許　燕,趙　爽,邸　亮

(1.云南中醫(yī)學院藥學院,云南 昆明　650500; 2.安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥學部,安徽 合肥　230022)

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藥用植物中鯊烯環(huán)氧酶基因的研究進展

許燕1,趙爽1,邸亮2

(1.云南中醫(yī)學院藥學院,云南 昆明650500; 2.安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院藥學部,安徽 合肥230022)

摘要：鯊烯環(huán)氧酶(SE)存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的微粒體中,在鯊烯轉(zhuǎn)變?yōu)榄h(huán)氧化鯊烯的生物過程中作為生物催化劑起催化作用。而環(huán)氧化鯊烯是從鯊烯生成環(huán)阿屯醇、香樹素、羊毛甾醇等的過程中重要的中間產(chǎn)物。SE的活性決定了環(huán)氧化鯊烯的生物合成的效率,繼而,以環(huán)氧化鯊烯作為前體的各類甾體皂苷、三萜皂苷、甾醇等化合物的生物合成也隨之受其影響,后續(xù)產(chǎn)物的產(chǎn)量取決于它的含量和活性。因此SE被認為是甾體皂苷生物合成途徑中的一個非常重要的調(diào)控酶,已在多種植物中克隆出并進行了初步功能鑒定。該文概述幾個重要藥用植物的SE基因的克隆及原核表達,為從其他藥用植物中克隆SE基因提供一定的參考依據(jù)及方法思路。

關鍵詞：鯊烯環(huán)氧酶；基因克?。辉吮磉_

鯊烯環(huán)氧酶(squalene epoxidase,SE)又稱鯊烯單加氧酶,存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的微粒體中,是催化鯊烯(角鯊烯)轉(zhuǎn)變?yōu)榄h(huán)氧化鯊烯反應的生物催化劑。環(huán)氧化鯊烯是從鯊烯生成羊毛甾醇、環(huán)阿屯醇、香樹素等過程中的重要中間產(chǎn)物。SE的活性決定了環(huán)氧化鯊烯的生物合成的效率,繼而,以環(huán)氧化鯊烯作為前體的各類甾體皂苷、三萜皂苷、甾醇等化合物的生物合成也隨之受其影響,后續(xù)產(chǎn)物的產(chǎn)量取決于它的含量和活性。因此SE被認為是甾體皂苷生物合成途徑中的一個非常重要的調(diào)控酶。三萜皂苷作為一類重要的植物次生代謝產(chǎn)物廣泛分布于各種植物之中,尤其以雙子葉植物中分布為最多,具有重要的生物學意義。三萜皂苷的結構具有多樣性特點,生物活性也具多樣性,具有廣泛的藥理作用和重要的商業(yè)價值。一些珍貴藥用植物中富含三萜皂苷且多數(shù)為其主要的藥用有效成分,如人參三萜皂苷、三七三萜皂苷、重樓三萜皂苷、黃芪三萜皂苷等[1]。而在這些藥用植物中三萜皂苷的合成途徑中的關鍵酶及其表達水平?jīng)Q定了三萜皂苷的含量和組成的變化[2]。

