丁同斌，簡立國，張麗華，劉士超，趙江濤，程　棟

鄭州大學第二附屬醫(yī)院心內科 鄭州 450014

△男，1982年2月生，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：冠心病的基礎與臨床，E-mail:dingtongbin_2005@126.com

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瑞舒伐他汀對心肌肥厚大鼠心肌組織 Beclin-1蛋白表達的影響

丁同斌△，簡立國，張麗華，劉士超，趙江濤，程棟

鄭州大學第二附屬醫(yī)院心內科 鄭州 450014

△男，1982年2月生，碩士，主治醫(yī)師，研究方向：冠心病的基礎與臨床，E-mail:dingtongbin_2005@126.com

關鍵詞瑞舒伐他?。粔毫Τ摵?；心肌肥厚；Beclin-1；大鼠；自噬

摘要目的：探討瑞舒伐他汀對心肌肥厚大鼠心肌組織中自噬相關蛋白Beclin-1表達的影響。方法：健康雄性SD大鼠75只，隨機分為假手術組、模型組和RSV組，每組25只，模型組和RSV組通過腹主動脈縮窄術建立心肌肥厚模型，術后分別給予生理鹽水和瑞舒伐他汀(4 mg/kg)灌胃,1次/d，連用4周。4周后測定心臟指數(shù)，用RT-PCR和Western blot法分別檢測大鼠左心室心肌組織中Beclin-1 mRNA和蛋白的表達水平。結果：與假手術組比較，模型組大鼠心肌明顯肥厚，心臟指數(shù)升高，心肌組織中Beclin-1 mRNA和蛋白表達上調(P<0.05)；與模型組比較，RSV組大鼠心肌無明顯肥厚，心臟指數(shù)降低，心肌組織中Beclin-1 mRNA和蛋白表達下降(P<0.05)。結論：瑞舒伐他汀可抑制壓力超負荷性心肌肥厚，其作用機制可能與降低自噬水平有關。

Effect of rosuvastatin on expression of Beclin-1 in myocardial tissue of rats with myocardial hypertrophy

DINGTongbin,JIANLiguo,ZHANGLihua,LIUShichao,ZHAOJiangtao,CHENGDong

DepartmentofCardiovascular，theSecondAffiliatedHospital，ZhengzhouUniversity，Zhengzhou450014

Key wordsrosuvastatin；pressure overload；myocardial hypertrophy；Beclin-1;rat;autophagy

AbstractAim: To investigate the effect of rosuvastatin(RSV) treatment on Beclin-1 expression in myocardial tissue of rats with myocardial hypertrophy due to autophagy.Methods: A total of 75 healthy male SD rats were randomly allocated into 3 groups:sham operation group, model group, and RSV group, 25 rats in each group. Model group and RSV group were given normal saline and RSV (4 mg/kg) by gavage,respectively, one time a day and for 4 weeks. The heart samples were collected after four weeks to detect the expressions of Beclin-1 mRNA and protein using RT-PCR and Western blot.Results: Compared with sham operation group, myocardial hypertrophy, cardiac index and the expressions of Beclin-1 mRNA and protein in the model group increased(P<0.05). Compared with the model group, there was no obvious cardiac hypertrophy,and cardiac index,the expressions of Beclin-1 mRNA and protein were lower in RSV group(P<0.05).Conclusion: RSV could inhibit pressure overload cardiac hypertrophy, and the mechanism may be related with the decreased expression of Beclin-1.

