王馳柳柯趙立東候琨施磊楊仕明寧博江蘇省徐州市中心醫(yī)院耳鼻咽喉科(江蘇009）解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，解放軍耳鼻咽喉研究所（北京0085）中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（沈陽(yáng)000）

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老年性聾耳蝸帶狀突觸數(shù)量在時(shí)空上的改變

王馳1柳柯2趙立東2候琨2施磊3楊仕明2寧博1
1江蘇省徐州市中心醫(yī)院耳鼻咽喉科(江蘇221009）
2解放軍總醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，解放軍耳鼻咽喉研究所（北京100853）
3中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科（沈陽(yáng)110001）

【摘要】目的研究年齡相關(guān)性聽(tīng)力損失過(guò)程中聽(tīng)力閾值變化與耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞帶狀突觸標(biāo)記物數(shù)量之間的關(guān)系。方法應(yīng)用C57BL/6J小鼠進(jìn)行本研究。在本研究中，對(duì)鼠齡為1、2、4、6和12個(gè)月的C57BL/6J小鼠分別進(jìn)行ABR閾值檢測(cè)分析(Click & Tone burst)。對(duì)被檢測(cè)小鼠的耳蝸基底膜標(biāo)本進(jìn)行突觸前特異蛋白R(shí)IBEYE/CtBP2進(jìn)行免疫熒光標(biāo)記，采用激光共聚焦觀察結(jié)合三維重建的方法來(lái)計(jì)數(shù)突觸標(biāo)記物(RIBEYE/CtBP2)的數(shù)量并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果小鼠的ABR閾值從鼠齡4個(gè)月時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)顯著抬高(P<0.05)，以后在鼠齡為6和12個(gè)月時(shí)抬高更加明顯。在頻率分布上，這種閾值的抬高在高頻區(qū)域(8KHz & 16KHz)表現(xiàn)的最為明顯。同時(shí)，本研究發(fā)現(xiàn)標(biāo)記物的數(shù)量和ABR閾值的變化呈現(xiàn)一致性的改變：突觸標(biāo)記物數(shù)量也在4個(gè)月時(shí)開(kāi)始出現(xiàn)減少(P<0.05)，且隨著鼠齡的增加數(shù)量減少更加明顯。這種數(shù)量減少的表現(xiàn)在高頻區(qū)域(8KHz & 16KHz)表現(xiàn)得尤為顯著(P<0.01)。在聽(tīng)力減退的早期階段(鼠齡4-6個(gè)月)，小鼠毛細(xì)胞，尤其是內(nèi)毛細(xì)胞數(shù)量并未現(xiàn)明顯的減少。結(jié)論老年性聽(tīng)力損失和耳蝸帶狀突觸的數(shù)量改變密切相關(guān)，突觸數(shù)量的減少可能是導(dǎo)致年齡相關(guān)性聽(tīng)力損失的一個(gè)重要因素。

【關(guān)鍵詞】老年性聾；C57小鼠；耳蝸帶狀突觸；RIBEYE/CtBP2；內(nèi)毛細(xì)胞；

對(duì)于這個(gè)突觸結(jié)構(gòu)在老年性聾發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中是否發(fā)揮作用以及發(fā)揮何種作用的問(wèn)題，長(zhǎng)期以來(lái)一直鮮有報(bào)道。Stamatak等發(fā)現(xiàn)衰老過(guò)程中突觸后神經(jīng)末梢存在折疊結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)似乎影響了動(dòng)物的聽(tīng)力水平[1]。在前期的研究中發(fā)現(xiàn)小鼠的帶狀突觸數(shù)量在衰老過(guò)程中也發(fā)生了顯著變化，這種變化和聽(tīng)力的變化之間存在一定的相關(guān)性。下面就將這方面的研究結(jié)果作系統(tǒng)性的報(bào)告。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

本實(shí)驗(yàn)采用SPF級(jí)C57BL/6J (由中國(guó)軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心提供)進(jìn)行，共選取50只小鼠（100個(gè)耳蝸），入組要求ABR聽(tīng)閾正常，排除中耳及內(nèi)耳疾病。動(dòng)物隨機(jī)分為5組，每組10只。分別在鼠齡為1個(gè)月、2個(gè)月、4個(gè)月、6個(gè)月和12個(gè)月時(shí)對(duì)其聽(tīng)力水平進(jìn)行聽(tīng)性腦干反應(yīng)（ABR）檢測(cè)。本研究所有實(shí)驗(yàn)操作均得到中國(guó)人民解放軍總醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)。

