董志剛,　劉政海,　李曉梅,　譚　偉,　王新平,　茹慧玲,　唐曉萍*

1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所, 山西 太谷 030815;

2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué), 山西 太谷 030801

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SSR標(biāo)記技術(shù)在葡萄品種鑒別及遺傳育種上的應(yīng)用

董志剛1§,劉政海2§,李曉梅1,譚偉1,王新平1,茹慧玲1,唐曉萍1*

1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹(shù)研究所, 山西 太谷 030815;

2.山西農(nóng)業(yè)大學(xué), 山西 太谷 030801

摘要：SSR標(biāo)記因其數(shù)量多、重復(fù)性好、出現(xiàn)頻率高和共顯性遺傳等優(yōu)點(diǎn)在植物的種質(zhì)資源品種鑒別、遺傳育種等方面得到廣泛應(yīng)用。簡(jiǎn)要介紹了SSR標(biāo)記在葡萄上的發(fā)展和葡萄遺傳多樣性分析、品種鑒定、DNA指紋圖譜構(gòu)建和遺傳育種等方面的應(yīng)用，并對(duì)SSR標(biāo)記未來(lái)在葡萄育種應(yīng)用的研究方向作出了展望。

關(guān)鍵詞：葡萄；SSR標(biāo)記；遺傳育種；遺傳多樣性

葡萄(Vitisvinifera)為葡萄科(Vitaceae)葡萄屬(Vitis)的多年生藤本植物，在全世界范圍內(nèi)廣泛栽培，其種植歷史久遠(yuǎn)，可以追溯到約8 000多年前[1]。葡萄在其進(jìn)化發(fā)展過(guò)程中形成了許多種群、品種群和變種群，且因其基因組雜合度高，不同種間以及品種間經(jīng)濟(jì)性狀、抗逆性狀等方面存在著極其豐富的變異，導(dǎo)致種質(zhì)資源鑒定分類(lèi)和抗性基因利用十分困難[2]。隨著生物技術(shù)的迅速發(fā)展，區(qū)別于以形態(tài)學(xué)標(biāo)記為主的葡萄種質(zhì)資源分類(lèi)，從分子水平對(duì)物種的親緣關(guān)系進(jìn)行分析更加直接準(zhǔn)確。

SSR標(biāo)記是一種基于PCR技術(shù)的DNA標(biāo)記方法，具有數(shù)量多、重復(fù)性好、出現(xiàn)頻率高和共顯性遺傳等優(yōu)點(diǎn)，目前，在EST數(shù)據(jù)庫(kù)的利用、系譜重建、品種鑒別及新品種保護(hù)等領(lǐng)域展示出巨大的發(fā)展?jié)摿?。在葡萄遺傳多樣性分析、品種鑒定、遺傳指紋圖譜構(gòu)建和葡萄育種等方面得到了較廣泛的應(yīng)用。本文綜述了SSR分子標(biāo)記在葡萄品種鑒別及遺傳育種方面的研究進(jìn)展，并對(duì)SSR在未來(lái)葡萄育種方面的應(yīng)用進(jìn)行了展望，以期為葡萄的品種鑒別和遺傳育種研究提供參考。

1不同SSR標(biāo)記技術(shù)在葡萄中的應(yīng)用

1.1EST-SSR分子標(biāo)記在葡萄中的應(yīng)用

近幾年隨著國(guó)內(nèi)外對(duì)功能基因研究的不斷深入，產(chǎn)生了許多EST數(shù)據(jù)庫(kù)，其中包含大量的SSR分子標(biāo)記，EST-SSR分子標(biāo)記技術(shù)隨之產(chǎn)生，因其保守程度更高，轉(zhuǎn)移率也較大，不同物種的通用性強(qiáng)，且經(jīng)濟(jì)便捷，迅速得到應(yīng)用。王娟等[3]通過(guò)構(gòu)建聚類(lèi)樹(shù)狀圖分析葡萄不同品種間的親緣關(guān)系，驗(yàn)證了EST-SSR技術(shù)在對(duì)葡萄種質(zhì)分類(lèi)鑒定中的可行性。通過(guò)篩選16對(duì)EST-SSR引物對(duì)62份葡萄材料進(jìn)行分子水平的比較分析，發(fā)現(xiàn)62份材料相似系數(shù)在0.48~1.00之間，為葡萄親緣關(guān)系探討提供了可靠的分子生物學(xué)依據(jù)。

