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紅細胞生成素對腸缺血再灌注損傷的保護作用及其機制研究*

劉啟勝程正位熊建光程思李湘楚#

湖北省咸寧市中心醫(yī)院消化內(nèi)科(437000)

背景：炎癥反應(yīng)是腸缺血再灌注損傷(IRI)的重要發(fā)病機制之一，而紅細胞生成素(EPO)具有抗炎活性。目的：探討EPO對腸IRI的保護作用及其可能機制。方法：32只健康雄性Sprague-Dawley大鼠隨機分為假手術(shù)組(sham組)、IRI組、EPO組和740Y-P組。IRI組、EPO組和740Y-P組以夾閉(45 min)-開放腸系膜上動脈建立腸IRI模型，術(shù)前1 h分別腹腔注射0.9% NaCl溶液、EPO和EPO+740Y-P。再灌注1 h后處死大鼠，觀察小腸組織病理學改變，以蛋白質(zhì)印跡法檢測PI3K/Akt、NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達，以real-time PCR和ELISA法檢測炎癥因子白細胞介素-8(IL-8)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)表達和分泌。結(jié)果：與sham組相比，IRI組小腸組織損傷評分、PI3K、p-Akt、p-NF-κB p65蛋白表達、IL-8、TNF-α、MCP-1 mRNA表達和血清水平顯著升高(P<0.05)。EPO預(yù)處理能明顯改善IRI模型大鼠的小腸組織病理學改變，抑制PI3K/Akt、NF-κB信號通路激活，下調(diào)炎癥因子表達、分泌，PI3K激動劑740Y-P則能減弱EPO的上述作用。結(jié)論：EPO預(yù)處理可通過抑制PI3K/Akt/NF-κB信號通路激活而抑制炎癥反應(yīng)，從而對腸IRI發(fā)揮保護作用。

關(guān)鍵詞腸；再灌注損傷；炎癥；紅細胞生成素；PI3K/Akt；NF-κB

Protective Effect and Potential Mechanism of Erythropoietin on Intestinal Ischemia-reperfusion Injury

LIUQisheng,CHENGZhengwei,XIONGJianguang,CHENGSi,LIXiangchu.

DepartmentofGastroenterology,XianningCentralHospital,Xianning,HubeiProvince(437000)

Correspondence to: LI Xiangchu, Email: 23843212@qq.com

Background: Inflammation plays an important role in intestinal ischemia-reperfusion injury (IRI), and erythropoietin (EPO) has been reported to have anti-inflammatory activity. Aims: To explore the protective effect of EPO on intestinal IRI and its potential mechanism. Methods: Thirty-two healthy male Sprague-Dawley rats were randomly divided into four groups: sham operation group (sham group), IRI group, EPO group and 740Y-P group. Rats in IRI, EPO and 740Y-P groups were injected intraperitoneally with 0.9% NaCl, EPO and EPO+740Y-P, respectively, one hour before the establishment of intestinal IRI model by superior mesenteric artery clamping (45 min)-reperfusion. All rats were sacrificed one hour after reperfusion. Histopathological changes of small intestine were observed; expression of proteins in PI3K/Akt and NF-κB signaling pathways was measured by Western blotting; expression and secretion of inflammatory cytokines, including interleukin-8 (IL-8), tumor necrosis factor-α (TNF-α) and monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1) were examined by real-time PCR and ELISA. Results: Compared with sham group, the damage score of small intestine, protein expressions of PI3K, p-Akt and p-NF-κB p65, as well as mRNA expressions and serum levels of IL-8, TNF-α and MCP-1 in IRI group were significantly increased (P<0.05). EPO pretreatment could ameliorate the histopathological changes of small intestine in IRI model rats, inhibit PI3K/Akt and NF-κB signaling activation and down-regulate expression and secretion of inflammatory cytokines. When 740Y-P, a PI3K agonist, was used combinedly, the effect exerted by EPO was diminished. Conclusions: EPO pretreatment can protect against intestinal IRI by inhibiting the activation of PI3K/Akt/NF-κB signaling and the subsequent inflammatory response.