1.2聽(tīng)功能測(cè)試

動(dòng)物分別于鼠齡1M,2M,4M,6M和12M時(shí)行雙耳ABR閾值測(cè)試，采用美國(guó)TDT測(cè)聽(tīng)設(shè)備，Biosig測(cè)聽(tīng)軟件對(duì)小鼠進(jìn)行ABR閾值檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)在隔聲屏蔽室內(nèi)進(jìn)行，測(cè)聽(tīng)前使用10%水合氯醛（4.5ml~5ml/Kg，腹腔注射）對(duì)小鼠進(jìn)行麻醉。麻醉滿意后，將記錄電極置于小鼠兩側(cè)耳廓前緣連線中點(diǎn)皮下，參考電極置于測(cè)試耳耳垂，接地電極置于對(duì)側(cè)耳耳垂，測(cè)試耳機(jī)距外耳道口約0.5cm，檢測(cè)小鼠雙耳的ABR閾值。實(shí)驗(yàn)采用短聲（Click）和短純音（Toneburst，Rise/Fall time:1 msec；Duration:4 msec）作為刺激聲，帶通濾波為300～3000 Hz，疊加次數(shù)為1024次，掃描時(shí)間10ms。刺激強(qiáng)度自90dBL SPL開(kāi)始，以10dBL逐漸遞減，直至檢測(cè)不出重復(fù)的ABR波形，再向上增強(qiáng)5dBL，直至能檢測(cè)出重復(fù)的ABR波形，此刺激聲強(qiáng)度即為小鼠的聽(tīng)閾。

1.3耳蝸Corti器標(biāo)本制備

頸椎脫臼法處死小鼠，迅速將其斷頭，快速取出耳蝸，將小鼠耳蝸放人盛有4%多聚甲醛溶液的培養(yǎng)皿中。在解剖顯微鏡下，用細(xì)針在蝸?lái)斻@孔，并開(kāi)放圓窗和卵圓窗。用4%多聚甲醛溶液自蝸?lái)斶M(jìn)行灌流，沖出淋巴液。將已灌流的耳蝸標(biāo)本置于4%多聚甲醛溶液中繼續(xù)固定，4℃冰箱過(guò)夜。取出標(biāo)本置于10%乙二胺四乙酸（EDTA，北京化工廠）溶液中脫鈣

在車間排放方面，目前的管理過(guò)于嚴(yán)格，相關(guān)部門要求，在汽車啟動(dòng)狀態(tài)下，需要對(duì)汽車尾氣進(jìn)行處理，但其實(shí)即使汽車不在修理廠內(nèi)，在路上行駛，尾氣排放也隨時(shí)都在發(fā)生。

1.4免疫熒光染色

將分離好的基底膜置于0.5%Triton X-100中30 min，PBS沖洗3次，含5%山羊血清、2% BSA(bovine serum albumin,牛血清白蛋白)的PBS封閉液阻斷非特異性位點(diǎn)2 h，羊抗鼠Ctbp2 (E-16)抗體(1 :200,SANTA CRUZ) 4℃過(guò)夜，PBS沖洗3次；?？寡騃gG FITC(1:100,SANTA CRUZ)，37℃避光染色40min，PBS沖洗3次，蒸餾水沖洗1次。最后用Dapi染色液(SANTA CRUZ)避光染色15min，再用PBS溶液漂洗2遍，5min/遍。解剖顯微鏡下將基底膜標(biāo)本平鋪于載玻片上，甘油封片。

1.5激光共聚焦顯微鏡成像及突觸標(biāo)記物數(shù)量計(jì)數(shù)

激光共聚焦顯微鏡型號(hào)為：Leica TCS SP2 AOBS,激發(fā)光波長(zhǎng)為488 nm和543 nm，100×油浸物鏡下觀察，并局部數(shù)字放大2倍。對(duì)所觀察區(qū)域的內(nèi)毛細(xì)胞進(jìn)行序列掃描，掃描層距設(shè)定為0.2μm。本實(shí)驗(yàn)中，被標(biāo)記的突觸前特異蛋白R(shí)IBEYE/CtBP2因使用FITC而顯示綠色熒光.序列掃描始于熒光色對(duì)出現(xiàn),止于熒光色對(duì)消失。采集二維圖像,每一組序列圖像文件置于一個(gè)文件夾內(nèi),并按序號(hào)排列。對(duì)10條耳蝸基底膜的頂回進(jìn)行序列掃描,每個(gè)基底膜掃描3個(gè)視野(頂、中、底各1個(gè)視野)，共生成10個(gè)序列文件。

