郁　陽，梁益敏，麻兵繼，王國凱，劉勁松，李守婷，王　剛

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，現(xiàn)代中藥安徽省重點(diǎn)實驗室，安徽 合肥 　230012；

2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河南 鄭州　450002)

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一種安徽產(chǎn)野生鐵皮石斛內(nèi)生真菌的分離鑒定及其組織分布

郁陽1，梁益敏1，麻兵繼2，王國凱1，劉勁松1，李守婷2，王剛1

(1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，現(xiàn)代中藥安徽省重點(diǎn)實驗室，安徽 合肥 230012；

2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，河南 鄭州450002)

摘要：目的分離鑒定安徽地區(qū)野生鐵皮石斛內(nèi)生真菌，旨在豐富其內(nèi)生真菌資源種類。 方法通過組織塊法對內(nèi)生真菌進(jìn)行分離，運(yùn)用形態(tài)學(xué)和分子生物學(xué)方法進(jìn)行鑒定。結(jié)果從中分離得到11株內(nèi)生真菌，鑒定為5屬11種。 結(jié)論鐵皮石斛內(nèi)生真菌種類資源廣泛分布，為研究其與宿主石斛共生關(guān)系提供理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：鐵皮石斛；內(nèi)生真菌；分離；鑒定

石斛為常用中藥，歷代本草多有收載。商品包括霍山米斛、金釵楓斗、鐵皮楓斗，銅皮楓斗，黃草石斛等[1]。鐵皮石斛(Dendrobiumofficinale)是蘭科(Orchidaceae)石斛屬(Dendrobium)多年生草被植物，具有生津養(yǎng)胃，滋陰清熱，潤肺益腎，明目強(qiáng)身等功效，現(xiàn)代藥理研究表明其具有抗腫瘤，抗氧化，增強(qiáng)人體免疫力和降低血糖等作用，《道藏》中將鐵皮石斛列為“中華九大仙草”之首[2-3]。野生的鐵皮石斛大多分布在東亞、東南亞及澳大利亞等國家和地區(qū)。中國鐵皮石斛主要分布于浙江、廣西、廣東、福建、湖南和貴州等地[4]。鐵皮石斛的種子極小、無胚乳，很難用實生苗栽培，而傳統(tǒng)的分株、扦插等方式的繁殖率極低，加上人為的過度采挖和破壞生態(tài)環(huán)境，其資源已瀕臨滅絕，因而被國家列為重點(diǎn)保護(hù)的藥用植物之一[5]。

在自然條件下鐵皮石斛種子的萌發(fā)依靠真菌誘導(dǎo)，目前有相關(guān)學(xué)者從不同生態(tài)環(huán)境下的鐵皮石斛中分離得到多種內(nèi)生真菌，并對其促生長作用進(jìn)行初步研究。趙昕梅等[6]從河南產(chǎn)野生鐵皮石斛中分離得到4株內(nèi)生真菌，其中一種鐮刀屬菌株對鐵皮石斛的生長促進(jìn)作用明顯，成活率提高30.43%，植株高度增加了31.21%，鮮質(zhì)量增加40.61%。侯曉強(qiáng)等[7]、胡克興等[8]從云南產(chǎn)野生鐵皮石斛中分離得到67株內(nèi)生真菌，并對其中36株進(jìn)行促生長作用篩選，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Pestalotiopsis、Eurotium、Pyrenochaeta、Coprinellus、Pholiota、Alternaria、Helotiales這七屬8株內(nèi)生真菌均能侵染鐵皮石斛根，在鐵皮石斛根的根被、外皮層、皮層中以菌絲或菌絲團(tuán)的形式存在，對鐵皮石斛苗有促生長作用。吳慧鳳等[9]從湖南產(chǎn)野生鐵皮石斛中分離得到37株內(nèi)生真菌，過與組培苗共生篩選，獲得9株促生菌，其中Epulorhiza、Mycosphaerella、Guignardia這三屬3株真菌對鐵皮石斛的鮮質(zhì)量增長率、根數(shù)增長率和芽數(shù)的促生效果最好。