Key wordsIntestines;Reperfusion Injury;Inflammation;Erythropoietin;PI3K/Akt;NF-kappa B

腸缺血再灌注損傷(ischemia-reperfusion injury, IRI)好發(fā)于心肺體外大循環(huán)手術(shù)、嚴重創(chuàng)傷、腸移植等臨床危重癥患者[1]，可導致腸道功能嚴重受損，腸屏障功能急劇降低，腸內(nèi)大量細菌和毒素易位進入體循環(huán)，激活單核-巨噬細胞系統(tǒng)，引起大量促炎細胞因子釋放，誘發(fā)全身性炎癥反應(yīng)綜合征(SIRS)甚至多器官功能衰竭[1-2]。因此，減少促炎細胞因子釋放、抑制炎癥反應(yīng)是減輕腸IRI的有效途徑。紅細胞生成素(erythropoietin, EPO)是一種由腎臟產(chǎn)生的具有多種生物學效應(yīng)的糖蛋白[3]，既往研究發(fā)現(xiàn)其可通過抑制氧化應(yīng)激和細胞凋亡等途徑對腸IRI發(fā)揮保護作用[4]，但EPO是否能通過其抗炎活性減輕腸IRI，目前尚不十分清楚。本研究建立大鼠腸IRI模型并予EPO預(yù)處理或EPO預(yù)處理聯(lián)合PI3K激動劑740Y-P干預(yù)，通過組織病理學檢查以及PI3K/Akt、NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達的檢測，進一步探討EPO對腸IRI的保護作用及其可能機制。

材料與方法

一、實驗動物分組和處理

健康雄性Sprague-Dawley大鼠32只，體質(zhì)量200~250 g，SPF級，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，質(zhì)量合格證號：610037867，飼養(yǎng)于咸寧醫(yī)學院實驗動物中心。大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機分為假手術(shù)組(sham operation組，簡稱sham組)、IRI組、EPO組和740Y-P組，每組8只。EPO組術(shù)前1 h腹腔注射EPO(純度99%，Sigma-Aldrich Co.) 5 000 U/kg[4]；740Y-P組術(shù)前1 h腹腔注射EPO 5 000 U/kg+740Y-P(純度99%，Sigma-Aldrich Co.) 3.5 mg/kg[5]；Sham組和IRI組術(shù)前腹腔注射等體積0.9% NaCl溶液。IRI組、EPO組和740Y-P組接受腸IRI造模處理：戊巴比妥鈉麻醉，開腹腔，游離組織，分離暴露腸系膜上動脈，以血管夾夾閉，紗布覆蓋切口，置于32 ℃溫箱45 min，松開血管夾，恢復(fù)腸道血流灌注，縫合腹部，術(shù)畢回動物房，正常飲食、飲水。Sham組僅開腹，不夾閉腸系膜上動脈。造模過程順利，各組均無動物死亡。再灌注1 h后眼內(nèi)眥靜脈取血，處死大鼠，收集腸道標本，用于后續(xù)實驗。

二、方法

1. 小腸組織病理學檢查：小腸組織標本4%甲醛溶液固定，石蠟包埋、切片，HE染色，光學顯微鏡下觀察組織病理學改變。組織學損傷程度的評估采用Chiu腸黏膜損傷評分標準[6]：0分，正常絨毛和腺體；1分，部分絨毛頂端上皮輕度受損；2分，上皮下腺體輕度受損；3分，上皮下間隙擴大，毛細血管充血；4分，上皮與固有層中度分離，腺體受損；5分，部分絨毛頂端脫落；6分，絨毛頂端脫落明顯，毛細血管擴張；7分，絨毛固有層部分脫落，腺體受損明顯；8分，固有層開始消化分解；9分，出血和潰瘍。

2. 蛋白質(zhì)印跡法：免抗大鼠PI3K、Akt、p-Akt、NF-κB p65、p-NF-κB p65抗體購自Cell Signaling Technology, Inc.。取小腸組織稱重，每50 mg組織加入1 mL RIPA裂解液，冰上勻漿，裂解30 min，4 ℃ 12 000×g離心30 min，取上清，BCA法測定蛋白濃度。50 μg蛋白質(zhì)上樣，SDS-PAGE電泳(5%濃縮膠，10%分離膠，恒壓80~100 V)，轉(zhuǎn)膜(PVDF膜，恒流300 mA)，洗膜，5%脫脂奶粉(TBST配制)封閉1 h，分別加入PI3K(1∶500)、Akt(1∶1 000)、p-Akt(1∶500)、NF-κB p65(1∶1 000)、p-NF-κB p65(1∶500)和β-actin(1∶3 000)抗體孵育過夜，振洗后加入二抗羊抗兔IgG-HRP 37 ℃孵育1 h，洗膜后加入ECL試劑，曝光、顯影、定影、拍照。以Quantity One軟件分析目的蛋白相對表達量，以目的蛋白條帶與內(nèi)參β-actin條帶積分光密度值的比值表示。

3. Real-time PCR：稱取適量小腸組織，于液氮中研磨成粉末狀，由上海拜力生物科技有限公司完成總RNA提取，紫外分光光度法測定總RNA樣品濃度和純度。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和real-time PCR試劑盒購自Roche Diagnostics，按相應(yīng)試劑盒說明書進行操作，行逆轉(zhuǎn)錄和real-time PCR，白細胞介素-8(IL-8)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、單核細胞趨化蛋白-1(MCP-1)引物信息見表1。以β-actin為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計算目的基因mRNA相對表達量。