目前公認的合成三萜皂苷元的主要途徑是MVA途徑(甲戊二羥酸途徑)[3-7],其生物合成的過程見圖1,相關英文縮略詞注解見表1。

近幾年來,植物次生代謝產(chǎn)物如三萜皂苷類生物合成的分子機制及其表達量的調(diào)控已經(jīng)成為植物次生代謝研究的前沿和熱點。而三萜皂苷的生物合成過程中不同分支點的重要酶已成為熱點中的熱點。鯊烯環(huán)氧酶將鯊烯催化生成單氧態(tài)氧化鯊烯[8],單氧態(tài)氧化鯊烯在在紫外線和強光刺激作用下生成2,3-氧化鯊烯。2,3-氧化鯊烯再經(jīng)過一系列生化反應后形成三萜皂苷元[9]。Devarenne等[10]研究發(fā)現(xiàn)：三萜皂苷的生成量隨著體外誘導SE的表達量增加而增加,而降低SE的表達量,三萜皂苷的合成則受到抑制。SE可以促進三萜皂苷的釋放,增加三萜皂苷的合成量[11]。Choi等[12]也通過基因微陣列發(fā)現(xiàn)在人參發(fā)根的表達序列標記中,SE等基因與三萜皂苷合成量高度相關,SE基因被茉莉酸甲酯(MeJA)誘導而高表達時三萜的合成量增加；而SE基因在細胞分裂素活化蛋白激酶(MAPK)的作用下發(fā)生磷酸化時三萜合成量就會大幅度降低[13]。調(diào)控SE的活性能夠直接影響到環(huán)氧化鯊烯的生物合成,繼而以環(huán)氧化鯊烯作為前體的各類甾體皂苷、三萜皂苷、甾醇等化合物的生物合成也隨之受其影響,因此SE被認為是甾體皂苷生物合成途徑中的一個非常重要的調(diào)控酶。

圖1　MVA途徑(mevalonic acid pathway,甲戊二羥酸途徑)

縮寫中文全稱英文全稱MVA甲羥戊酸MevalonicacidHMG-CoA3-羥基-3-甲基戊二酸單酰-CoA3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoAHMGRHMG-CoA還原酶3-hydroxy-3-methyl-glutaryl-CoAreductaseIPP異戊二烯焦磷酸IsopentenylpyrophosphateDPP3,3-二甲基丙烯焦磷酸酯dimethylallyldiphosphateGPP焦磷酸牛兒酯geranylpyrophosphateFPP法呢基焦磷酸酯farnesylpyrophosphateFPS法呢基焦磷酸合酶farnesylpyrophosphatesynthaseSS鯊烯合酶squalenesynthaseSQ鯊烯squaleneSE鯊烯環(huán)氧酶squaleneepoxidase

通過NCBI網(wǎng)站(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)在GENE條目下搜索Squalene epoxidase,得到429個條目,其中1個來自于病毒,5個條目來自于細菌,423個條目來自于262個真核生物物種。目前研究最多的領域在真核生物的綠色植物中陸生的維管束植物,NCBI收錄了來自其43個物種的190個條目。下面介紹幾種藥用植物的SE基因的克隆與表達方法。

1人參SE基因的克隆與表達

人參(PanaxginsengC.A.Mey)是多年生草本植物,屬五加科。劉寧等[14-15]提取人參根組織須根總RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA(互補DNA)后并以其為模板對SE基因進行PCR(polymerase chain reaction,聚合酶鏈式反應)擴增。設計引物添加NcoⅠ和NotⅠ酶切位點。PCR反應條件為：94°C 5 min 1個循環(huán)；94°C 1 min、56.2°C 30 s、72°C 1 min 30個循環(huán)；72°C 10 min 1個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)純化后插入原核表達載體構建重組質(zhì)粒。攜帶著目的基因的重組質(zhì)?？赏ㄟ^酶切后測序的手段來鑒定接入的基因是否正確,確定為目的基因后轉(zhuǎn)入Rosetta大腸桿菌,經(jīng)IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)誘導表達后,進行SDS-PAGE(十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳)檢測,并利用LC-MS(液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用技術)檢測SE的含量。結果獲得全長為1 611 bp的SE基因cDNA,編碼537個氨基酸,在NCBI中進行同源性比對,其核苷酸同源性和氨基酸序列同源性極高均為99%以上。他們經(jīng)LC-MS檢測達瑪烯二醇,發(fā)現(xiàn)其生成量隨著SE的增加而增加,證明SE的含量與人參皂苷生成量相關。

