呂麗敏， 張　帥， 雒珺瑜， 王春義， 朱香鎮(zhèn)， 王　麗， 張利娟， 崔金杰

中國農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所/棉花生物學國家重點實驗室，河南 安陽 455000

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Cry1C蛋白對4種棉花害蟲的致死效果

呂麗敏， 張帥， 雒珺瑜， 王春義， 朱香鎮(zhèn)， 王麗， 張利娟， 崔金杰*

中國農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所/棉花生物學國家重點實驗室，河南 安陽 455000

摘要:【背景】蘇云金芽胞桿菌(Bt)屬革蘭氏陽性細菌，是目前世界上應用最廣泛的殺蟲劑。來自Bt的Cry1Ac基因自1997年商業(yè)化以來，其產(chǎn)生的蛋白對棉鈴蟲、紅鈴蟲等鱗翅目害蟲起到了很好的控制作用。但該基因對甜菜夜蛾、斜紋夜蛾、玉米螟等害蟲的控制作用較差，因此，需要尋找新的Bt基因亞型控制上述害蟲?！痉椒ā繉ry1C蛋白加到人工飼料上形成藥膜后，接入低齡幼蟲進行生物測定，以常規(guī)不加毒蛋白的飼料為對照，計算1、3、5、7 d后不同害蟲的校正死亡率?！窘Y果】隨著Cry1C蛋白濃度的增加及時間的延長，甜菜夜蛾和斜紋夜蛾的校正死亡率逐漸升高，Cry1C濃度為10 μg·mL-1時，處理7 d后，甜菜夜蛾和斜紋夜蛾的校正死亡率分別為100%和85.42%，表明甜菜夜蛾比斜紋夜蛾更敏感，而棉鈴蟲和玉米螟對Cry1C蛋白的敏感性較差。【結論與意義】Cry1C基因可作為控制棉田甜菜夜蛾和斜紋夜蛾的有價值的候選基因，但是對棉鈴蟲和玉米螟無效。該研究為篩選新的Bt基因亞型用于防治不同的棉花害蟲提供了數(shù)據(jù)參考。

關鍵詞:Cry1C蛋白； 甜菜夜蛾； 斜紋夜蛾； 玉米螟； 棉鈴蟲

蘇云金芽胞桿菌(Bacillusthuringiensis，Bt)屬革蘭氏陽性細菌，是目前世界上應用最廣泛的殺蟲劑。該菌株能夠產(chǎn)生伴孢晶體蛋白，又稱殺蟲晶體蛋白(insecticidal crystal protein， ICP)或δ-內毒素；該毒素對鱗翅目、膜翅目、鞘翅目、雙翅目、直翅目、 半翅目、食毛目等多種昆蟲，以及螨類、線蟲和原生動物等都具有特異的殺蟲活性(Schnepfetal.,1998)。

我國棉花害蟲共有300多種，其中常發(fā)性害蟲30多種，包括鱗翅目、膜翅目、鞘翅目等(中國農(nóng)業(yè)科學院棉花研究所，2013)。1997年轉Bt(Cry1Ac)基因棉花開始商品化種植，有效控制了棉鈴蟲的暴發(fā)為害(吳孔明，2007)。轉Bt(Cry1Ac)基因對棉鈴蟲大范圍控制后，棉田其他害蟲如甜菜夜蛾Spodopteraexigua(Hübner)、斜紋夜蛾Prodenialitura(Fabricius)、玉米螟Pyraustanubilalis(Hübern)等對棉花的危害也需引起重視；其中，甜菜夜蛾于2001年在中國被列入重要害蟲的潛在暴發(fā)名單(石宏等，2006； Wuetal.,2009)。因此，在保證Bt(Cry1Ac)基因繼續(xù)發(fā)揮作用的同時，需要不斷挖掘尋找新的基因以防止上述害蟲對棉花造成新的更大危害，保證棉花產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展(王慶龍等,1986； 楊進等,2010)。挖掘的新基因在利用前首先要進行安全評價，旨在探明其對環(huán)境可能造成的影響。據(jù)報道(呂玲玲，2006； 王慶龍等,1986)，Cry1C基因被轉入到蔬菜作物后，對甜菜夜蛾的控制作用較好。此外，該基因還對伯莎夜蛾MamestraconfigurataWalker(Hernndez-Martínezetal.,2008)、小菜蛾PlutellaxylostellaL.(Massonetal.,1998)、粉紋夜蛾Trichoplusiani(Hübner) (Tabashniketal.,2000)等有較好的控制作用。但是該基因轉入棉花后的控制效果還未知。

