張巖　穆曉紅　孫文　吳麗麗　郭璇　許光遠(yuǎn)　李偉笠　姜月瀅　鄧?yán)颉『槊髡选~華

100078　北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院內(nèi)分泌科[張巖(博士研究生)、郭璇(博士研究生)、許光遠(yuǎn)(博士研究生)、姜月瀅(碩士研究生)、洪明昭(碩士研究生)、劉銅華]；北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)養(yǎng)生所(孫文、吳麗麗、劉銅華)；北京中醫(yī)藥大學(xué)研究生院(劉銅華)；北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院骨科[穆曉紅、李偉笠(碩士研究生)]；陜西中醫(yī)藥大學(xué)內(nèi)分泌科[鄧?yán)?碩士研究生)]

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·論著·

糖痹康對糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)II相代謝酶GCLc和GST pi蛋白與mRNA的影響

張巖穆曉紅孫文吳麗麗郭璇許光遠(yuǎn)李偉笠姜月瀅鄧?yán)蚝槊髡褎~華

100078北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院內(nèi)分泌科[張巖(博士研究生)、郭璇(博士研究生)、許光遠(yuǎn)(博士研究生)、姜月瀅(碩士研究生)、洪明昭(碩士研究生)、劉銅華]；北京中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)養(yǎng)生所(孫文、吳麗麗、劉銅華)；北京中醫(yī)藥大學(xué)研究生院(劉銅華)；北京中醫(yī)藥大學(xué)東直門醫(yī)院骨科[穆曉紅、李偉笠(碩士研究生)]；陜西中醫(yī)藥大學(xué)內(nèi)分泌科[鄧?yán)?碩士研究生)]

【摘要】目的觀察糖痹康對糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)II相代謝酶谷氨酸半胱氨酸連接酶亞基(glutamate-cysteine ligase catalytic subunit，GCLc)和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione s-transferase，GST) pi蛋白與mRNA的影響，探討糖痹康對糖尿病周圍神經(jīng)病變大鼠坐骨神經(jīng)保護作用機制。方法雄性SD大鼠，高脂飼料與小劑量鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ)聯(lián)合誘發(fā)糖尿病大鼠模型，模型成功后將糖尿病大鼠隨機分為5組：模型組、α-硫辛酸(alpha lipoic acid ，ALA)組(0.0268g/(kg·d)，糖痹康高(2.5g/kg)、中(1.25g/kg)、低(0.625g/kg)劑量組，每組10只，另將雄性SD大鼠10只設(shè)為正常組。治療12周后測大鼠右側(cè)坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度；Western blot檢測大鼠坐骨神經(jīng)中GCLc和GST pi蛋白的表達(dá)；實時熒光定量PCR檢測大鼠坐骨神經(jīng)中GCLc和GST pi mRNA的表達(dá)。結(jié)果與模型組相比，12周后ALA組、糖痹康高、中劑量組大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度明顯升高(P<0.05)；ALA組、糖痹康高、中劑量組GCLc和GST pi蛋白及mRNA表達(dá)均明顯高于模型組(P<0.05)。結(jié)論糖痹康可通過誘導(dǎo)Ⅱ相代謝酶GCLc和GST pi改善糖尿病大鼠坐骨神經(jīng)損傷。

【關(guān)鍵詞】糖痹康；糖尿病周圍神經(jīng)病變；坐骨神經(jīng)；Ⅱ相代謝酶；G谷氨酸半胱氨酸連接酶亞基和谷胱甘肽-s轉(zhuǎn)移酶Pi

糖尿病周圍神經(jīng)病變(diabetic peripheral neuropathy，DPN)是糖尿病(diabetes mellitus，DM)重要并發(fā)癥之一，隨著DM患病率及病程的延長，DPN發(fā)病率呈上升趨勢。在對全國住院DM患者并發(fā)癥及其相關(guān)危險因素10年回顧性調(diào)查分析顯示，中國DPN的發(fā)生率達(dá)60.3%[1]，而DPN是DM患者并發(fā)足部潰瘍，最終導(dǎo)致截肢的主要原因[2-3]，早期干預(yù)DPN高?；颊呖捎行Ы档吞悄虿∽悴繚儼l(fā)生率和截肢率[4]。而中醫(yī)藥在DPN的防治方面積累了豐富的經(jīng)驗，但其作用機制尚未完全闡明。氧化應(yīng)激在糖尿病慢性并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展過程中處于核心地位[5]，因此氧化/抗氧化失調(diào)是DPN發(fā)生的重要機制。II相代謝酶(phase II enzymes)又稱II相抗氧化酶(phase II antioxidant enzymes)，包括谷氨酸半胱氨酸連接酶(glutamate-cysteine ligase，GCL)、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(glutathione s-transferase，GST)等，能夠保護機體免受毒性物質(zhì)及某些活性物質(zhì)的侵害，因此誘導(dǎo)其亞基(glutamate-cysteine ligase catalytic subunit，GCLc)和GST pi的表達(dá)，能夠有效對抗有害物質(zhì)侵害導(dǎo)致的相關(guān)疾病[6]。