4. ELISA：大鼠IL-8、TNF-α、MCP-1 ELISA試劑盒購自上海拜力生物科技有限公司，按相應(yīng)試劑盒說明書進行操作，檢測血清IL-8、TNF-α、MCP-1水平(單位：pg/mL)。

三、統(tǒng)計學分析

表1　Real-time PCR引物信息

結(jié)果

一、小腸組織病理學改變

IRI組小腸絨毛大量脫落，腸黏膜大量炎性細胞浸潤，大量毛細血管出血，壞死，潰瘍形成，腸黏膜損傷評分較sham組顯著升高(7.0±1.5對0.5±0.5,P<0.05)；與IRI組相比，EPO組小腸絨毛脫落、炎性細胞浸潤、毛細血管出血、壞死、潰瘍形成均明顯減輕，腸黏膜損傷評分顯著降低(2.0±0.5對7.0±1.5,P<0.05)；740Y-P組小腸損傷程度與IRI組類似，腸黏膜損傷評分顯著高于EPO組 (6.0±1.0對2.0±0.5,P<0.05)(圖1)。上述發(fā)現(xiàn)提示EPO預(yù)處理可減輕腸IRI的組織病理學改變，而740Y-P可減弱EPO對腸IRI的保護作用。

二、EPO和740Y-P對PI3K/Akt、NF-κB信號通路的影響

蛋白質(zhì)印跡法檢測結(jié)果顯示，IRI組小腸組織PI3K、 p-Akt、 p-NF-κB p65蛋白表達較sham組顯著升高(P<0.05)，EPO組上述蛋白表達均較IRI組顯著降低(P<0.05)，740Y-P組p-Akt、p-NF-κB p65蛋白表達較EPO組顯著升高(P<0.05)，四組間Akt、NF-κB p65蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)(圖2~4)。上述發(fā)現(xiàn)提示IRI時PI3K/Akt、NF-κB信號通路激活，EPO預(yù)處理可抑制其激活，而740Y-P可減弱EPO的此種抑制作用。

三、EPO和740Y-P對炎癥因子表達和分泌的影響

Real-time PCR檢測結(jié)果顯示，IRI組小腸組織IL-8、TNF-α、MCP-1 mRNA相對表達量較sham組顯著升高(P<0.05)，EPO組上述mRNA表達均較IRI組顯著降低(P<0.05)，740Y-P組則較EPO組顯著升高(P<0.05)，相對表達量與IRI組相近。對四組血清IL-8、TNF-α、MCP-1水平的檢測結(jié)果與其小腸組織mRNA表達變化相一致(表2)。上述發(fā)現(xiàn)提示IRI時促炎細胞因子和趨化因子的表達、分泌顯著上調(diào)，EPO預(yù)處理可下調(diào)這些炎癥因子的表達、分泌，而740Y-P可減弱EPO的此種抑制作用。

圖1　各組小腸組織病理學改變(HE染色，×400)

**與sham組比較，P<0.01；#與IRI組比較，P<0.05

***與sham組比較，P<0.001；#與IRI組比較，P<0.05

###與IRI組比較，P<0.001；*與EPO組比較，P<0.05

組別例數(shù)小腸組織mRNA表達IL-8TNF-αMCP-1血清水平(pg/mL)IL-8TNF-αMCP-1sham組80.85±0.111.00±0.121.02±0.05100.0±10.0110.2±10.0100.0±20.0IRI組88.52±0.75a13.25±1.52a5.55±0.42a850.3±50.2a1500.2±300.2a650.2±40.1aEPO組82.52±0.52b5.15±0.52b1.52±0.52b550.2±30.9b450.0±150.0b250.0±30.0b740Y-P組87.51±0.54c13.00±1.51c4.53±0.51c750.0±40.0c1100.0±250.0c450.0±40.0c

a與sham組比較,P<0.05；b與IRI組比較，P<0.05；c與EPO組比較，P<0.05

討論

腸IRI是腸道供血中斷后重新恢復(fù)血流灌注所致的臨床危象，可于嚴重創(chuàng)傷、移植、心臟旁路手術(shù)、休克等情況下發(fā)生[1]，發(fā)病率高、預(yù)后差，如何減輕腸IRI是亟待解決的重要臨床問題。腸道缺血可導致機體細胞缺氧、ATP合成減少、炎癥反應(yīng)激活，血流灌注恢復(fù)后，炎癥反應(yīng)進一步加重，導致大量腸上皮細胞凋亡、壞死，使腸道損傷加劇[1-2]。EPO是調(diào)控血紅蛋白合成的糖蛋白類激素，具有抗炎、抗凋亡、抗腫瘤等廣泛的生物學活性[3]。鑒于炎癥反應(yīng)是IRI的重要發(fā)病機制之一，本研究通過建立大鼠腸IRI模型，對EPO對腸IRI的保護作用進行了探討。研究結(jié)果顯示，EPO預(yù)處理可明顯減輕IRI引起的小腸損傷和炎癥反應(yīng)，如小腸絨毛脫落、炎性細胞浸潤、毛細血管出血、壞死、潰瘍等，腸黏膜損傷評分較未予EPO預(yù)處理的IRI模型大鼠顯著降低。