1.2cpSSR分子標(biāo)記在葡萄上的應(yīng)用

葉綠體微衛(wèi)星 (chloroplast SSR, cpSSR)是近幾年發(fā)展起來(lái)的一種基于葉綠體基因組的分子標(biāo)記技術(shù)。葉綠體基因組相比核基因組具有以下特點(diǎn)：分子量小、結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、其中多為環(huán)狀雙鏈DNA；為原核性，序列保守，進(jìn)化速率慢；具有單親遺傳特性，不參與基因重組，為獨(dú)立遺傳進(jìn)化。這些特性決定了cpSSR對(duì)植物進(jìn)行系統(tǒng)性和進(jìn)化學(xué)研究具有很大的優(yōu)勢(shì)。易官美等[4]利用cpSSR分子標(biāo)記對(duì)榧樹(shù)10個(gè)自然分布群進(jìn)行了遺傳多樣性分析，解釋了榧樹(shù)經(jīng)歷歷史遺傳漂變形成單倍型分布式樣的重要原因。陳平等[5]利用cpSSR引物對(duì)苧麻屬進(jìn)行親緣分析，在22對(duì)引物中篩選出5對(duì)引物，共擴(kuò)增出16條多態(tài)帶，聚類(lèi)分析分為3類(lèi)，結(jié)果與傳統(tǒng)方式一致，而且其多態(tài)比例為22.73%，表明cpSSR具有較好的通用性。開(kāi)發(fā)適宜的cpSSR引物，在葡萄起源研究和親緣關(guān)系鑒定方面必將得到極大的應(yīng)用。

1.3ISSR分子標(biāo)記在葡萄上的應(yīng)用

ISSR(inter-simple sequence repeat)標(biāo)記技術(shù)也是在SSR基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一項(xiàng)新型標(biāo)記技術(shù)，由于其引物設(shè)計(jì)比SSR簡(jiǎn)單，不需像SSR引物那樣通過(guò)測(cè)序獲得SSR兩側(cè)的單拷貝序列，開(kāi)發(fā)費(fèi)用較低，同時(shí)，與SSR標(biāo)記相比，ISSR引物可以在不同的物種間通用，多態(tài)性高、重復(fù)性好，能夠提供更多的基因組信息。目前，ISSR標(biāo)記已廣泛應(yīng)用于植物品種鑒定、遺傳作圖、基因定位、遺傳多樣性、進(jìn)化及分子生態(tài)學(xué)研究中。李繼洋等[6]對(duì)19個(gè)新疆葡萄品種進(jìn)行了分析，利用2條ISSR引物構(gòu)建了14個(gè)葡萄品種的DNA指紋圖譜，提供了利用ISSR分析葡萄品種親緣關(guān)系和遺傳多樣性的新方法，建立的葡萄指紋圖譜為今后探索葡萄種質(zhì)資源奠定了基礎(chǔ)。

2SSR標(biāo)記在不同葡萄研究領(lǐng)域中的應(yīng)用

2.1SSR標(biāo)記在葡萄遺傳多樣性中的應(yīng)用

遺傳多樣性是指同一物種種內(nèi)的性狀差異，能夠反映一個(gè)物種適應(yīng)環(huán)境的能力和所具有的被改造、利用的潛力大小，是育種工作的基礎(chǔ)[7]。葡萄品種繁多，包括大量天然雜交品種和實(shí)生選育品種，SSR標(biāo)記的高多態(tài)性對(duì)于如此繁多復(fù)雜的品種進(jìn)行判定提供了有效手段。郝宇等[8]、方連玉等[9]分別對(duì)供試葡萄種質(zhì)資源進(jìn)行了遺傳多樣性分析。Baneh等[10]利用13條葡萄染色體上的23個(gè)SSR標(biāo)記位點(diǎn)，研究了伊朗葡萄的遺傳演化及其遺傳多樣性，發(fā)現(xiàn)了一批有價(jià)值的葡萄種質(zhì)資源。郭春苗等[11]利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行了葡萄品種(系)遺傳多樣性分析與指紋圖譜構(gòu)建，并對(duì)新疆44個(gè)相對(duì)適宜制干葡萄品種(系)進(jìn)行了遺傳多樣性研究。

