王光潔，蔣　華

?

JAM－1功能缺失對移植角膜透明度的影響

王光潔，蔣華＊

［摘要］目的觀察2種處理方式的供體角膜在移植后的成活情況研究角膜內(nèi)皮JAM－1的功能。方法首先進行免疫組織化學(xué)檢測，以確定所用抗體與大鼠角膜內(nèi)皮細胞的結(jié)合。然后處理供體角膜片，24片供體角膜取自12只Wistar大鼠，直徑3 mm。其中右眼12片為實驗組，左眼12片為對照組。用不含CaCl2和MgCl2的Hank′s液孵育以使細胞連接斷開利于抗體結(jié)合；之后實驗組加入抗JAM－1抗體EP1042Y，對照組加入抗體稀釋液0.2 ml，作用15 min。濾紙吸干水分，轉(zhuǎn)入高糖型DMEM，31.7℃培養(yǎng)保存3 d；最后，進行同種異體移植，24只受體大鼠分為兩組，分別使用實驗組和對照組供體角膜，植床直徑3 mm，術(shù)后5－0絲線間斷縫合上下瞼緣2針。術(shù)后3、7、10 d進行裂隙燈檢查，觀察和評估角膜透明度和新生血管情況。結(jié)果免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示JAM－1分子存在于角膜內(nèi)皮和上皮細胞，并且能與抗體EP1042Y有效結(jié)合。JAM－1功能缺失的供體角膜在各觀察時間點透明度均較對照組差并且易于出現(xiàn)新生血管。結(jié)論作為細胞緊密連接構(gòu)成成分的JAM－1，對維持供體角膜的透明和移植的成功必不可少。

［關(guān)鍵詞］JAM－1；組織培養(yǎng)保存；角膜移植；緊密連接；角膜內(nèi)皮細胞

［作者單位］250031山東濟南，濟南軍區(qū)總醫(yī)院眼科（王光潔，蔣華）

Influence of JAM－1 afunction on the transparency of corneal graft

WANG Guang－jie，JIANG Hua.Department of Ophthalmology，the General Hospital of Jinan Military Region，Jinan，Shandong 250031，China

［Abstract］ObjectiveTo approach the function of JAM－1 in corneal endothelium by observing the transparency and the development of neovessels of 2 group corneal grafts processed by different methods before penetrating corneal transplantation.Methods Immunohistochemistry methods were used to detect the presence of JAM－1 in corneal endothelium and the antibody's binding with the cell junctions of corneal endothelium.Twentyfour donor corneas were derived from 12 Wistar rats and the diameter of graft were 3mm.Twelve grafts from the right eye were arranged to experimental group，and rest 12 grafts from the left eye to control group.All corneas were incubated in Hank's solution without CaCl2and MgCl2for 10 min in order to break the cell junctions for pomoting the antidody's binding.Then corneas of the experimental group were incubated with antibody EP1042Y solution and that of control group were incubated with antibody dilution for 15 min.After ward，water content of these corneas were dried with filter paper and them were conserved in DMEM with high glucose for 3 d at 31.7℃；finally allogeneil graft penetrating cornea transplantation was carried out using the 2 group grafts described above.Twenty－four acceptor rats were divided into 2 groups equally for receiving the corneas of experimental group and control group，respectively.The recipient bed was designed to 3mm in diameter.After surgery，the margo palpebraes were sutured with 5－0 suture silk.Slit－lamp examination were processed on the day 3，7 and 10 after surgery，and the transparency and the development of neovessels were observed and evaluated.Results Immunohistochemistry showed that JAM－1 resided in the cell junction of cornea endothelium and epithelium and that the used antibody EP1042Y was effective.In cornea transplantation，the JAM－1 afunction grafts were less transparent than the control group and prone to develop neovessels.Conclusion JAM－1，as a component of cell junctions，it's function is essential for corneal grafts' transparency and even for the success of penetrating cornea transplantation surgery.

［Key words］JAM－1；Tissue culture preservation；Corneal transplantation；Corneal endothelium cell

上皮和內(nèi)皮組織中，接合黏附分子－1（junctional adhesion molecule－1，JAM－1）是緊密連接有調(diào)節(jié)作用的跨膜分子。其通過N末端環(huán)的同嗜性黏附調(diào)節(jié)緊密連接的滲透性起作用。有資料顯示角膜內(nèi)皮細胞的緊密連接是滲透性屏障主要功能區(qū)，對維持角膜的透明有重要作用，而JAM－1分子是這一屏障的重要構(gòu)成組分。為研究JAM－1分子對角膜透明度的影響，筆者采用內(nèi)皮細胞JAM－1被阻斷的角膜作為供體進行了同種異體角膜移植術(shù)，觀察了術(shù)后不同階段供體角膜的成活和透明度以探究JAM-1的功能。