雖然上述學(xué)者對主要產(chǎn)地野生鐵皮石斛內(nèi)生真菌促生長作用進(jìn)行初步研究，但促生真菌的種類都不相同，說明不同生態(tài)環(huán)境下，鐵皮石斛與之共生的內(nèi)生真菌種類有差異，且上述對安徽地區(qū)野生鐵皮石斛的研究還未曾報道。本文報道安徽產(chǎn)鐵皮石斛內(nèi)生真菌對其促生長作用、抗逆性以及有效成分的積累等一系列相關(guān)性研究，并對安徽產(chǎn)野生石斛內(nèi)生真菌進(jìn)行分離鑒定，旨在探索不同生境下鐵皮石斛內(nèi)生真菌種類多樣性，尋找更適合促進(jìn)安徽地區(qū)鐵皮石斛栽培繁殖的內(nèi)生真菌，有利于安徽產(chǎn)鐵皮石斛資源的保護(hù)和人工栽培。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1供試品樣品野生鐵皮石斛健康植株于2015年7月29號采自安徽省池州市石臺縣仙寓鎮(zhèn)奇峰村(東經(jīng)117°25′56.13″，北緯30°03′36.66″，海拔195 m)，經(jīng)安徽中醫(yī)藥大學(xué)方成武教授鑒定為蘭科石斛屬鐵皮石斛(Dendrobiumofficinale)。

1.1.2分離純化培養(yǎng)基馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉18 g、蒸餾水1000 mL)。

1.1.3儀器與試劑JJ-CJ-2FD潔凈工作臺(吳江市凈化設(shè)備總廠)；MIKRO 22R高速冷凍離心機(jī)(德國Hettick公司)；SHP-250型生化培養(yǎng)箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)；LDZX-30KBS立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠)；DYY-8C電泳儀(北京六一儀器廠)；T-Gradient Thermoblock PCR儀(德國Biometra公司)；DHG-9076A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實驗設(shè)備有限公司)；植物/真菌基因組DNA小量提取試劑盒(上海萊楓生物科技有限公司)；通用引物ITS( Internal transcribed spacers )1(5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′)由上海生工生物工程股份有限公司定制。

1.2方法

1.2.1內(nèi)生真菌的分離和純化取健康無病害野生鐵皮石斛完整植株，用自來水沖洗干凈，取其須根和腐葉，吸干表面水分之后，進(jìn)行常規(guī)表面消毒[10]：先用75%乙醇消毒30 s，接著使用有效氯為1%次氯酸鈉消毒1～3 min，再用75%乙醇消毒1～2 min，最后用無菌水沖洗2～3次，吸干表面水分，取最后一次無菌水200 μL涂布于PDA培養(yǎng)基中，平行3份，做為空白對照。倒置于恒溫培養(yǎng)箱中，28℃避光培養(yǎng)3～5 d，要求對照平板無菌落生成，確保表面滅菌徹底。取表面消毒后的植株，用滅菌刀片將植株的根、莖切成0.2 cm的小段；用無菌剪刀將葉剪成0.1 cm×0.1 cm的小塊，接于PDA培養(yǎng)基中，每個平板接3～5塊/段，平行3份，倒置在恒溫培養(yǎng)箱中，28℃避光培養(yǎng)5～15 d。觀察培養(yǎng)皿中材料切口處長出菌絲(菌落)，待菌落出現(xiàn)后，根據(jù)菌落形態(tài)、顏色的差異以及長出時間的不同，分別用無菌牙簽挑取各平板上的菌落邊緣的菌絲接于新的PDA培養(yǎng)基中，按上述培養(yǎng)條件繼續(xù)培養(yǎng)2～3代，確保所得菌為純菌。

1.2.2內(nèi)生真菌形態(tài)學(xué)鑒定參考文獻(xiàn)方法[11]，根據(jù)所分得的真菌菌落培養(yǎng)特征、菌絲形態(tài)，產(chǎn)孢結(jié)構(gòu)類型以及孢子的形態(tài)、顏色、大小進(jìn)行初步鑒定分類。

1.2.3內(nèi)生真菌分子鑒定(1)內(nèi)生真菌DNA提取：將純化好的菌株接種于PDA平板上，28℃避光培養(yǎng)5～7 d。待平板上長滿菌絲后，用滅菌的刮刀刮取菌絲體于滅菌的研缽中。參照真菌基因組DNA小量提取試劑盒步驟進(jìn)行操作得到DNA溶液，置于-20℃冰箱中保存、備用。