2.2SSR標(biāo)記在葡萄品種鑒定中的應(yīng)用

葡萄是一個(gè)歷史悠久的物種，目前已知有8 000個(gè)以上的品種，分布在世界廣大地區(qū)，并且葡萄品種極易發(fā)生芽變變異，這使得葡萄同物異名及同名異物的現(xiàn)象較多，因此在葡萄研究和生產(chǎn)實(shí)踐中，品種鑒別成為重要環(huán)節(jié)之一。之前的研究主要利用葡萄的形態(tài)學(xué)、生理學(xué)、農(nóng)藝性狀特征進(jìn)行鑒定和分類(lèi)，但由于基因和環(huán)境的互作影響，這些鑒定方法具有很大局限性。利用SSR標(biāo)記可對(duì)葡萄品種進(jìn)行快捷準(zhǔn)確的鑒定，同時(shí)可對(duì)其親緣關(guān)系進(jìn)行分析。Bowers等[12]應(yīng)用SSR 技術(shù)成功鑒定了釀酒葡萄品種赤霞珠的親本是品麗珠和索維濃。吳子龍等[13]利用9對(duì)多態(tài)性較高的SSR引物區(qū)別了8個(gè)山葡萄及山歐雜種葡萄品種。

2.3SSR標(biāo)記在構(gòu)建葡萄DNA指紋圖譜中的應(yīng)用

隨著人們對(duì)品種保護(hù)意識(shí)的增強(qiáng)，許多植物開(kāi)始構(gòu)建DNA指紋圖譜。利用SSR分子標(biāo)記技術(shù)構(gòu)建葡萄的DNA指紋圖譜，可為保護(hù)葡萄品種的自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)、鑒定和檢測(cè)葡萄品種苗木真實(shí)性和純度提供客觀、科學(xué)和準(zhǔn)確的技術(shù)保障。

杜晶晶等[14]利用SSR標(biāo)記技術(shù)為中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院國(guó)家葡萄資源圃80份葡萄材料構(gòu)建了分子身份證編碼。通過(guò)篩選后的SSR引物對(duì)葡萄種質(zhì)進(jìn)行了區(qū)分，平均一對(duì)引物區(qū)分種質(zhì)8.9份，實(shí)驗(yàn)結(jié)果更加準(zhǔn)確，實(shí)驗(yàn)方法更加簡(jiǎn)便，使得利用SSR標(biāo)記構(gòu)建葡萄種質(zhì)分子身份證成為可能。Warren等[15]對(duì)21個(gè)葡萄品種和4個(gè)雜交種后代的110份資源進(jìn)行SSR指紋圖譜分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，已有研究劃分的歸屬于2個(gè)不同種的葡萄資源擁有完全相同的SSR指紋圖譜，表明它們擁有相同的基因型，可能是同物異名。李雪雁等[16]采用SSR標(biāo)記建立了75份葡萄品種DNA指紋圖譜體系；李繼洋等[6]利用2條ISSR引物構(gòu)建了14個(gè)品種的DNA指紋圖譜，圖譜的建立為葡萄品種鑒定和親緣分析提供了理論依據(jù)。尹玲等[17]為我國(guó)近幾年新育成的葡萄品種建立了指紋圖譜，更清晰的追溯了他們的親緣關(guān)系，完善了我國(guó)葡萄品種數(shù)據(jù)庫(kù)。其研究表明，昌黎7號(hào)、昌黎8號(hào)、蜜光、春光、寶光和昌黎21號(hào)等6個(gè)4倍體品種親本均為巨峰×早黑寶的后代。Troggio等[18]以SNP技術(shù)為基礎(chǔ)建立了歐洲葡萄的遺傳圖譜，此圖譜的構(gòu)建使用了483個(gè)SNP標(biāo)記、132個(gè)SSRs標(biāo)記和379個(gè)AFLP標(biāo)記，為SSR標(biāo)記技術(shù)在親緣關(guān)系更近的品種、品系的鑒別提供了依據(jù)。通過(guò)分子標(biāo)記繪制的指紋圖譜具有個(gè)體特異性，能準(zhǔn)確、快速鑒定品種或品系，該技術(shù)為作物育種和種質(zhì)管理提供了極大的便利，有利于推動(dòng)我國(guó)果樹(shù)苗木向著規(guī)范化、制度化和法制化的方向快速發(fā)展。