前期研究表明，中藥復(fù)方糖痹康具有抗氧化應(yīng)激，保護DPN大鼠坐骨神經(jīng)的作用[7]。本實驗在前期研究基礎(chǔ)上，觀察糖痹康對DPN大鼠II相代謝酶GCLc和GST pi蛋白與mRNA的影響，探討糖痹康對DPN大鼠坐骨神經(jīng)保護作用機制。

1材料與方法

1.1實驗動物

SD大鼠，4周齡，雄性，60只，體質(zhì)量(100±20)g，由北京維通利華動物實驗中心提供，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(京)2004-0009。

1.2藥品制備

糖痹康(黃芪15 g、女貞子10 g、桂枝9 g、赤芍9 g、黃芩5 g、黃連3 g、水蛭1 g、雞血藤15 g、醋制延胡索5 g)由北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院提供；α-硫辛酸(alpha-lipoic acid，ALA)，由德國史達(dá)德大藥廠提供，進(jìn)口藥品注冊證：H20110104。

1.3試劑及儀器

高脂飼料，購自北京科奧協(xié)力飼料有限公司；鏈脲佐菌素(streptozotocin，STZ，美國，sigma)；羅氏血糖儀(羅氏，ACCU-CHEK)；BL-420S 生物機能換能系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)；紫外分光光度計eppendorf(德國Biophotometer)；電泳后用半干轉(zhuǎn)電轉(zhuǎn)印儀(美國 Bio-Rad Trans-Blot SD)；PVDF膜上(德國，默克微孔)；一抗：兔來源的單克隆抗體GCLc(美國Abcam公司，貨號：ab190685，批號：GR175654-1)，兔來源的單克隆抗體GST pi(美國Abcam公司，貨號：ab138491，批號：GR100476-11)；二抗：辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，貨號：ZB-2301，批號：109525)；Trizol試劑盒(美國Invitrogen公司)；核酸紫外分光光度計(德國Biophotometer公司)；M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒(日本Takara公司)；PCR引物(生工生物工程(上海)有限公司)；Oligo(dT)(購自Takara公司，日本)；dNTP(日本Takara公司)；DNA Marker(日本Takara公司)；SYBR mix(瑞士Roche公司)；Real-Time PCR儀(美國ABI公司)

1.4模型建立與分組

雄性SD大鼠60只，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機選取10只作為正常組，予普通飼料喂養(yǎng)，余鼠給予高脂飼料連續(xù)喂養(yǎng)，4周后腹腔注射STZ 35 mg/kg造糖尿病大鼠模型。72小時后用羅氏血糖儀測大鼠尾尖血隨機血糖，將兩次隨機血糖水平>16.7 mmol/L且血糖水平穩(wěn)定3天者視為造模成功，按體質(zhì)量和血糖水平隨機分為模型組、ALA組、糖痹康高、中、低劑量組，每組各10只，其中ALA 0.0268 g/(kg·d)組腹腔注射，糖痹康高2.5 g/(kg·d)、中1.25 g/(kg·d)、低0.625 g/(kg·d)劑量組灌胃，正常組和模型組給予同體積生理鹽水。實驗期間明暗各12小時，大鼠自由攝食攝水，連續(xù)治療12周。

1.5血糖檢測

分別在第0周和12周末測試大鼠尾尖血，觀察隨機血糖的變化。

表1　引物序列

1.6神經(jīng)電生理的測定

應(yīng)用BL-420S 生物機能換能系統(tǒng)，采用雙通道法，分別測定SD大鼠右側(cè)坐骨神經(jīng)運動神經(jīng)(motor nerve conduction velocity，MNCV)和感覺神經(jīng)傳導(dǎo)速度(sensory nerve conduction velocity，SNCV)。麻醉后的大鼠置于恒溫墊上俯臥位固定，暴露大鼠右側(cè)坐骨神經(jīng)，將暴露的神經(jīng)輕輕掛在包含兩組刺激電極和記錄電極的電極鉤上，神經(jīng)表面滴加37℃預(yù)熱的石蠟油使神經(jīng)保持在濕潤溫暖的環(huán)境中。參數(shù)設(shè)置：細(xì)電壓，單刺激，延時100 ms，波寬1 ms，刺激強度1 v。測量方法：(1)MNCV：將電極掛鉤通道1刺激電極的一端置于神經(jīng)近端，通道2記錄電極的一端置于神經(jīng)遠(yuǎn)端，刺激后記錄誘發(fā)動作電位，施予刺激到出現(xiàn)誘發(fā)電位的時間稱為潛伏期，刺激電極起始點與記錄電極起始點間的長度為距離，本實驗采用雙通道記錄法，故以兩通道動作電位出現(xiàn)峰位的時間差為潛伏期值，以兩通道刺激電極間距離0.8 cm為刺激電極起始點與記錄電極起始點間長度值。代入公式：MNCV=刺激電極起始點與記錄電極起始點間的長度(m)/潛伏期(s)。(2)SNCV：交換刺激電極與記錄電極的位置，使之與測定MNCV的位置相反。SNCV 的計算方法同MNCV。