本研究將不同濃度的Cry1C蛋白加到人工飼料中，通過室內試驗評價Cry1C對甜菜夜蛾、斜紋夜蛾、棉鈴蟲和玉米螟低齡幼蟲的控制作用，旨在為轉基因棉花篩選新的基因提供數(shù)據(jù)參考。

1材料與方法

1.1試蟲

選取棉鈴蟲、甜菜夜蛾、斜紋夜蛾和玉米螟為供試昆蟲；昆蟲齡期均為1日齡。4種昆蟲均為本實驗室飼養(yǎng)的敏感品系。

1.2人工飼料

人工飼料配方參照胡鳳林等(2008)、黃艷君和浦冠勤(2011) 、盧美光等(1999)和周大榮等(1980)改進而成。

1.3Cry1C純蛋白

Cry1C純蛋白購自Sigama公司，-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4試驗方法

飼料制備：按照每種昆蟲的人工飼料配方，稱取各個飼料組分，混合均勻、熬制，將飼料倒入24孔生測板，倒入時要不斷地水平搖動，保證表面平滑。配制含Cry1C蛋白的溶液，濃度分別為0.31、0.63、1.25、2.50、5.00、10.00、20.00 μg·mL-1，以加100 μL的無菌水作對照。待飼料凝固后向每個孔中加入Cry1C蛋白溶液100 μL，過夜放置，使毒蛋白溶液滲入飼料中。

接蟲：用毛筆將1齡幼蟲輕輕挑入24孔生測盒，每個孔接1頭蟲，以不加入毒蛋白飼料為對照，每板為1個重復，共3次重復。用蓋子封好，防止逃逸。將接蟲的24孔盒放到養(yǎng)蟲室培養(yǎng)(L∶D=14 h∶10 h， 溫度26 ℃，相對濕度70%)。

結果記錄：每隔1 d調查死亡蟲口數(shù)。分別記錄接蟲后1、3、5、7 d后不同處理中害蟲的死亡情況，計算校正死亡率。

1.5數(shù)據(jù)處理

死亡率(%)=死亡蟲數(shù)/接蟲數(shù)×100；校正死亡率(%)=(處理組死亡率-對照組死亡率)/(1-對照組死亡率)×100。

數(shù)據(jù)處理和方差計算利用Excel辦公軟件、DPS 7.0和SPSS軟件進行。

2結果與分析

2.1Cry1C毒蛋白對甜菜夜蛾的致死效果

Cry1C毒蛋白對甜菜夜蛾1齡幼蟲的生物測定結果見表1。隨著Cry1C毒蛋白濃度的升高，甜菜夜蛾幼蟲校正死亡率明顯上升。方差分析結果表明，處理后1 d，甜菜夜蛾的校正死亡率差異不顯著。處理后3 d，Cry1C濃度為5.0 μg·mL-1時，校正死亡率為48.49%；處理后5 d，Cry1C濃度為1.25 μg·mL-1時，校正死亡率為70.69%；處理后7 d，Cry1C的濃度為1.25 μg·mL-1時，校正死亡率為94.00%，以上差異均達到顯著水平。因此，甜菜夜蛾對Cyr1C的敏感性測定的時間點應選擇為5 d。