1.6應(yīng)用3DS MAX進(jìn)行三維建模

在3DS MAX 8中的頂視窗口中按序列掃描時(shí)由上至下的順序調(diào)入采集的二維圖像做為視口背景.先調(diào)入第一幅二維圖像,在出現(xiàn)綠色熒光的位置畫球體作為標(biāo)記.再調(diào)入下一幅,如果出現(xiàn)綠色熒光的位置與上一幅相同,不做標(biāo)記,認(rèn)為是同一個(gè)突觸部位;如果在其他位置上出現(xiàn)綠色熒光,則表示在這一層面上有新的突觸出現(xiàn),再用球體做出標(biāo)記.以此類推,最后得出這種突觸標(biāo)記物數(shù)量。依次對(duì)各個(gè)序列文件中的每幅二維圖象中的熒光位置進(jìn)行標(biāo)記，最后完成對(duì)10個(gè)序列文件內(nèi)全部二維圖片的掃描和標(biāo)記，剔除其中重復(fù)標(biāo)記的熒光部位，之后對(duì)于所有被標(biāo)記的綠色熒光球體進(jìn)行數(shù)量計(jì)數(shù)，得出總計(jì)突觸標(biāo)記物數(shù)量。突觸標(biāo)記物總數(shù)除以綠色標(biāo)記物所在區(qū)域中的全部?jī)?nèi)毛細(xì)胞數(shù)量，即得到每個(gè)內(nèi)毛細(xì)胞上突觸標(biāo)記物的數(shù)量(以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差顯示)。

1.7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

本實(shí)驗(yàn)中，聽(tīng)性腦干反應(yīng)(ABR)閾值和突觸標(biāo)記物數(shù)量以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±SD)表示，并采用one way ANOVA檢驗(yàn)比較組間差異，兩兩比較等用SNK法。所有數(shù)據(jù)均輸入SPSS18．0軟件統(tǒng)計(jì)，P < 0.05表明組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1衰老過(guò)程中的聽(tīng)力損失

本研究中，首先檢測(cè)了C 57小鼠在衰老過(guò)程中聽(tīng)力損失的情況。在本研究的Click檢測(cè)中，1月組小鼠為9.58±2.85，2月組小鼠為10.34±3.05，4月組小鼠為24.12±4.14，6個(gè)月組小鼠為37.65± 5.51，12個(gè)月小鼠組為72.18±6.80。組間差異分析顯示，1，2個(gè)月鼠齡組間無(wú)顯著性差異（圖1，P > 0.05）。然而對(duì)鼠齡為4，6，和12個(gè)月的閾值檢測(cè)卻顯示出了明顯不同的結(jié)果。閾值在4個(gè)月小鼠中出現(xiàn)顯著升高，在6個(gè)月和12個(gè)月小鼠中閾值繼續(xù)抬升，統(tǒng)計(jì)顯示，以上三組均與4月鼠齡之前各組存在顯著性差異(P < 0.05)。而且6，9和12月三組之間也存在顯著性差異(P < 0.05)。說(shuō)明在衰老過(guò)程中，C57小鼠的ABR(Click)閾值是處于不斷升高的狀態(tài)下的。

圖1　鼠齡分別為1,2,4,6,和12個(gè)月C57小鼠的Click閾值Fig.1 ABR threshold (Click) at the age of 1,2,4,6,and12 months in C57BL/6J mice (Mean±SD)