1.7Western Blot 測定GCLc、GST pi的蛋白表達(dá)

提取大鼠坐骨神經(jīng)總蛋白，分別以10%和12% SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白，轉(zhuǎn)膜、封閉，分別加入一抗GCLc(1∶2000)和GST pi(1∶2000)，孵育，4℃過夜。次日加入二抗(1∶10000)，顯影、定影。以GADPH為內(nèi)參。用IPP軟件對掃描圖象的目的條帶進(jìn)行灰度分析。

1.8real-time PCR測定GCLc和GST pi的mRNA表達(dá)

Trizol法提取坐骨神經(jīng)總RNA，Real-Time PCR 檢測GCLc和GST pi的mRNA表達(dá)水平。用2-ΔΔCT計算各個樣本目的基因的表達(dá)變化。

1.9統(tǒng)計學(xué)方法

2結(jié)果

2.1糖痹康改善SD大鼠隨機血糖

與正常組相比較，治療前、后各組大鼠隨機血糖水平均顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，治療后，ALA組、糖痹康高、中劑量組大鼠血糖顯著降低(P<0.01或P<0.05)。見表2。

表2　各組大鼠不同時期隨機血糖　

注： 與正常組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.05，cP<0.01

2.2糖痹康改善SD大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度

與正常組比較，治療后，模型組大鼠MNCV和SNCV顯著下降(P<0.01)，ALA組，糖痹康高劑量組大鼠MNCV和SNCV無明顯下降(P>0.05)；與模型組比較，ALA組，糖痹康高、中劑量組大鼠MNCV和SNCV明顯升高(P<0.01或P<0.05)，糖痹康低劑量組無明顯變化(P>0.05)。見表3。

表3　各組大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度比較　

注： 與正常組比較，aP<0.05，bP<0.01；與模型組比較，cP<0.05，

dP<0.01

2.3糖痹康對GCLc和GST pi蛋白表達(dá)的影響

與正常組相比較，各糖尿病組GCLc蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，ALA組、糖痹康高、中劑量組大鼠坐骨神經(jīng)GCLc蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.01或P<0.05)，糖痹康低劑量組大鼠坐骨神經(jīng)GCLc蛋白表達(dá)與模型組比較無顯著差異(P>0.05)。見圖1，表4。

與正常組比較，各糖尿病組GST pi蛋白表達(dá)顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，ALA組、糖痹康高、中劑量組大鼠坐骨神經(jīng)GST pi蛋白表達(dá)明顯升高(P<0.01或P<0.05)，糖痹康低劑量組大鼠坐骨神經(jīng)GST pi蛋白表達(dá)與模型組比較無顯著差異(P>0.05)。

A.正常組　B.模型組　C.ALA組

組別GCLcGSTpi正常組1.00±0.001.00±0.00模型組0.26±0.04a0.30±0.09aALA組0.51±0.05ac0.57±0.07ac糖痹康高劑量組0.48±0.08ac0.78±0.10ac糖痹康中劑量組0.37±0.11ab0.47±0.10ab糖痹康低劑量組0.24±0.07a0.40±0.09a

注： 與正常組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.05，cP<0.01

2.4糖痹康對GCLc和GST pi的mRNA表達(dá)的影響

與正常組比較，模型組、糖痹康中、低劑量組GCLc的mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.01或P<0.05)；與模型組比較，ALA組、糖痹康高、中劑量組大鼠坐骨神經(jīng)GCLc的mRNA表達(dá)顯著升高(P<0.01或P<0.05)。低劑量組坐骨神經(jīng)GCLc的mRNA表達(dá)升高不明顯(P>0.05)。

與正常組比較，各組GST pi的mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，ALA組、糖痹康高、中劑量組大鼠坐骨神經(jīng)GST pi的mRNA表達(dá)明顯升高(P<0.01或P<0.05)。低劑量組坐骨神經(jīng)GST pi的mRNA表達(dá)升高不明顯(P>0.05)。