1　材料與方法

1.1儀器與試劑兔抗JAM－1單克隆抗體EP1042Y，英國Abcam公司。96孔板，24孔板，恒溫孵育箱，DMEM組織培養(yǎng)液。手術(shù)器械與設(shè)備主要有：SOM2000A手術(shù)顯微鏡（蘇州醫(yī)療器械總廠），3 mm直徑角膜環(huán)鉆，15°角膜穿刺刀，顯微角膜剪，5－SA組織鑷，5組織鑷，顯微線剪，MANI牌11－0尼龍帶針眼科縫合線（日本）。

1.2使用動物Wistar大鼠40只，雌性，體重225～275 g，其中4只用于免疫組織化學(xué)檢測，12只用于供體角膜片獲取，24只分為兩組作為移植受體。

1.3抗體效用的免疫組織化學(xué)檢測Wistar大鼠4只，過量氯胺酮處死后，摘除眼球，眼球切為兩部分并去除晶狀體及玻璃體，4%中性甲醛固定過夜。常規(guī)進行石蠟包埋切片及檢測，JAM－1單克隆抗體濃度1∶100，使用HRP標記的羊抗兔多克隆抗體作為二抗，顯色劑DAB。中止反應(yīng)后，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封固。

1.4供體角膜片的取材和處理12只大鼠以過量鹽酸氯胺酮處死。動物死亡1 h內(nèi)，無菌下手術(shù)操作取鼠角膜，直徑3 mm，共取角膜片共24個，其中實驗組12個均為右眼，對照組12個均為左眼。放入DMEM液中暫存后兩組角膜均放置于96孔板內(nèi)，分別滴加不含CaCl2和MgCl2的Hank′s液0.1 ml，31℃孵育10 min以使細胞連接斷開利于抗體結(jié)合，之后吸除孔內(nèi)液體。實驗組加入抗JAM－1抗體EP1042Y0.2 ml（濃度為1/200，約為5 g/ml），對照組加入抗體稀釋液0.2 ml，作用15 min。取出角膜，濾紙吸干水份，轉(zhuǎn)入裝滿高糖型DMEM（內(nèi)加青霉素和鏈霉素混合液）的24孔板內(nèi)。將24孔板放置于水浴箱內(nèi)，溫度31.7℃，培養(yǎng)3 d，此期間不更換培養(yǎng)液。保存后不進行脫水處理。

1.5手術(shù)步驟動物麻醉與術(shù)前準備：10%水合氯醛與0.02%安定的混合液0.8 ml腹腔注射，復(fù)方托品酰胺滴眼3次以散大術(shù)眼瞳孔，表麻滴酮滴眼3次進行表面麻醉。備皮后常規(guī)消毒、鋪無菌巾。球后注射生理鹽水0.2 ml，使眼球脫臼突出以利于手術(shù)操作。生理鹽水沖洗結(jié)膜囊，吸水棉簽吸干角膜表面水分，3 mm直徑環(huán)鉆在中央部角膜打印，深度為1/3至1/2角膜厚度，15°角膜穿刺刀傾斜15°由側(cè)方穿入前房，前房內(nèi)注入少量玻璃酸鈉，略擴大穿刺口后以角膜剪沿環(huán)鉆印剪下角膜，使創(chuàng)緣略為傾斜（取植片時與此傾斜度相同）。前房內(nèi)滴入玻璃酸鈉，取培養(yǎng)保存的角膜片放置于植床上。以11－0顯微縫線進行間斷縫合，共8針。創(chuàng)緣閉合良好后，前房注入復(fù)方林格氏液，沖洗出透明質(zhì)酸鈉。檢查傷口閉合好，無滲液和漏水后，結(jié)膜囊涂少量典必殊眼膏，5－0絲線間斷縫合上下瞼緣2針，手術(shù)結(jié)束。

1.6術(shù)后處理與觀察術(shù)后氧氟沙星滴眼液滴眼，4次/d。術(shù)后3d拆除眼瞼縫線。在術(shù)后3、7、10d進行裂隙燈檢查，觀察角膜愈合情況及透明度，新生血管及并發(fā)癥。以傷口閉合好，前房形成為手術(shù)成功標準。成功者進行角膜成活情況的比較。使用Quantock等［1］的評分標準記錄數(shù)據(jù)，評估角膜移植片的透明度和新生血管情況。對于透明度的計分方法為：0＝角膜透明，1＝適度角膜混濁，2＝嚴重角膜混濁。對于新生血管的計分方法為：0＝無血管，1＝適度新生血管僅在受體角膜，2＝植片組織嚴重新生血管。

2　結(jié)果

2.1免疫組織化學(xué)結(jié)果免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示JAM－1分子存在于角膜內(nèi)皮和上皮細胞，并且能與抗體EP1042Y有效結(jié)合。在角膜內(nèi)皮層及上皮層均有明確的抗體陽性染色（圖1）。