同樣地，還比較了各頻率上不同鼠齡小鼠的聽(tīng)力水平。發(fā)現(xiàn)C57BL/6J小鼠在鼠齡分別為1個(gè)月和2個(gè)月時(shí)，即使在不同頻率上也沒(méi)有表現(xiàn)出具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的閾值變化（見(jiàn)表1）。而對(duì)于鼠齡分別為4個(gè)月、6個(gè)月和12個(gè)月的小鼠來(lái)說(shuō)，tone brust的檢測(cè)結(jié)果則顯示出了明顯的變化：即越是處在高頻區(qū)域中（底回區(qū)域），小鼠聽(tīng)力閾值抬升的幅度越大。比如在本研究中，6個(gè)月鼠齡的小鼠聽(tīng)閾值分別為56.53±7.11 (8KHz)和66.34±8.36 ( 16KHz)。而12個(gè)月鼠齡小鼠分別為77.26±8.16 (8KHz)和81.44±9.22 (16KHz)，與2個(gè)月鼠齡組比具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P < 0.001）。

表1　C57小鼠在衰老過(guò)程中聽(tīng)力-頻率變化(均值±標(biāo)準(zhǔn)差)Tab.1 The alterations of hearing threshold across frequency in the duration of aging (Mean±SD)

More significant elevations of hearing threshold have been found at the region of high-frequency.The initial elevation has been identified at the mice of 4 months old.

2.2衰老過(guò)程中帶狀突觸數(shù)量的變化

為了探討聽(tīng)力、頻率和帶狀突觸的突觸前標(biāo)記物數(shù)量之間的變化關(guān)系，利用3D max軟件結(jié)合免疫熒光標(biāo)記方法計(jì)數(shù)不同鼠齡C57小鼠耳蝸不同回段上的突觸前標(biāo)記物數(shù)量（圖2，RYBEYE/CtBP2）。發(fā)現(xiàn)這個(gè)突觸前標(biāo)記物的數(shù)量變化和小鼠ABR (tone brust)閾值的變化基本遵循一致的規(guī)律：即在大鼠齡小鼠耳蝸的高頻區(qū)域出現(xiàn)了標(biāo)記物數(shù)量上的最顯著下降，而在低頻部位數(shù)量變化的幅度則要明顯平緩（圖2）。相比較而言，即使是較高鼠齡的小鼠，其低頻區(qū)域的突觸標(biāo)記物數(shù)量變化也要相對(duì)和緩（圖2）。

圖2　C57小鼠耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞突觸前特異蛋白R(shí)IBEYE的免疫熒光標(biāo)記.Fig.2 Immunostaining labeling for specific pre-synapse protein (RIBEYE) in the cochlear IHC ribbon synapses in C57BL/6J mice.

Upper panel shows immunostaining evidence for specific pre-synaptic protein (RIBEYE/CtBP2) in cochlear ribbon synapses below inner hair cells in the mice (2 months old),from left to right is apex,middle,and basal turn,no significant reduction of synaptic labeling has been found at this panel.Lower panel reveals immunostaining results in the older mice (6 months old),a significant loss of synaptic ribbons is identified at the basal turn.Blue indicates DAPI staining identifying neclui; Green spot indicates specific pre-synapse protein (RIBEYE),white arrow indicated.Scale bar=5um.

本研究中計(jì)數(shù)了鼠齡1個(gè)月到12個(gè)月各回段的突觸標(biāo)記物數(shù)量，結(jié)果顯示在幼-青年小鼠中，其耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞下的突觸標(biāo)記物數(shù)量比較多，但是在鼠齡小于6個(gè)月時(shí)，各組小鼠的突觸標(biāo)記物數(shù)量變化不明顯(P>0.05，表3)。隨著C57小鼠的鼠齡增大（> 6個(gè)月），突觸標(biāo)記物數(shù)量出現(xiàn)了下降(P<0.05，表3)，到鼠齡為12個(gè)月大小時(shí)，突觸標(biāo)記物數(shù)量的減少變得明顯(P<0.05，表3)，而且這種數(shù)量上的減少在底回（高頻區(qū)域）表現(xiàn)的更加顯著(P < 0.01，表3)。

表2　衰老過(guò)程中C57小鼠內(nèi)毛細(xì)胞帶狀突觸前標(biāo)記物在各頻率上的數(shù)量分布(單位:每個(gè)內(nèi)毛細(xì)胞)Tab.2 The distributions of cochlear ribbon synapse across frequency in C57BL/6J mice during aging (per IHC).

There are no significant differences among the mice of 1,2,and 4 months age.The reduction of cochlear ribbon synapse has been firstly identified at the mice of 6 months age.Significant loss of ribbon synapses is found at the mice of 12 months age,P<0.05.The maximal reduction of cochlear ribbon synapses is identified at the region of basal turn compared with apex and middle turns,P<0.01.

