 %。

2.6重復(fù)性試驗 分別取樣品編號1口腔潰瘍散和編號6口腔潰瘍含片，按著上述供試品溶液制備方法各平行制備6 份樣品，按照上述色譜條件進(jìn)行測定，計算得青黛中靛藍(lán)和靛玉紅的平均含量分別為6.213、0.883 mg·g-1，其RSD 分別為2.7% 和1.1 %(散劑)；3.466、0.236 mg·g-1，其RSD 分別為1.3% 和1.3 %(片劑)。結(jié)果表明：重復(fù)性良好。

2.7穩(wěn)定性試驗分別取樣品編號1口腔潰瘍散和編號6口腔潰瘍含片，分別在0，2，4，8，12，18，24 h 進(jìn)樣測定，計算靛藍(lán)和靛玉紅峰面積的RSD 分別為2.4%、1.8%(散劑)和1.5%、2.7%(片劑)。結(jié)果表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8回收率實驗采用加樣回收法，不同劑型分別精密加入不同量的靛藍(lán)和靛玉紅混合對照品溶液，揮干溶劑，再精密稱取已知含量的編號1口腔潰瘍散和編號6口腔潰瘍含片供試品半量，按“2.2”項下方法制備供試品溶液并測定，計算回收率，靛藍(lán)、靛玉紅平均回收率分別為96.6%、101. 5%、RSD 分別為1.3%、2.1%(散劑，見表2、3)和靛藍(lán)、靛玉紅平均回收率分別為102.6%、102. 3%、RSD 分別為1.0%、2.3%(片劑，見表4、5)，表明本法具有良好的加樣回收率。

表2　口腔潰瘍散中靛藍(lán)回收率試驗結(jié)果

表3　口腔潰瘍散中靛玉紅回收率試驗結(jié)果

表4　口腔潰瘍含片中靛藍(lán)加樣回收率試驗結(jié)果

表5　口腔潰瘍含片中靛玉紅回收率試驗結(jié)果

2.9含量測定按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定。對收集的4 個生產(chǎn)廠家10 批次口腔潰瘍散、口腔潰瘍含片中靛藍(lán)和靛玉紅的含量進(jìn)行測定，結(jié)果見表6。

表6　口腔潰瘍散(mg·g-1)、含片(mg/片)中靛藍(lán)和靛玉紅含量測定結(jié)果

注：— 現(xiàn)有標(biāo)準(zhǔn)方法未進(jìn)行測定。

3討論

3.1靛藍(lán)和靛玉紅對照品的溶解選擇性現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中口腔潰瘍含片含量測定項下，對照品溶液的配制分別為：精密稱取靛藍(lán)對照品適量，加丙酮制成每1 mL含2 μg的溶液或者精密稱取靛藍(lán)對照品適量，加三氯甲烷制成每1 mL含2 μg的溶液。存在的問題是作為溶解對照品靛藍(lán)的溶劑，丙酮和三氯甲烷的溶解性都不是很好，但是由于靛藍(lán)的化學(xué)特性，導(dǎo)致其對照品溶液具有深藍(lán)的顏色，對判斷其是否完全溶解造成了很大的干擾；這樣的操作極易造成溶解不完全的現(xiàn)象，并可能導(dǎo)致含量測定值不準(zhǔn)確的情況?？谇粷兩⒑繙y定項下，是使用甲醇溶解靛玉紅，但是甲醇對靛藍(lán)的溶解性較差。我們參考現(xiàn)有文獻(xiàn)方法[6-12]并考察多種有機(jī)試劑，最終確定N，N-二甲基甲酰胺是對靛藍(lán)和靛玉紅對照品具有較好溶解性的試劑。

3.2含量測定結(jié)果分析現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)中口腔潰瘍含片含量測定項下，規(guī)定靛藍(lán)的限定值為每片0.22 mg和0.5 mg，依據(jù)現(xiàn)行版《中國藥典》青黛藥材中靛藍(lán)含量限度及片劑的處方和制法，片劑中靛藍(lán)的理論限度值應(yīng)為每片0.48 mg，從而得知現(xiàn)行的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)可能存在一定程度的不合理性。本實驗方法建立的口腔潰瘍含片(散)中靛藍(lán)和靛玉紅的含量測定方法與現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)方法相比含量測定值有了較大的提高，并且可以同時測定靛藍(lán)和靛玉紅的含量，可用于口腔潰瘍系列制劑中青黛的質(zhì)量控制，也給其它含有青黛藥材的中藥復(fù)方的質(zhì)量控制提供借鑒和參考。

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Simultaneous determination of indigo and indirubin in Kou qiang kuiyang buccal tablets (powder)

LIU Yue1,LUO Ding-qiang1,KANG Rong2,et al

(1.ShaanxiInstituteforFoodandDrugControl,Xi’an710065,China;2.Xi’anMedicalUniversity,Xi’an710021,China)

Abstract:Objective To optimize the sampe pretreatment process and establish a HPLC method for simultaneous determination of indigo and indirubin in Kouqiang kuiyang buccal tablets (powder).Methods Sampes were prepared by ultrasonic extraction with N,N-Dimethylformamide; The Welch C(18) (250 mm×4.6 mm,5 μm) chromatographic column and the mobile phase of methanol-0.02% aqueous phosphoric acid (65∶35) were used for isocratic elution with the flow velocity at 1.0 mL·min(-1 )and the detective wavelength at 289 nm.ResultsThe linear correlation of the indigo was good in the range of 69.12～1728 ng and the recovery were 102.6 % (RSD=1.0%) (n=6) and 96.6 % (RSD=1.3%) (n=6),respectively. The linear correlation of the indirubin was good in the range of 19.44～486 ng and the recovery were 102.3% (RSD=2.3%) (n=6) and 101.5% (RSD=2.1%) (n=6),respectively.ConclusionThe method has advantages of good accuracy as well as reproducibility and can simultaneously determination of indigo and indirubin,which can be used the quality control of Kouqiang kuiyang buccal tablets (powder).

Key words:Kouqiang kuiyang buccal tablets (powder);extraction solvent;N,N-Dimethylformamide;indigo;indirubin

(收稿日期:2015-10-11,修回日期:2015-12-27)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.03.014

通信作者：羅定強(qiáng)，男，副主任藥師，研究方向：中藥質(zhì)量控制，E-mail：luodq@sina.com