表5　各組大鼠坐骨神經(jīng)mRNA表達(dá)

注： 與正常組比較，aP<0.05，bP<0.01；與模型組比較，cP<0.05，

dP<0.01

3討論

DPN是DM慢性并發(fā)癥之一，其發(fā)病率高，嚴(yán)重威脅著患者的生存質(zhì)量及壽命，給家庭和社會造成了巨大的經(jīng)濟負(fù)擔(dān)，因其發(fā)病機制復(fù)雜，是多種因素共同作用的結(jié)果，因此其治療一直成為研究的熱點和難點[8]。

中醫(yī)藥治療DPN有獨特優(yōu)勢，其全方位、多靶點的中醫(yī)藥治療方案臨床效果顯著[10-12]，但其作用機制尚未完全闡明。糖痹康(已獲國家專利：ZL200810167551.1)在《金匱要略·血痹虛勞》黃芪桂枝五物湯的基礎(chǔ)上加減化裁，臨床療效顯著，前期研究表明[7]，糖痹康能顯著升高DPN大鼠血清中消除過氧化物的超氧化物岐化酶和分解過氧化物的谷胱甘肽過氧化物酶水平，從而改善坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度。

應(yīng)激蛋白的上調(diào)是機體對抗不利條件的一種普遍保護機制，這其中包括氧化應(yīng)激反應(yīng)。GCLc和GST pi是II相解毒酶，具有神經(jīng)保護作用[9-12]。GCLc是GSH的限速酶，是維持細(xì)胞內(nèi)GSH動態(tài)平衡的關(guān)鍵因素，而GSH在細(xì)胞防御氧化侵害和維護氧化還原動態(tài)平衡起重要作用，是保證細(xì)胞凋亡功能正常的重要酶[13]。GST催化谷胱甘肽與各種親電物質(zhì)結(jié)合并促進(jìn)其排泄，并可以去除機體內(nèi)過氧

(下轉(zhuǎn)本期第302頁)

Effect ofTangbikangon the protein and mRNA of Phase II metabolizing enzymes of GCLc and GST pi of sciatic nerve in diabetic rats

ZHANGYan，MUXiao-hong，SUWen，etal.DepartmentofEndocrinology，DongfangHospitalAffiliatedtoBeijingUniversityofChineseMedicine，Beijing100078，China．

【Abstract】ObjectiveTo observe the effect of Tangbikang(TBK) on the protein and mRNA of Phase II metabolizing enzymes of GCLc and GST pi of sciatic nerve in diabetic rats to investigate the protection of the sciatic nerve in rats with diabetic peripheral neuropathy. MethodsMale SD rats were selected for research，high fat diet combined with low dose of streptozotocin(STZ)to induced diabetic model, and the rats were randomly divided into 5 groups：model group，alpha-lipoic acid (ALA) group，TBK high dose group(2.5g/kg)，medium dose group(1.25g/kg)and low dose group(0.625g/kg)，10 rats in each group and another 10 male SD rats were put into normal group. After 12 weeks treatment，the right sciatic nerve conduction velocity was measured by direct method，and the protein and mRNA of GST pi and GCLc were detected by Western blot and real-time PCR. ResultsAfter 12 weeks，the sciatic nerve conduction velocity in the ALA group，TBK high and medium dose groups was significantly higher than that in the model group(P<0.05). The expression of GST pi and GCLc protein and mRNA in the ALA group, TBK high and medium dose groups were significantly higher than those in the model group. ConclusionTBK can improve the sciatic nerve injury of DPN rats by inducing Phase II metabolizing enzymes of GCLc and GST pi of sciatic nerve in diabetic rats.

【Key words】Tang Bi Kang;Diabetic peripheral neuropathy;Sciatic nerve;Phase II drug metabolizing enzymes;GCLc and GST pi

Corresponding author：LIU Tong-hua， E-mail： thliu@vip.163.com

【中圖分類號】R587.2

【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A

doi：10.3969/j.issn.1674-1749.2016.03.007

作者簡介：張巖(1985- )，女，2013級在讀博士研究生。研究方向：糖尿病及其并發(fā)癥臨床及實驗研究。E-mail：lylu111@126.com通訊作者： 劉銅華( 1963- )，博士，博士后，教授，主任醫(yī)師，博士生導(dǎo)師。研究方向：糖尿病及其并發(fā)癥臨床及實驗研究。E-mail：thliu@vip.163.com

基金項目：國家自然科學(xué)基金( 81373587)；教育部中醫(yī)養(yǎng)生學(xué)重點實驗室，北京市中醫(yī)養(yǎng)生學(xué)重點實驗室