3　討論

本研究結(jié)果表明，伴隨著小鼠的衰老過(guò)程，其ABR聽(tīng)閾值也相應(yīng)地升高。而且，在耳蝸的高頻區(qū)域（8-16kHz），小鼠的聽(tīng)閾值更是呈現(xiàn)出了快速抬升的趨勢(shì)。同樣，計(jì)數(shù)同一過(guò)程中的突觸前標(biāo)記物數(shù)量(RIBEYE/CtBP2)，發(fā)現(xiàn)了和聽(tīng)力變化呼應(yīng)的變化趨勢(shì)：即6個(gè)月之后的小鼠各個(gè)頻段上的標(biāo)記物數(shù)量均出現(xiàn)了下降，在高頻區(qū)（8-16kHz）標(biāo)記物數(shù)量下降得更加明顯。而且這種趨勢(shì)隨著鼠齡的增長(zhǎng)變得越發(fā)明顯。

先前的研究都證實(shí)了隨著年齡的增長(zhǎng)，小鼠內(nèi)外毛細(xì)胞都會(huì)出現(xiàn)缺失的情況，這種毛細(xì)胞數(shù)量上的缺失在外毛細(xì)胞上表現(xiàn)得更加明顯，相比較而言，內(nèi)毛細(xì)胞的缺失在高齡小鼠身上才會(huì)有明顯的表現(xiàn)[2,3,13]。但是事實(shí)上內(nèi)毛細(xì)胞下傳入神經(jīng)突觸的減少在小鼠相對(duì)比較年輕時(shí)就發(fā)生了，試驗(yàn)的結(jié)果給這個(gè)結(jié)論提供了證據(jù)。之前的研究發(fā)現(xiàn)，內(nèi)毛細(xì)胞傳入神經(jīng)突觸對(duì)于耳毒性刺激十分敏感，這種敏感性顯著高于耳蝸其它部件，比如外毛細(xì)胞、內(nèi)毛細(xì)胞、螺旋神經(jīng)等結(jié)構(gòu)[9]。其他學(xué)者在噪聲環(huán)境下研究這個(gè)突觸結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)中等強(qiáng)度的噪聲可以引起暫時(shí)性聽(tīng)閾變化，但是突觸的數(shù)量卻不能完全恢復(fù)[12,14]。也有研究發(fā)現(xiàn)，不僅聽(tīng)力的損害是可以恢復(fù)的，突觸標(biāo)記物數(shù)量似乎也有完全的恢復(fù)[8]。兩種條件類似的實(shí)驗(yàn)結(jié)果并不完全一致，可能的解釋目前主要來(lái)自于動(dòng)物的區(qū)別，前者的實(shí)驗(yàn)所應(yīng)有的動(dòng)物為小鼠[12]，后者的動(dòng)物為豚鼠[8]，同樣的聲音刺激在不同動(dòng)物耳蝸當(dāng)中所產(chǎn)生的影響可能存在差別。所使用的動(dòng)物是具有年齡相關(guān)性特點(diǎn)的C57小鼠，突觸數(shù)量和空間分布上的變化主要反應(yīng)老年性聽(tīng)力損害的一些特點(diǎn)。但是上述這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果至少有一個(gè)特點(diǎn)是共同的，即聽(tīng)力損害性因素，不論是耳毒性暴露、噪聲性暴露、或者是衰老性因素，耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞傳入神經(jīng)突觸都會(huì)首先感知上述因素的影響并最早做出適應(yīng)性改變。