(2)rDNA-ITS的PCR擴(kuò)增：擴(kuò)增真菌rDNA-ITS序列引物為：

上游引物ITS1：5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3′；

下游引物ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′。

PCR反應(yīng)體系50 μL，見表1。

表1　PCR擴(kuò)增rDNA-ITS的反應(yīng)體系

PCR擴(kuò)增程序(每份擴(kuò)增產(chǎn)物平行3份)：預(yù)變性95℃，5 min，變性95℃，1 min，復(fù)性49℃，1 min，延伸72℃，2 min，30個循環(huán)，最后延伸72℃，10 min。擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳檢測，1×TAE電泳緩沖液，以100 V電壓電泳約40 min，EB染色5 min，由凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行觀察，拍照。檢測后置于-20℃冰箱中保存、備用。

(3)內(nèi)生真菌rDNA基因的系統(tǒng)發(fā)育分析：將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物交由華大基因科技有限公司進(jìn)行測序，測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中的已知序列進(jìn)行比對分析，采用分子進(jìn)化遺傳分析軟件MEGA ver.5.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。其中系統(tǒng)進(jìn)化矩陣按Kimura 2-Parameter模型估算，采用鄰接法聚類分析構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，重復(fù)取樣1 000次進(jìn)行自展值分析評估系統(tǒng)進(jìn)化樹拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，再結(jié)合序列對比，對菌株進(jìn)行鑒定。

2結(jié)果

2.1內(nèi)生真菌分離通過組織分離法從鐵皮石斛中分離得到11株，從石斛根中分離得到4株，莖中分離得到2株，葉中分離得到5株，具體結(jié)果見表2。

表2　鐵皮石斛內(nèi)生真菌分離株數(shù)

2.2形態(tài)學(xué)鑒定分離得到的內(nèi)生真菌通過菌落特征和顯微觀察，如內(nèi)生真菌的TPSH07，菌株TPSH07表面菌絲灰褐色，茂密，泡狀突起，菌絲團(tuán)薄壁組織，分生孢子子梗單一，不分枝，剛毛黑色，稀少，圍生；顯微下菌絲細(xì)長，呈輻射狀分布。按照魏景超[11]編著的《真菌鑒定手冊》(第一版)初步認(rèn)為菌株TPSH07為刺盤孢屬(Colletotrichum)真菌。形態(tài)和顯微結(jié)構(gòu)見圖1。

TPSH0740×

圖1內(nèi)生真菌TPSH07的顯微結(jié)構(gòu)

2.3分子學(xué)鑒定

2.3.1PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果對分離得到的內(nèi)生真菌提取DNA，得到DNA提取液，進(jìn)行rDNA-ITS序列擴(kuò)增，在550 bp左右處出現(xiàn)一條單一明亮的條帶，部分內(nèi)生真菌DNA擴(kuò)增產(chǎn)物電泳結(jié)果見圖2。

圖2　部分內(nèi)生真菌16SrDNA的

2.3.2rDNA-ITS序列比對以及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建登陸NCBI網(wǎng)站，將測序結(jié)果與GenBank數(shù)據(jù)庫中的已知序列進(jìn)行比對分析，具體結(jié)果見表3。

表3　內(nèi)生真菌分子鑒定序列比對表

對比分離得到的11株內(nèi)生真菌與其同源性相似的11株已知菌種的16SDNA序列，利用MEGA5.0和Clustal X軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果見圖3。

圖3　鄰接法構(gòu)建內(nèi)生真菌ITS序列系統(tǒng)發(fā)育樹

由表3和圖3可知，安徽產(chǎn)野生鐵皮石斛的內(nèi)生真菌分布在5個屬中，其種類資源廣泛。從鐵皮石斛中分離得到的內(nèi)生真菌主要分布在Colletotrichum屬中，占其總數(shù)的54.5%，為其優(yōu)勢種群。此外，在安徽產(chǎn)鐵皮石斛中分離得到的Cosmospora和Deniquelata屬真菌在前人學(xué)者研究的鐵皮石斛中未發(fā)現(xiàn)，拓展了不同生境下鐵皮石斛內(nèi)生真菌的種類資源。

3討論

本文研究安徽產(chǎn)野生鐵皮石斛，從中分離得到11株內(nèi)生真菌，其中從葉和根中分離得到的真菌占總數(shù)的82%，主要分布在Colletotrichum屬中，因此Colletotrichum屬為安徽產(chǎn)野生鐵皮石斛的內(nèi)生真菌的優(yōu)勢種群，且從中分離的Cosmospora和Deniquelata屬真菌未曾在其他地區(qū)野生鐵皮石斛相關(guān)文獻(xiàn)中報道[6-9]，這不僅豐富了不同產(chǎn)地鐵皮石斛內(nèi)生真菌的種類資源，也擴(kuò)展了石斛屬內(nèi)生真菌的種類資源。