人參皂苷作為人參的主要成分,近年來廣泛應用于醫(yī)療衛(wèi)生保健以及化妝品產(chǎn)業(yè),需求量極大。胡薇等[15]的研究發(fā)現(xiàn)SE在人參皂苷的生物合成中起著關鍵性的作用,并且從某種程度上可以說是決定了三萜皂苷的生物合成、控制人參皂苷合成的關鍵酶之一。所以,通過基因技術提高SE基因的表達量可能是提高人參皂苷產(chǎn)量的有效手段。

2三七SE基因的克隆與表達

三七為五加科植物三七(Panaxnotoginseng(Burk.)F.H.Chen)的干燥根和根莖。李珅[16]首次成功分離三七SE基因cDNA。他從三七的根部提取總RNA,通過RT-PCR法從總RNA中擴增出SE基因的cDNA序列。將該cDNA插入克隆載體,得到重組克隆質(zhì)粒。以人參的SE cDNA為模板設計引物,在引物5’末端加入酶切位點和相應的保護堿基序列。以重組克隆質(zhì)粒為模板,擴增SE基因。PCR擴增條件為：94°C 5 min 1個循環(huán)；94°C 1 min、56.2°C 30 s、72°C 50 s 30個循環(huán)；72°C 7 min 1個循環(huán)。得到的三七SE基因含cDNA序列全長為1648 bp,編碼537個氨基酸。將獲得的SE基因序列片段插入表達載體,構建表達載體并測序,結果顯示其讀碼框架正確后將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)plys感受態(tài)細胞,經(jīng)IPTG誘導表達出SE的融合蛋白。SDS-PAGE結果顯示,表達出的蛋白質(zhì)分子量約為64 kD,與理論分子量64 kD基本相符。

人參補氣第一,三七補血第一。三七作為云南白藥的主要成分,其功用可用“止血、散瘀、定痛”六個字來概括。隨著人們保健意識的提高,三七不僅是傷科金瘡藥,近年來已逐漸成為家喻戶曉的保健食材,搭配藥膳食用具有治療糖尿病和心血管疾病的作用。三七的主要有效成分是三萜皂苷,但在三七中三萜皂苷的含量并不高,并且三七的種植比較困難,限制了三七的藥用價值。李坤[16]的研究通過調(diào)控三萜皂苷合成的關鍵酶之一的SE來調(diào)控三萜皂苷的合成,從而彌補三七中三萜皂苷的天然不足,對將來通過基因手段提高三七產(chǎn)量有重要意義。

3龍牙楤木SE基因的克隆與表達

龍牙楤木屬于五加科楤木屬,拉丁學名為Araliamandshrica,多年生落葉小喬木或灌木。由于龍牙楤木與人參同為五加科植物,親緣關系較近,因此成慧等[17]采用RT-PCR的方法,根據(jù)人參SE基因的序列設計引物,并在上下游引物的5’端加酶切位點序列,PCR擴增條件為：94°C 5 min 1個循環(huán)；94°C 1 min、58°C 1 min、72°C 2 min 35個循環(huán)；72°C 7 min 1個循環(huán)。得到的龍牙楤木的SE基因全長為1 682 bp,開放閱讀框(ORF) 1 644 bp,編碼547個氨基酸。成慧等[17]還成功構建了該基因的植物表達載體pAeSE。

龍牙楤木作為藥食兩用植物是寶貴的植物資源,近年來國內(nèi)外市場需求量的劇增,對龍牙楤木掠奪式開發(fā),導致其野生資源瀕臨滅絕。而成慧等[17]的研究,對于通過生物技術來提高龍牙楤木的產(chǎn)量以緩解醫(yī)藥資源緊缺的現(xiàn)狀有重要意義。