圖1　JAM－1的免疫組織化學(xué)檢測×70

2.2角膜移植結(jié)果每組均有10例成功，另外2例因傷口閉合不良前房未形成，排除在外。對照組在角膜移植手術(shù)完成后即明顯透明（圖2A），而實驗組在手術(shù)完成后略顯混濁（圖2B）。術(shù)后3 d時對照組更加透明（圖2C），而實驗組混濁加重（圖2D）。1周時對照組輕度混濁，僅有少量血管位于植床側(cè)傷口邊緣（圖2E），實驗組角膜大部分混濁（圖2F），移植片周圍植床已有明顯血管長入。10 d時對照組透明度下降，移植片周圍有血管長入，實驗組完全混濁，血管長入明顯。表1列出了術(shù)后0、3、7、10 d的各組角膜透明度和新生血管得分（各組的積分和）。

圖2　角膜移植結(jié)果

表1　術(shù)后角膜透明度及新生血管情況得分（每組總分）

3　討論

緊密連接是角膜基質(zhì)和營養(yǎng)豐富的房水之間的重要生理屏障，限制旁細胞途徑的離子、水和大分子的彌散。當它們的滲透性增強時允許營養(yǎng)成分進入無血管的基質(zhì)［2］，而角膜內(nèi)皮的Na/K－ATP酶則將鹽轉(zhuǎn)運出角膜由此帶出水分［3］。二者結(jié)合的這種動態(tài)機制形成一種滲透梯度，在維持角膜透明的同時允許營養(yǎng)傳送入基質(zhì)。JAM－1是對緊密連接有調(diào)節(jié)作用的跨膜分子。JAM－1通過N末端環(huán)的同嗜性黏附對其在細胞方面的功能，特別是調(diào)節(jié)緊密連接的滲透性方面起作用［4］。但JAM－1在角膜的作用是否如此還不清楚，現(xiàn)有資料有限［5］。為驗證JAM－1的調(diào)節(jié)作用及其功能缺失后對角膜內(nèi)皮功能的影響，利用緊密連接破裂將引起角膜水腫和光學(xué)透明性喪失的特點，設(shè)計并進行了角膜移植的實驗。

在進行培養(yǎng)保存前角膜片要與不含CaCl2和MgCl2的Hank′s液在31℃下進行孵育，目的是使細胞連接斷開以利于抗體結(jié)合。此時由于細胞連接的旁細胞滲透功能受到影響，角膜組織已經(jīng)開始水腫。在轉(zhuǎn)入含有Ca2＋和Mg2＋的DMEM液后，實驗組角膜由于加入了抗JAM－1抗體EP1042Y，細胞連接的結(jié)構(gòu)和功能沒有恢復(fù)而繼續(xù)水腫。與實驗組不同，對照組因缺Ca2＋和Mg2＋造成的旁細胞滲透性升高隨環(huán)境的恢復(fù)而恢復(fù)正常，水腫得到逐漸恢復(fù)。將培養(yǎng)保存的時間設(shè)為3 d，一方面是為了使對照組因細胞連接受損而水腫的角膜能夠恢復(fù)，實驗組的角膜因抗體的存在細胞連接未恢復(fù)，繼續(xù)處于水腫狀態(tài)或加重，而DMEM本身使角膜發(fā)生水腫的作用也再繼續(xù)。另一方面也為了防止發(fā)揮阻斷作用的抗體EP1042Y因保存時間過長致抗體退化、被內(nèi)吞或為內(nèi)源性配基所取代，其最終結(jié)果會使細胞連接重新封閉，恢復(fù)旁細胞滲透性的調(diào)節(jié)作用。從角膜移植的結(jié)果看，抗體的作用并沒有被很快消除，在兩組之間形成顯著差別，既實驗組移植后透明度差，易發(fā)生新生血管。這說明所用的抗JAM－1單克隆抗體EP1042Y還是相當穩(wěn)定的。因此在抗體阻斷JAM－1后保存3 d再進行角膜移植實驗的設(shè)計是合理的。

以組織培養(yǎng)法保存的角膜不可避免地會發(fā)生基質(zhì)的水腫、透明度下降及后彈力層皺褶［6，7］，這會造成內(nèi)皮細胞密度的下降。在我們先前的研究中，培養(yǎng)保存的角膜在單克隆抗體將JAM－1分子封閉后發(fā)生了更為嚴重的水腫，內(nèi)皮細胞密度也進一步下降［8，9］。另一方面。角膜內(nèi)皮細胞的密度低于臨界數(shù)值就會使角膜水腫，因而在保存過程中要盡可能降低內(nèi)皮細胞的損失，使角膜內(nèi)皮細胞的密度高于臨界水平。這樣的角膜臨床上才可以作為供體應(yīng)用。由于保存過程中不可避免地會有內(nèi)皮細胞的丟失［10］，且DMEM液中未加入血清、生長因子等利于內(nèi)皮生長和存活的成分，不適合于長期角膜保存。為了避免因保存時間過長使內(nèi)皮細胞損失過多和抗體效價降低影響實驗結(jié)果，將角膜片在DMEM液中的保存時間減少至3 d。

