袁夢(mèng)思++李建文++劉夢(mèng)華++孫文秀

摘要：測(cè)定了1株不動(dòng)桿菌A2發(fā)酵液對(duì)水稻紋枯病菌的抑菌率、菌絲的生長(zhǎng)及菌核萌發(fā)和形成時(shí)間的影響。結(jié)果表明，不動(dòng)桿菌A2發(fā)酵液對(duì)水稻紋枯病菌具有一定的抑制作用，抑制率達(dá)82.6%；導(dǎo)致病原菌菌絲畸形，原生質(zhì)外漏；經(jīng)不動(dòng)桿菌A2處理后降低了菌核的萌發(fā)指數(shù)，菌核萌發(fā)指數(shù)為38.2%；明顯延遲了菌核的形成時(shí)間。

關(guān)鍵詞：不動(dòng)桿菌；發(fā)酵液；水稻紋枯病；病菌；抑菌作用

中圖分類(lèi)號(hào)： S435.111.4+2文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2016）02-0164-02

收稿日期：2015-03-27

基金項(xiàng)目：湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心開(kāi)放基金（編號(hào)：2015MS021）。

作者簡(jiǎn)介：袁夢(mèng)思（1989—），男，湖北黃岡人，碩士研究生，研究方向?yàn)榧?xì)胞生物學(xué)。E-mail：YMS20151001@163.com。

通信作者：孫文秀，博士，副教授，主要從事植物病害的生物防治。E-mail：wenxiusun@163.com。水稻紋枯病是一種世界范圍內(nèi)的土傳真菌病害，為水稻三大病害之一，給水稻的生產(chǎn)造成了巨大經(jīng)濟(jì)損失。水稻紋枯病由立枯絲核菌（Rhizoctonia solani Kühn）引起，該病原菌寄主范圍廣，致病力強(qiáng)，引起紋枯、立枯等癥狀。與傳統(tǒng)的化學(xué)防治、農(nóng)業(yè)防治等方法相比，利用微生物及其代謝產(chǎn)物來(lái)防治水稻紋枯病具有高效、安全、低毒、殘留少、不產(chǎn)生抗藥性等優(yōu)點(diǎn)。迄今為止，發(fā)現(xiàn)了包括木霉菌屬[1-2]、青霉菌屬[3]、內(nèi)生真菌[4]、芽孢桿菌屬[5]、假單胞菌屬[6]、內(nèi)生細(xì)菌[7]及鏈霉菌屬[8-9]等微生物，對(duì)水稻紋枯病具有較好的防治效果。尋找新型微生物源農(nóng)藥防治植物病害具有很大的應(yīng)用前景，因而篩選更高抑菌活性的微生物對(duì)水稻紋枯病的防治有著重要的實(shí)踐意義。本研究探討了從土壤中分離到的1株不動(dòng)桿菌（Acinetobacter sp.）A2對(duì)水稻紋枯病菌的抑制作用，為明確該菌的發(fā)酵液對(duì)水稻紋枯病的防治應(yīng)用價(jià)值和今后開(kāi)發(fā)安全的新型生物農(nóng)藥提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1材料與方法

1.1供試菌株

不動(dòng)桿菌A2分離自湖北地區(qū)芝麻田土壤；水稻紋枯病菌（Rhizoctonia solani）由長(zhǎng)江大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室分離提供。

1.2培養(yǎng)基

水稻紋枯病菌培養(yǎng)用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）；不動(dòng)桿菌A2發(fā)酵用牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基（NA）和牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)液（NB）。

1.3不動(dòng)桿菌發(fā)酵液的制備

采用搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)法。將不動(dòng)桿菌A2在NA培養(yǎng)基上劃線后，挑取單菌落于5 mL NB液體培養(yǎng)基中，28 ℃，120 r/min，過(guò)夜培養(yǎng)。取菌液1 mL接入裝有50 mL NB培養(yǎng)液的250 mL三角瓶中，振蕩培養(yǎng)48 h（28 ℃，120 r/min）。將不動(dòng)桿菌A2發(fā)酵液在10 000 r/min、4 ℃條件下離心20 min，取上清液用細(xì)菌過(guò)濾器（濾膜孔徑0.22 μm）除菌，即得無(wú)菌濾液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4不動(dòng)桿菌發(fā)酵液對(duì)水稻紋枯病菌的抑制作用

取1 mL不動(dòng)桿菌A2無(wú)菌濾液與20 mL PDA培養(yǎng)基混勻，倒入培養(yǎng)皿，制備平板。將直徑為5 mm的水稻紋枯病菌菌塊接種于平板中央，28 ℃培養(yǎng)72 h，以不加無(wú)菌濾液的培養(yǎng)基培養(yǎng)的水稻紋枯病菌為對(duì)照。此外，將100 μL不動(dòng)桿菌A2的菌液涂布于PDA平板，再接種水稻紋枯病菌菌塊培養(yǎng)。采用垂直十字法測(cè)量菌落直徑，按如下公式計(jì)算抑菌率：