4遠志SE基因的克隆

遠志(PolygalatenuifoliaWilld),又名葽繞、蕀蒬,屬蕓香目遠志科,多年生草本。遠志中的有效成分遠志酸其合成途徑中的關鍵酶也是SE,趙云生[18]首次對其基因進行了研究。設計了5對簡并引物,對遠志SE基因進行克隆,得到一條517 bp的片段,在NCBI中通過Blastx比對,該片段屬于SE基因片段。根據(jù)同科的其他植物的SE基因序列推測,已克隆的遠志SE基因片段5'端堿基缺少約1426 bp,3'端堿基缺少約110 bp。他以遠志基因組DNA為模板,采用降落PCR反應篩選的最優(yōu)PCR擴增條件為：95°C 4 min 1個循環(huán)；95°C 1 min、55°C 1 min、72°C 2 min 30個循環(huán)； 95°C 1 min、40°C 1 min、72°C 2 min 15個循環(huán)；72°C 7 min 1個循環(huán)。

遠志具有安神益智、祛痰、消腫等功效,屬我國重點保護的三級野生植物,出口量大,雖然目前已經(jīng)實現(xiàn)遠志的人工種植,但存在重產(chǎn)量輕質(zhì)量的現(xiàn)象。趙云生[18]的研究,通過對遠志SE基因的克隆研究可進一步探求遠志酸生物合成的本質(zhì),進而推動生物技術在遠志高產(chǎn)高質(zhì)上向可行性的方向發(fā)展。

5絞股藍SE基因的克隆

絞股藍屬于葫蘆科、絞股藍屬多年生草質(zhì)攀援植物,拉丁名為Gynostemmapentaphyllum(Thunb.) Makino。蔣軍富等[19]根據(jù)已報道的擬南芥、人參、三七等多種植物的SE基因的 cDNA序列,進行多重比對,在序列保守區(qū)域設計簡并引物,擴增絞股藍SE基因的保守區(qū)的cDNA序列。PCR擴增條件為：94°C 5 min 1個循環(huán)；94°C 40 s、54.1°C 1 min、72°C 90 s 40個循環(huán)；72°C 10 min 1個循環(huán)。再根據(jù)得到SE基因cDNA保守區(qū)序列設計RACE(cDNA末端快速克隆的技術)引物進行RACE 反應。得到的絞股藍SE基因cDNA全長為1 818 bp,編碼525個氨基酸。在NCBI上經(jīng)過Blast比對,該序列與其他已報道的植物的相似性為73%～82%。

絞股藍在中國主要分布在陜西平利、甘肅康縣、湖南、湖北,云南、廣西等省,號稱“南方人參”,民間稱其為神奇的“不老長壽藥草”。蔣軍富等[19]對其SE基因的cDNA克隆研究,為進一步研究三萜皂苷的生物合成機制及其在提高植物藥用價值方面奠定了基礎。

6刺五加SE基因的克隆與表達

刺五加屬于五加科五加屬落葉灌木植物,拉丁名為Eleutherococcussenticosus,其根部和根狀莖可入藥。邢朝斌等[20]在進行刺五加的SE基因克隆時得到兩個SE基因的cDNA序列。他們提取刺五加總RNA并逆轉(zhuǎn)錄為cDNA,根據(jù)NCBI中收錄的與刺五加同科的植物的SE基因cDNA序列設計簡并引物,采用RT-PCR法進行克隆,PCR擴增條件為：94°C 4 min 1個循環(huán)；94°C 1 min、52.5°C 30 s、72°C 1 min 40 s 35個循環(huán)；72°C 10 min 1個循環(huán)。得到2個序列不同的SE基因,開放閱讀框分別為1 665 bp和1 629 bp,分別編碼554和542個氨基酸。通過對兩個SE基因的核苷酸和氨基酸之間進行比對以及生物信息學分析,推測這兩個SE基因在植物體內(nèi)可能參與不同的生物反應途徑,有著不同的表達模式。

邢朝斌等[20]在克隆刺五加SE基因時得到兩組SE基因序列,對于三萜皂苷生物合成途徑中關鍵酶的作用機制及表達模式研究具有重要意義,為日后通過生物技術提高刺五加有效成分產(chǎn)量奠定了基礎。