自然條件下，內(nèi)生真菌對石斛屬植物，尤其是瀕臨滅絕的藥用石斛來說是不可或缺的物質(zhì)，它是在石斛藥材的人工栽培、資源保護(hù)和再生環(huán)節(jié)中的關(guān)鍵限制性因子[12]。石斛屬植物內(nèi)生真菌與宿主石斛之間共生關(guān)系主要表現(xiàn)在石斛菌根和組培苗形成的過程中，周玉杰等[13]從華石斛中分離得到5株內(nèi)生真菌，將其接種于接種華石斛組培苗和盆苗，結(jié)果表明真菌能夠成功侵入華石斛根內(nèi)形成菌根，不同程度地提高華石斛幼苗成活率，并能提高華石斛幼苗葉綠素含量、凈光合速率和氣孔導(dǎo)度，進(jìn)而提高其光合性能。此外，內(nèi)生真菌還能提高石斛屬中有效成分的含量，尤其是多糖和生物堿含量。陳曉梅等[14]將純化的菌根真菌分別與金釵石斛無菌苗共生培養(yǎng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)MF15、MF18、MF23和MF24分別可使金釵石斛多糖含量提153.4%、52.1%、18.5%、76.7%，MF23使金釵石斛總生物堿含量提高18.3%。因此，本文從安徽產(chǎn)野生鐵皮石斛中分離鑒定內(nèi)生真菌，結(jié)合其他學(xué)者從不同產(chǎn)地和生境鐵皮石斛中分離得到的真菌，是研究石斛屬內(nèi)生真菌多樣性的前提，也為后期研究單菌株以及多菌株協(xié)同作用于宿主石斛提供理論依據(jù)，以提高安徽產(chǎn)鐵皮石斛藥材栽培的生產(chǎn)效率，同時對內(nèi)生真菌的次生代謝產(chǎn)物進(jìn)行檢測和分離，篩選出能產(chǎn)生和宿主石斛相同的或相似的生理活性物質(zhì)的菌株，豐富了安徽產(chǎn)鐵皮石斛藥材的藥用資源，提高了藥用價值，為后期研究內(nèi)生真菌與安徽地區(qū)鐵皮石斛藥材品質(zhì)之間的相關(guān)性提供思路。

鑒于中藥石斛目前是我國珍稀頻危的藥材品種，因此，積極研究其內(nèi)生真菌的生態(tài)狀況，對揭示環(huán)境條件對藥材道地性形成的重要影響及資源的有效利用與開發(fā)，都有著重要意義。

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Isolation and identification of endophytic fungi from Anhui wild Dendrobium officinale and their distribution in different tissues

YU Yang1,LIANG Yi-min1,MA Bing-ji2,et al

(1.SchoolofPharmacy，AnhuiUniversityofChineseMedicine&AnhuiKeyLaboratoryforModernChineseMateriaMedica,Hefei,Anhui230012,China；2.CollegeofAgronomy,HenanAgriculturalUniversity,Zhengzhou,Henan450002,China)

Abstract:Objective To isolate and identify the endophytic fungi from Anhui wild Dendrobium officinale to enrich the types of resources in the endophytic fungi.Methods The endophytic fungi were isolated from root,stem and leaf of the cultivated Dendrobium officinale by tissue inoculation culture,respectively,and then were identified by morphology and rDNA sequence analysis.Results 11 strains from the cultivated Dendrobium officinale were identified as 11 species and 5 genera. Conclusions Endophytic fungi exist richly in Dendrobium officinale,which provides theoretical basis for the research on the symbiotic relationship between the Dendrobium officinale and endophytic fungi.

Key words:Dendrobium officinale；endophytic fungi；isolation；identification

(收稿日期：2015-10-12，修回日期：2015-11-23)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.03.006

作者簡介：郁陽，男，碩士研究生通信作者：王剛，男，教授，碩士生導(dǎo)師，研究方向：天然藥物活性成分研究，E-mail：kunhong_8@163.com

基金項目：國家中醫(yī)藥管理局“中藥化學(xué)”重點(diǎn)學(xué)科建設(shè)(No 2012-2017)