抑菌率=對(duì)照菌落半徑-處理菌落半徑對(duì)照菌落半徑×100%。

1.5不動(dòng)桿菌發(fā)酵液對(duì)水稻紋枯病菌菌絲的抑制作用

將水稻紋枯病菌接種在PDA液體培養(yǎng)基中，28 ℃、90 r/min 培養(yǎng)48 h，挑取菌絲球于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，用不動(dòng)桿菌A2的發(fā)酵液處理24 h，取菌絲做玻片，在倒置顯微鏡下觀察，以無(wú)菌水處理為對(duì)照，每處理重復(fù)3次。

1.6不動(dòng)桿菌發(fā)酵液對(duì)水稻紋枯病菌菌核的影響

把滅菌的PDA培養(yǎng)基滴于無(wú)菌載玻片上，使之成一薄層，取出放在無(wú)菌培養(yǎng)皿內(nèi)并保濕。將大小相同的水稻紋枯病菌菌核放入不動(dòng)桿菌A2發(fā)酵液中處理1 h后取出，放在載玻片上，每張3粒，28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，觀察菌核的萌發(fā)情況。無(wú)菌水處理為對(duì)照，每處理重復(fù)3次。菌絲萌發(fā)指數(shù)測(cè)定參考于艷敏等的方法[10]。

將同齡、直徑為5 mm的水稻紋枯病菌菌塊接種于含有不動(dòng)桿菌A2無(wú)菌濾液的PDA培養(yǎng)上，28 ℃培養(yǎng)，記錄菌核形成的時(shí)間。以PDA培養(yǎng)基培養(yǎng)的水稻紋枯病菌為對(duì)照。

2結(jié)果與分析

2.1不動(dòng)桿菌A2對(duì)水稻紋枯病菌的抑制作用

測(cè)定結(jié)果表明，不動(dòng)桿菌A2無(wú)菌濾液對(duì)水稻紋枯病菌具有一定的抑制作用，抑制率達(dá)82.6%；而A2菌液對(duì)水稻紋枯病菌的抑制率則為59.5%，表明不動(dòng)桿菌A2的抑菌成分主要存在于無(wú)菌濾液中（表1）。采用倒置顯微鏡觀察A2無(wú)菌濾液處理后的水稻紋枯病菌菌絲，發(fā)現(xiàn)菌絲彎曲，頂端膨大，原生質(zhì)外滲（圖1-a）；而正常的水稻紋枯病菌菌絲細(xì)長(zhǎng)，原生質(zhì)均勻，節(jié)間距大（圖1-b）。由此可見(jiàn)，不動(dòng)桿菌A2對(duì)

水稻紋枯病菌具有明顯的抑制作用。

2.2不動(dòng)桿菌A2對(duì)水稻紋枯病菌菌核的影響

在光學(xué)顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，用不動(dòng)桿菌A2發(fā)酵液處理水稻紋枯病菌菌核后，菌核都能萌發(fā)，菌絲萌發(fā)指數(shù)為 38.2%，而用無(wú)菌水處理后的菌核菌絲萌發(fā)指數(shù)是76.7%，表明不動(dòng)桿菌A2對(duì)水稻紋枯病菌的菌核萌發(fā)具有明顯的抑制作用。此外，在含有不動(dòng)桿菌A2無(wú)菌濾液的培養(yǎng)基上，水稻紋枯病菌菌核形成的時(shí)間大大延長(zhǎng)，比對(duì)照延遲了近72 h（表2）。

3討論

水稻紋枯病是典型的土傳真菌病害，以菌核形式越冬并作為來(lái)年病害發(fā)生的侵染源，給病害的有效防治造成了很大困難。目前，主要采用井岡霉素等化學(xué)藥劑防治水稻紋枯病，但長(zhǎng)期單一使用井岡霉素導(dǎo)致水稻紋枯病菌易產(chǎn)生抗藥性，且嚴(yán)重污染環(huán)境。因此，有必要采取生物防治的措施來(lái)控制水稻紋枯病的發(fā)生，尋找新型的微生物資源也成為一種必然。在前期的研究中，從湖北地區(qū)的芝麻田土壤中分離到了幾株不動(dòng)桿菌，并發(fā)現(xiàn)其對(duì)水稻紋枯病菌具有一定的拮抗作用。

不動(dòng)桿菌廣泛分布于外界環(huán)境中，主要存在于水體和土壤中，是一類(lèi)不發(fā)酵糖類(lèi)、氧化酶陰性的革蘭氏陰性菌。利用不動(dòng)桿菌的代謝產(chǎn)物進(jìn)行植物病害防治，與此相關(guān)的研究報(bào)道較少[11-12]。藺經(jīng)等[13-14]曾采用從樟樹(shù)中分離的鮑曼不動(dòng)桿菌對(duì)梨樹(shù)的主要病害進(jìn)行了防治，發(fā)現(xiàn)其發(fā)酵液鮑曼菌素能夠抑制梨黑斑病、輪紋病和炭疽病等真菌性病害，起到了較好的防治作用。本試驗(yàn)結(jié)果表明，不動(dòng)桿菌A2的發(fā)酵液能夠有效抑制水稻紋枯病菌的生長(zhǎng)，造成菌絲的畸形，降低菌核的萌發(fā)指數(shù)，延遲菌核的形成時(shí)間，達(dá)到了一定的抑菌效果。所以在此基礎(chǔ)上，有必要深入研究不動(dòng)桿菌A2的作用機(jī)制，明確其在田間的防治效果，為研制推廣新的生防制劑及有效防治水稻紋枯病打下堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

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