心肌肥厚是心力衰竭的主要原因之一。早期壓力超負荷可引起代償性心肌肥厚，有利于維持心臟輸出量，但是長時間過度心肌肥厚會導致猝死[1]。羥甲基戊二酸甲酰輔酶A還原酶抑制劑(他汀類)的調血脂作用已得到公認。近年研究[2-4]表明，除降脂作用外，他汀類藥物還具有抗炎、抗氧化、改善內皮細胞功能、抑制平滑肌細胞增殖等作用，并可有效抑制心肌肥厚及肥厚心臟向心衰的轉變。自噬是一個高度保守的生命過程，生理條件下自噬是細胞長存蛋白和細胞器代謝再循環(huán)的主要方式，而過度自噬將導致自我消化而加重損傷。自噬相關蛋白Beclin-1在自噬和腫瘤中扮演重要角色，是一種雙等位抑癌基因，是哺乳動物參與自噬的特異性基因，在心肌缺血再灌注[5]和心肌肥大過程中發(fā)揮重要作用[6]。目前瑞舒伐他汀(rosuvastatin)的抗心肌肥厚分子機制尚不明確，該研究建立腹主動脈縮窄術致心肌肥厚大鼠模型，觀察瑞舒伐他汀對模型大鼠術后Beclin-1表達的影響。

1材料與方法

1.1實驗動物、試劑與設備健康雄性SD大鼠75只，體重(250±23) g，由河南省實驗動物中心提供，動物合格證號SCXK(滬)2010-0005。瑞舒伐他汀(阿斯利康公司)，RNA提取試劑盒(上海萊楓試劑公司)，反轉錄試劑盒和實時熒光定量PCR試劑盒(TaKaRa公司)，Beclin-1和β-actin引物(上海生工生物工程有限公司)，Beclin-1兔抗大鼠單克隆抗體(美國Abcam公司)，堿性磷酸酶標記的山羊抗兔抗體(南通碧云天公司)，實時熒光PCR儀(美國Thermal Cycler Dice?Real Time System)，蛋白電泳轉印定量系統(tǒng)(美國 V3 Western Workflow)。

1.2實驗分組采用隨機數(shù)字表法將大鼠分為3組：假手術組、模型組和瑞舒伐他汀治療組(RSV組)，每組25只。模型組和RSV組按下述方法造模：大鼠經(jīng)水合氯醛腹腔注射麻醉后固定、備皮、碘伏消毒，取腹正中切口，沿腹白線進入腹腔，游離暴露腹主動脈并沿長軸平行放置一個7號針頭， 醫(yī)用4號線結扎，立即抽出針頭，造成腹主動脈狹窄，分層關閉腹腔。假手術組僅做腹主動脈分離，不結扎。3組術后均連續(xù)3 d腹腔注射青霉素20萬U預防感染。術后假手術組、模型組灌胃生理鹽水，RSV組灌胃瑞舒伐他汀4 mg/kg，1次/d，連續(xù)4周。

1.3觀測指標

1.3.1形態(tài)學觀察4周后用水合氯醛麻醉動物，稱體重并處死，開胸取心臟稱重，計算心臟指數(shù)，心臟指數(shù)=心臟質量(g)/體重(kg)。取左心室心肌組織，切片，蘇木精染色15 min，中性樹膠1～2滴封片。

1.3.2左心室心肌組織中Beclin-1 mRNA的檢測

冰上操作取左心室心肌組織，按試劑盒說明書操作，進行RNA提取、反轉錄及PCR。Beclin-1上游引物：5’-AAGATTGAAGACACTGGAGGCA-3’，下游引物:5’-GAGGACACCCAAGCAAGACC-3’；內參β-actin上游引物：5’-AGCCATGTACGTAGCCATCC-3’ ，下游引物： 5’-CTCTCAGCTGTGGTGGTGAA-3’。產(chǎn)物經(jīng)瓊脂凝膠電泳，取標準品和β-actin 5 μL，加入EASY Dilution 45 μL并稀釋cDNA。后離心，每個濃度設2個復孔標準品。每個待測樣品設3個復孔。 溫度95 ℃/1 min，60 ℃/1 min，72 ℃/1 min。反復40 次,最后一次延長 7 min。 TaKaRa Code TP800處理收集熒光信號。