目前同類研究中一個(gè)比較棘手的問(wèn)題是還沒(méi)有一種有效的檢測(cè)方法，來(lái)評(píng)估各種狀態(tài)下耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞傳入神經(jīng)突觸的功能。ABR檢測(cè)無(wú)疑不能準(zhǔn)確反映這個(gè)突觸功能的情況，目前有些研究通過(guò)檢測(cè)CAP的方法來(lái)估計(jì)這個(gè)突觸的功能狀況[14,15,16]，但是這個(gè)電位實(shí)際上是聽(tīng)神經(jīng)末梢和毛細(xì)胞之間的總和電位，這個(gè)電位并不能準(zhǔn)確代表耳蝸內(nèi)毛細(xì)胞傳入神經(jīng)突觸的電位值。有學(xué)者通過(guò)檢測(cè)聽(tīng)神經(jīng)束自發(fā)放電頻率來(lái)估計(jì)突觸的功能，具有一定的可操作性和合理性，但是仍然不是一種理想的檢測(cè)手段。未來(lái)的解決方法之一是對(duì)新生動(dòng)物的基底膜標(biāo)本進(jìn)行培養(yǎng)[17]，待培養(yǎng)的標(biāo)本狀態(tài)穩(wěn)定后檢測(cè)突觸后興奮電位或電流(EPSP&EPSC)，盡管有研究報(bào)道可以檢測(cè)到單個(gè)帶狀突觸的興奮性電位或電流[18,19,20]，然而我們?cè)趯?shí)際檢測(cè)中發(fā)現(xiàn)單個(gè)或少數(shù)突觸的電位值很小難以檢測(cè)。比較可行的方法是對(duì)多個(gè)內(nèi)毛細(xì)胞區(qū)域的突觸后興奮性后電位或電流值進(jìn)行檢測(cè)，以得到這個(gè)區(qū)域的突觸后總和電位或電流值。通過(guò)設(shè)置相同數(shù)量?jī)?nèi)毛細(xì)胞的對(duì)照區(qū)域，人為破壞內(nèi)毛細(xì)胞及突觸的方法來(lái)消除其它干擾因素，兩者相減得到比較準(zhǔn)確的突觸后電位或電流數(shù)值。然而檢測(cè)活體動(dòng)物的帶狀突觸功能目前看來(lái)依然是一個(gè)難以完成的任務(wù)，可能還需要進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間的探索或依賴于大的技術(shù)突破，就當(dāng)前情況而言，通過(guò)分析ABR I波的潛伏期或幅值，或者通過(guò)分析CAP幅值依然是一個(gè)既可行又有效的功能性評(píng)估手段。

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Time and frequency dependent changes of cochlear ribbon synapses in age-related hearing loss

WANG Chi1,LIU Ke2,HOU Kun2,SHI Lei3,YANG Shiming2,NIN Bo1
1Department of Otolaryngology Head and Neck surgery,Central Hospital of Xuzhou,Jiangsu Province,221009 2Department of Otolaryngology Head and Neck surgery,Institute of Otolaryngology,Chinese PLA General Hospital,Beijing,100853 3Department of Otolaryngology Head and Neck Surgery,First Affiliated Hospital of China Medical University,Shenyang,110001
Corresponding author:NING BoEmail:boxuzhou@126.com

【Abstract】Objective To study possible correlations between the number of cochlear ribbon synapses and elevation of ABR thresholds related to aging.Methods C57BL/6J mice were utilized to mimic age related hearing loss in this study.ABR threshold was examined at 1M,2M,4M,6M,and 12M respectively.Immunostaining combined with laser confocal microscopy was used to identify RIBEYE/CtBP2,a specific pre-synaptic component of cochlear ribbon synapses,and the number of labeling synaptic ribbons was calculated using the 3D max 8.0 software.Results ABR threshold elevation was first found after 4M (P<0.05),and continued to increase at 6M and 12M (P<0.05).Further,the most significant ABR threshold elevation at a given age was identified at high frequencies (P<0.01,8 and 16 kHz).Correspondingly,the reduction of labeling ribbon synapses was noticed along with ABR threshold shifts as the mice aged,also with more labeling synapses reduction in the high frequency regions (P<0.01,8 and 16 kHz).However,we did not find significant loss of inner hair cells in during the same aging period.Conclusion There is faithful correlation between hearing threshold shifts and reduction of labeling synaptic ribbons,with most reduction occurring in high frequency regions.This study shows that the loss of ribbon synapses may contribute to age-related hearing loss.

【Key words】Age-related hearing loss ; C57 mice; Cochlear ribbon synapse ; RIBEYE/CtBP2; Inner hair cell;

收稿日期：（2016-01-06）

通訊作者：寧博，Email :boxuzhou@126.com

作者簡(jiǎn)介：王馳，研究生，主治醫(yī)師，研究方向：耳鼻咽喉基礎(chǔ)與臨床

DOI:10.3969/j.issn.1672-2922.2016.01.007

【中圖分類號(hào)】R764.436

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1672-2922（2016）01-32-5