2.2Cry1C毒蛋白對斜紋夜蛾的致死效果

不同濃度的Cry1C對斜紋夜蛾的致死效果見表2。在同一濃度條件下，隨著處理時間的延長，斜紋夜蛾的死亡率逐漸上升；在相同的調查時間下，隨著Cry1C毒蛋白濃度的增大，斜紋夜蛾的死亡率逐漸增加。在處理后1、3 d，當Cry1C濃度為2.50 μg·mL-1時，校正死亡率差異達顯著水平；處理后5 d，Cry1C的濃度為1.25 μg·mL-1時，校正死亡率為60.72%，以及處理后7 d，Cry1C的濃度為5.00 μg·mL-1時，校正死亡率為75.00%，差異均達顯著水平。因此，斜紋夜蛾對Cyr1C的敏感性測定的時間點應選擇為5 d。

同列數(shù)據(jù)后附不同大、小寫字母者分別表示經(jīng)Duncan氏法多重比較在0.01、0.05水平上差異顯著。

Different capital and small letters represent significant differences among treatments at 0.01 and 0.05 level respectively when using a Duncan′s multiple ranging test.

同列數(shù)據(jù)后附不同大、小寫字母者分別表示經(jīng)Duncan氏法多重比較在0.01、0.05水平上差異顯著。

Different capital and small letters represent significant differences among treatments at 0.01 and 0.05 level respectively when using a Duncan′s multiple ranging test.

2.3Cry1C毒蛋白對棉鈴蟲和玉米螟的致死效果

對棉鈴蟲生物測定結果見表3。Cry1C毒蛋白對棉鈴蟲的致死效果較差。不同處理天數(shù)的調查結果表明，隨著Cry1C濃度的升高，對棉鈴蟲的致死作用不明顯；在相同調查時間不同毒蛋白濃度處理下，該毒素對棉鈴蟲的校正死亡率的差異均未達顯著水平。

對玉米螟的生物測定結果如表4所示。Cry1C對玉米螟的致死效果較差。不同處理時間的調查結果表明，玉米螟的校正死亡率并未隨濃度的升高呈現(xiàn)有規(guī)律的升高，其不同濃度處理之間的校正死亡率差異不顯著。

以上結果表明，棉鈴蟲和玉米螟作為Cyr1C毒蛋白的靶標昆蟲并不適合，即該毒蛋白的基因并不能作為控制鱗翅目害蟲棉鈴蟲和玉米螟的外源基因轉入受體植物。

3討論

本研究將不同濃度的Cry1C毒素加到人工飼料上飼喂甜菜夜蛾、棉鈴蟲、斜紋夜蛾和玉米螟等4種為害棉花的害蟲，通過計算不同昆蟲在不同濃度Cry1C以及不同處理時間下對應的校正死亡率，評價4種昆蟲對Cry1C毒素的敏感性，從而篩選Cry1C的靶標害蟲，為選擇新的基因通過轉化的方法控制以上棉花害蟲提供先期評價數(shù)據(jù)。試驗結果表明，甜菜夜蛾對Cry1C毒蛋白最敏感，在10 μg·mL-1Cry1C濃度條件下處理5 d，甜菜夜蛾的校正死亡率達到96.55%；斜紋夜蛾的校正死亡率為78.57%，對該毒素的敏感性次之；而Cry1C對棉鈴蟲和玉米螟的致死作用較差。

同列數(shù)據(jù)后附不同大、小寫字母者分別表示經(jīng)Duncan氏法多重比較在0.01、0.05水平上差異顯著。

Different capital and small letters represent significant differences among treatments at 0.01 and 0.05 level respectively when using a Duncan′s multiple ranging test.

同列數(shù)據(jù)后附不同大、小寫字母者分別表示經(jīng)Duncan氏法多重比較在0.01、0.05水平上差異顯著。

Different capital and small letters represent significant differences among treatments at 0.01 and 0.05 level respectively when using a Duncan′s multiple ranging test.