1.4統(tǒng)計學處理采用 SPSS 17.0進行統(tǒng)計學分析，3組心臟指數(shù)、心肌組織中Beclin-1 mRNA和蛋白表達水平的比較采用單因素方差分析，檢驗水準α=0.05。

2結果

2.1大鼠心肌形態(tài)學變化3組心臟大體標本見圖1，假手術組、模型組、RSV組心臟指數(shù)分別為(3.87±0.11)、(4.68±0.81)和(3.91±1.15) g/kg，3組比較，差異有統(tǒng)計學意義(F=7.853,P<0.001)；RSV組低于模型組，與假手術組比較，差異無統(tǒng)計學意義(P<0.05)。HE染色結果見圖2；顯微鏡下可見，假手術組心肌組織排列整齊，心肌細胞排列正常，間質無明顯增生，無血管擴張和血管壁增厚等表現(xiàn)；模型組心肌組織排列紊亂，心肌細胞明顯肥大，胞質豐富，細胞間隙不明顯，細胞核增大； RSV組與假手術組無明顯差異。

A：假手術組;B:模型組;C:RSV組。圖1　3組心臟大體標本

A:假手術組;B:模型組;C: RSV組。圖2　3組心肌組織形態(tài)學表現(xiàn)(HE,×400)

2.2心肌組織中Beclin-1的表達情況見表1。模型組心肌組織中Beclin-1 mRNA和蛋白的表達水平均明顯高于假手術組，而RSV組Beclin-1蛋白的表達水平較模型組降低。

表1　3組大鼠心肌組織中Beclin-1表達的比較

*:與假手術組比較，P<0.05;#:與模型組比較，P<0.05。

3討論

正常機體在外界機械性刺激以及神經(jīng)體液因子的刺激下，產(chǎn)生代償性心肌肥厚，代償性心肌肥厚能夠增加心排出量，但長時間過度心肌肥厚會導致心臟功能失代償，最終導致心衰和死亡。瑞舒伐他汀是一種高效的他汀類藥物，具有良好的臨床應用前景。近年研究[2-3]表明，他汀類藥物具有多效性，不僅可抗炎、調脂、穩(wěn)定斑塊、調節(jié)免疫、抗腫瘤，而且具有改善心肌肥厚的作用。該研究選擇瑞舒伐他汀進行實驗，結果再次證實瑞舒伐他汀灌胃可明顯抑制壓力超負荷性引起的大鼠心肌肥厚。

自噬是細胞的代謝機制，被認為與神經(jīng)退變、腫瘤發(fā)生、糖尿病等多種疾病密切相關。在心臟，自噬也是新陳代謝和應急供能的主要細胞機制，自噬體系缺乏或突變，往往導致各種心肌病和心肌肥大[7]。研究[6]表明，相比較于假手術組，腹主動脈縮窄模型大鼠心肌組織中Beclin-1表達顯著增加，并且過表達Beclin-1基因能增加心肌肥厚的發(fā)生，證實在心肌肥厚的發(fā)生發(fā)展過程中Beclin-1基因具有關鍵作用。該研究結果表明，與心肌肥厚模型組比較，RSV組大鼠心臟無明顯肥厚，心肌組織中Beclin-1蛋白的表達水平顯著降低，說明瑞舒伐他汀可減少壓力超負荷性心肌肥厚的發(fā)生，并且其機制可能與抑制自噬蛋白Beclin-1的表達有關。

綜上所述，此次實驗結果表明，瑞舒伐他汀可減少大鼠心肌肥厚的發(fā)生，并顯著下調腹主動脈縮窄模型大鼠心肌組織中Beclin-1蛋白的表達。由此推測，瑞舒伐他汀對腹主動脈縮窄模型大鼠心肌肥厚的抑制機制可能與其能夠抑制自噬的發(fā)生有關，但其確切的治療機制尚不清楚，仍需進一步研究。

參考文獻

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中圖分類號R542.2

doi：10.13705/j.issn.1671-6825.2016.02.028