在對大鼠角膜移植術(shù)后的觀察中可以看到，JAM－1功能缺失的角膜作為供體在移植后透明度下降，與對照組相比其透明度和新生血管的積分明顯較高。在移植后實驗組的角膜更易于新生血管化。由于樣本量較少，沒有對兩組的積分情況進行統(tǒng)計學(xué)分析，但移植后不同階段的照片和所得到的數(shù)據(jù)足以說明EP1042Y單克隆抗體對角膜內(nèi)皮細胞的功能造成了嚴重的損害，以致術(shù)后角膜透明度下降，并且隨術(shù)后時間的延長其結(jié)果更為嚴重。移植實驗結(jié)果顯示抗體阻斷JAM－1所產(chǎn)生效應(yīng)一直持續(xù)到移植后，超過了3 d的保存時間。從效應(yīng)的持續(xù)時間上看，這與Kenneth等［5］的研究中水腫可在十幾小時內(nèi)恢復(fù)有所不同。這可能與所用抗體不同有關(guān)，因抗體的效價及其與配體的親和力對此是有影響的。

在角膜移植后，實驗組的角膜供體在觀察的各時間點均比對照組的透明度差，新生血管生長也快，最后角膜完全混濁。這說明抗JAM－1單克隆抗體的作用并沒有因移植于受體動物而被削弱。這有可能是移植受體還沒有來得及將受損的緊密連接完全修復(fù)移植片就已經(jīng)逐漸失代償而混濁了。而抗體的阻斷作用究竟能持續(xù)多長時間還不能確定。本實驗研究從角膜移植的角度證實了JAM－1是角膜內(nèi)皮發(fā)揮正常功能不可缺少的跨膜分子，但其信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑還不清楚。也許通過基因轉(zhuǎn)染或RNA干擾能夠揭示更深層次的機制，這需要以后更為深入的研究。

參考文獻

［1］Quantock AJ，Sano Y，Young RD，et al.Stromal architecture and immune tolerance in additive corneal xenografts in rodents［J］.Acta Ophthalmol Scand，2005，83（4）：462-466.

［2］Fromm M，Levarlet B，Kreusel KM，et al.Tight junctions of the human corneal endothelium：morphological and electrophysiological features［J］.Ger J Ophthalmol，1994，3（3）：253-257.

［3］Geroski DH，Edelhauser HF.Quantitation of Na/K ATPase pump sites in the rabbit corneal endothelium［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，1984，25（9）：1056-1060.

［4］Ebnet K，Suzuki A，Horikoshi Y，et al.The cell polarity protein ASIP/PAR－3 directly associates with junctional adhesion molecule（JAM）［J］.EMBO J，2001，20（23）：3738-3748.

［5］Kenneth J.Mandell，Glenn P.Holley，Charles A.Parkos，et al.Antibody blockade of junctional adhesion Molecule－A in rabbit corneal endothelial tight junctions produces corneal swelling［J］.Investigative Ophthalmology and Visual Science，2006，47（23）：2408－2416.

［6］Borderie VM，Baudrimont M，Lopez M，et al.Evaluation of the deswelling period in dextran－containing medium after corneal organ culture［J］.Cornea，1997，16（2）：215－223.

［7］Thuret G，Manissolle C，Campos GL，et al.Animal compoundfree medium and poloxamer for human corneal organ culture and deswelling［J］.Invest Ophthalmol Vis Sci，2005，46（8）：816－822.

［8］王光潔，蔣華.接合黏附分子－1在大鼠角膜中的表達研究［J］.中華實驗眼科雜志，2012，30（2）：204－208.

［9］王光潔，蔣華.接合黏附分子－1功能缺失對大鼠角膜內(nèi)皮的影響［J］.中國實用眼科雜志，2011，29（11）：1203－1206.

［10］Rieger R，Jaroszewski J，Jaeckel C，et al.Endothelial cell loss duringstorage of donor corneas in culture media containing dextrane.15th confererce of the European Eye Bank Associatiion［C］.Bruxelles，Belgium，2003.

［2015－07－28收稿，2015－08－22修回］

［本文編輯：張鴻瑫］

［通訊作者］蔣華，Email：jianghua@126.com

DOI：10.14172/j.issn1671-4008.2016.01.020

［中圖分類號］R779.65：R-331

［文獻標志碼］A