曾曉慧等(1999)研究了蘇云金桿菌Cry1C 毒素對甜菜夜蛾幼蟲生長發(fā)育、存活及取食行為的影響，當飼料中毒素濃度增高時, 幼蟲歷期延長， 存活率降低，對飼料的拒食作用和選擇作用增強，取食量和生長量減少。本試驗研究了Cry1C毒蛋白對甜菜夜蛾存活情況的影響，結果與其一致，說明Cry1C基因作為遺傳轉化材料來控制甜菜夜蛾危害有潛在的利用價值。此外，試驗還研究了該毒素對棉鈴蟲的致死效果，結果表明，Cry1C毒蛋白對棉鈴蟲的效果較差。目前，已經(jīng)商業(yè)化的轉基因棉花轉入的Bt基因為Cry1Ac/Ab融合蛋白，若轉基因棉花能同時控制棉鈴蟲和甜菜夜蛾等多種害蟲，構建雙價的轉基因體系最為可行，可實現(xiàn)同時控制2種或多種靶標害蟲的目的。但是還需評價Cry1Ac/Ab和Cry1C基因同時利用時，是否會有效果的疊加。

本試驗還研究了Cry1C毒素對斜紋夜蛾和玉米螟的致死效果，該毒素對斜紋夜蛾有一定的致死作用，而對玉米螟幾乎無效；因此，可以把Cry1C基因用于輔助控制斜紋夜蛾。長期以來，玉米螟在棉花上也是一種重要害蟲，并對棉花產(chǎn)生較重的為害(劉立春等，1996； 楊益眾等,1996)。試驗探討了Cry1C毒素對玉米螟的控制效果，但結果并不理想，說明玉米螟不是該毒素的靶標害蟲。目前已有報道，將經(jīng)過改良的Cry1C*轉入受體玉米對玉米螟有較好的控制作用(Duetal.,2014)。因此，可嘗試將該基因轉入棉花，形成雙價或多加價抗蟲棉花，實現(xiàn)抗多種害蟲的目的。但是轉入的多個基因之間是有無拮抗作用還需進一步試驗研究。

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(責任編輯:郭瑩)

The controlling effect of Cry1C protein on four species of cotton insect pest

Li-min Lü , Shuai ZHANG, Jun-yu LUO, Chun-yi WANG, Xiang-zhen ZHU,Li WANG, Li-juan ZHANG, Jin-jie CUI*

StateKeyLaboratoryofCottonBiology/InstituteofCottonResearch,ChineseAcademyofAgriculturalSciences,Anyang,Henan455000,China

Abstract:【Background】Bacillusthuringiensis(Bt) is a Gram-positive bacterium that is used as a biological pesticide world-wide.Cry1Acgene fromBthas been commercialized since 1997, and has been able to control cotton bollworm and pink bollworm. However,Cry1Acgene is not as good to controlSpodopteraexigua,Prodenialitura,Pyraustanubilalis, etc. Therefore, it is necessary to search for a new gene isoform ofBtto control these pests. 【Method】 Different concentrations of Cry1C were added to the surface of artificial diet of these three insects and bioassays were conducted in the laboratory. The control received no Cry1C artificial diet. Mortality was recorded at 1, 3, 5 and 7 d. 【Result】 The results showed that mortality ofA.caterpillarandP.lituraincreased gradually with increases in concentration and treatment time of Cry1C. At the 10 μg·mL-1Cry1C, mortalities ofA.caterpillarandP.liturawere 100% and 85.42%.A.caterpillarwas more sensitive to Cry1C thanP.litura. However,O.nubilalisandHelicoverpaarmigerawere not sensitive to Cry1C. 【Conclusion and significance】Cry1Cmay be a valuable candidate gene for controllingA.caterpillarandP.litura, but ineffective onO.nubilalisandH.armigera. This study provides a newBtgene type that can be used to control the different insect pests on the cotton plant.

Key words:Cry1C protein;Asparaguscaterpillar;Prodenialitura;Ostrinianubilalis;Helicoverpaarmigera

收稿日期(Received)：2015-09-29接受日期(Accepted)： 2015-10-10

基金項目:國家棉花產(chǎn)業(yè)技術體系(CARS-18-13)

作者簡介:呂麗敏， 女， 助理研究員。 研究方向: 棉花抗蟲性分子調控機理。 E-mail: llm0372@126.com *通訊作者(Author for correspondence), E-mail: cuijinjie@126.com

DOI:10. 3969/j.issn.2095-1787.2016.02.012