不僅在刺五加中含有兩個SE基因的cDNA,牛云云等[21]也從三七轉(zhuǎn)錄組的高通量測序結果中經(jīng)拼接、比對獲得兩個編碼SE的基因。兩種SE 同源基因具較高同源性,對其進行生物信息學分析,并采用實時熒光定量PCR等方法檢測其在三七不同組織部位的表達模式,及經(jīng)茉莉酸甲酯誘導處理后基因的表達模式的變化。結果表明這兩種SE基因具不同的表達模式,并推測它們在三七次生代謝產(chǎn)物的合成中可能發(fā)揮不同的作用。據(jù)此,推斷SE 同源基因具有很高的相似性卻催化功能不同。

綜上所述,SE 基因的拷貝數(shù)因物種的差異而不同(表2),植物一般含兩個或兩個以上類型的SE 基因[22]。在模式植物擬南芥(十字花科)中已發(fā)現(xiàn)6 個SE 基因并具有不同的表達模式,其中SE1、SE2、SE3 編碼的蛋白已被鑒定為鯊烯環(huán)氧酶,具有相應的功能。豆科模式植物蒺藜苜蓿中也發(fā)現(xiàn)兩種SE[23]。

表2　文中幾種藥用植物SE基因克隆結果匯總

隨著科技的發(fā)展以及各個學科間的相互融合,分子生物學、蛋白組學和生物信息學在各個學科領域的廣泛滲透和應用,利用組合生物學方法來分析甾體皂苷的生物合成途徑是必要手段。深入了解其生物合成途徑的關鍵步驟,找出其中的關鍵酶及其基因的定位、克隆和高表達,將為利用次生代謝工程技術來提高珍貴或瀕危中草藥的有效成分含量提供理論依據(jù)。如果能從分子水平上實現(xiàn)對甾體皂苷生物合成進行人工調(diào)控,可緩解由于過度采挖珍貴藥用資源而帶來的生態(tài)環(huán)境問題,成為大規(guī)模生產(chǎn)最有效可行的辦法。這不僅對于基礎研究,而且對于增加有效成分的產(chǎn)量,提高經(jīng)濟效益都有重要意義。本文概述幾個重要藥用植物的SE基因的克隆及原核表達方式方法,為從其他藥用植物中克隆SE基因及其他關鍵酶基因提供一定的參考依據(jù)及方法思路,為次生代謝工程技術在藥用植物開發(fā)上的應用一定的提供理論依據(jù)。

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Research progress on squalene epoxidase gene of the medicinal plant

XU Yan1,ZHAO Shuang1,DI Liang2

(1.SchoolofPharmacy,YunnanUniversityofTCM,Kunming,Yunnan650500,China; 2.DepartmentofPharmacy,TheFirstAffiliatedHospitalofAnhuiUniversityofChineseMedicine,Hefei,Anhui230022,China)

Abstract:Squalene epoxidase exists in the microsome of the endoplasmic reticulum,which acts as a bio-catalyst in the process of squalene turning to epoxidation squalene.Epoxidation squalene is an intermediate product generated from the process of squalene producing cycloartenol,amyrin,and lanosterol.The activity of SE determines the effficiency of the biosynthesis of epoxidation squalene,which then affects the speed to synthesize steroid saponin,triterpenoid saponin,and sterol and also the activity and quanlity of them.So SE has been taken as an important regulatory enzyme in the biosynthesis of cycloartenol,which was cloned from several plants and its basic functions were ensured.This article summarizes the cloning of SE genes in some medicinal plants and their prokaryotic expression,provides reference for SE gene cloning in other medicinal plants.

Key words：squalene epoxidase；gene cloning；prokaryotic expression

(收稿日期：2015-10-17,修回日期：2015-12-09)

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2016.03.003

作者簡介：許燕,女,碩士研究生通信作者：趙爽,女,副教授,碩士生導師,研究方向：藥用植物資源,E-mail：zm_zs@126.com

基金項目：國家自然科學基金(No 81160502)；云南省自然科學基金(No 2011FZ153)；云南省教育廳自然科學基金(No 2013J040)