2.4SSR標(biāo)記在葡萄育種中的應(yīng)用

賴(lài)呈純等[19]利用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)95份葡萄品種(系)資源進(jìn)行了遺傳多樣性和親緣關(guān)系分析，結(jié)果表明，12條引物擴(kuò)增出160個(gè)清晰可辨的位點(diǎn)，品種間的遺傳相似系數(shù)為0.55~0.99，聚類(lèi)分析結(jié)果表明，95份葡萄資源劃分為3大類(lèi)：歐亞種、歐美雜種和東亞種群。Li等[20]通過(guò)利用與無(wú)核相關(guān)的分子標(biāo)記進(jìn)行早期目標(biāo)性狀的篩選，解釋了葡萄種子敗育的機(jī)制。陶紅霞等[21]利用SSR標(biāo)記對(duì)黑心病基因定位，尋找與抗性目標(biāo)性狀緊密連鎖的分子標(biāo)記，探討了黑心病的遺傳基礎(chǔ)，為培育抗黑心病品種提供了重要方法。SSR分子標(biāo)記為發(fā)現(xiàn)豐富的遺傳品種和種質(zhì)資源提供了有效的手段，在雜交前通過(guò)SSR分子標(biāo)記對(duì)預(yù)選親本的親緣關(guān)系進(jìn)行分析，為育種親本的選配提供了更為明確的方向性和目標(biāo)性，為優(yōu)良基因的有效利用和進(jìn)行分子標(biāo)記輔助選擇育種提供了理論支持。

3展望

隨著DNA分子標(biāo)記技術(shù)在各方面的應(yīng)用，SSR標(biāo)記的開(kāi)發(fā)更加快速。SSR分子標(biāo)記將和其他類(lèi)型的標(biāo)記一起在葡萄遺傳多樣性、品種鑒定、遺傳圖譜和育種等方面得到更加廣泛的應(yīng)用，在進(jìn)行芽變品種的鑒別、嫁接苗砧木品種的鑒定、葡萄加工品種的篩選方面展現(xiàn)更大的潛力[21,22]。

我國(guó)野生葡萄資源豐富，而且變異類(lèi)型多樣，而這些野生品種往往具有較高的抗寒性、抗病性等特性[23]，SSR 分子標(biāo)記可以為利用和保護(hù)好這些寶貴的種質(zhì)資源的相關(guān)研究提供更多幫助?？蒲泄ぷ髡咭褜SR分子標(biāo)記技術(shù)應(yīng)用到葡萄抗病性研究中，并取得了一定進(jìn)展。這些研究將有利于對(duì)雜種進(jìn)行早期抗性選擇，縮短育種周期，大大提高育種效率。

在今后葡萄遺傳育種的研究中，SSR分子標(biāo)記將有越來(lái)越大的發(fā)展空間，我們可以通過(guò)SSR分子標(biāo)記構(gòu)建葡萄屬植物的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，建立我國(guó)葡萄資源指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(kù)，充分利用我國(guó)豐富的葡萄資源，通過(guò)種間雜交、芽變體篩選，定位我國(guó)葡萄資源的抗性和品質(zhì)基因，以及預(yù)測(cè)雜交優(yōu)勢(shì)，使育種更具方向性和目的性。

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Application of SSR Markers in Variety Identification and Genetic Breeding ofVitisvinifera

DONG Zhi-gang1§, LIU Zheng-hai2§, LI Xiao-mei1, TAN Wei1, WANG Xin-ping1, RU Hui-ling1, TANG Xiao-ping1*

1.PomologyInstitute,ShanxiAcademyofAgriculturalSciences,ShanxiTaigu030815,China;2.ShanxiAgriculturalUniversity,ShanxiTaigu030801,China

Abstract:SSR(simple sequence repeat) has been widely used in the genetic breeding and germplasm resources research in recent years, because it has the characters of abundant quantity, reproducibility, high polymorphic, codominant inheritance and so on. The paper reviewed the application of SSR molecular markers in grape genetic diversity, variety identification, DNA fingerprint construction and genetic breeding. The application prospect of SSR markers in grape breeding was also presented.

Key words:Vitis vinifera; SSR markers; genetic breeding; genetic diversity

DOI:10.3969/j.issn.2095-2341.2016.02.10

作者簡(jiǎn)介：§董志剛與劉政海為本文共同第一作者。董志剛，副研究員，博士，研究方向?yàn)槠咸堰z傳育種及種質(zhì)資源鑒定評(píng)價(jià)。E-mail:gssdzg@163.com。劉政海，碩士研究生，研究方向?yàn)獒劸破咸哑贩N選育及種質(zhì)資源鑒定評(píng)價(jià)。Tel：0354-6215015，E-mail：gssdzg@163.com。*通信作者：唐曉萍，研究員，博士，研究方向?yàn)槠咸言耘嘤N。Tel：0354-6215015，E-mail：txp-19590401@163.com

基金項(xiàng)目：山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院博士基金(YBSJJ1202)資助。

收稿日期：2015-11-27; 接受日期：2016-01-12