NF-κB是調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的重要核轉(zhuǎn)錄因子，其活性取決于p65亞基的激活[7]。本研究結(jié)果顯示，IRI和EPO預(yù)處理對NF-κB p65表達均無明顯影響，但IRI可上調(diào)其激活形式p-NF-κB p65表達，EPO預(yù)處理則可抑制IRI引起的NF-κB激活，進而抑制其下游炎癥因子基因轉(zhuǎn)錄、表達。本研究同時檢測了各組大鼠的小腸組織IL-8、TNF-α、MCP-1 mRNA表達以及三者的血清水平，證實IRI模型大鼠上述促炎細胞因子和趨化因子的表達、分泌顯著上調(diào)，而EPO預(yù)處理可下調(diào)這些炎癥因子的表達、分泌。EPO抑制NF-κB p65亞基磷酸化的機制尚不清楚，有待進一步研究。

PI3K/Akt為一經(jīng)典信號通路，其激活可導致NF-κB 抑制蛋白(IκB)激酶(IKK)激活和IκB降解，進而激活NF-κB，調(diào)節(jié)其下游炎癥反應(yīng)[8]。研究[9]發(fā)現(xiàn)一些藥物可通過抑制PI3K/Akt信號通路激活而抑制炎癥反應(yīng)，進而對IRI發(fā)揮保護作用。本研究進一步對EPO是否通過抑制PI3K/Akt/NF-κB信號通路激活而減輕腸IRI進行了探討。各組大鼠小腸組織PI3K/Akt信號通路相關(guān)蛋白表達檢測結(jié)果顯示，IRI可激活PI3K/Akt信號通路，表現(xiàn)為PI3K和p-Akt表達上調(diào)，而予EPO預(yù)處理的IRI模型大鼠兩者表達均顯著下調(diào)，在EPO預(yù)處理的同時予PI3K激動劑740Y-P干預(yù)則可減弱EPO的作用，740Y-P組PI3K/Akt、NF-κB信號通路激活，小腸組織IL-8、TNF-α、MCP-1 mRNA表達、三者血清水平以及小腸損傷程度均與IRI組類似，提示EPO系通過抑制PI3K/Akt信號通路，進而抑制NF-κB激活及其下游促炎細胞因子、趨化因子的表達、分泌而削弱炎癥反應(yīng)，從而減輕腸IRI。除通過抑制PI3K/Akt信號通路激活而抑制炎癥反應(yīng)外，EPO是否尚可通過其他途徑參與減輕IRI，相關(guān)機制有待進一步研究。

綜上所述，本實驗結(jié)果提示EPO預(yù)處理可通過抑制PI3K/Akt/NF-κB信號通路激活而抑制炎癥反應(yīng)，從而對腸IRI發(fā)揮保護作用，這一發(fā)現(xiàn)為臨床上缺血性腸病的治療提供了新的途徑。后續(xù)擬進一步探索EPO用于缺血性腸病臨床治療的劑量和給藥方式。

參考文獻

1 Vollmar B, Menger MD. Intestinal ischemia/reperfusion: microcirculatory pathology and functional consequences[J]. Langenbecks Arch Surg, 2011, 396 (1): 13-29.

2 Arumugam TV, Okun E, Tang SC, et al. Toll-like receptors in ischemia-reperfusion injury[J]. Shock, 2009, 32 (1): 4-16.

3 Bartnicki P, Kowalczyk M, Rysz J. The influence of the pleiotropic action of erythropoietin and its derivatives on nephroprotection[J]. Med Sci Monit, 2013, 19: 599-605.

4 Guneli E, Cavdar Z, Islekel H, et al. Erythropoietin protects the intestine against ischemia/ reperfusion injury in rats[J]. Mol Med, 2007, 13 (9-10): 509-517.

5 Aedo JE, Reyes AE, Avendao-Herrera R, et al. Bacterial lipopolysaccharide induces rainbow trout myotube atrophy via Akt/FoxO1/Atrogin-1 signaling pathway[J]. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai), 2015, 47 (11): 932-937.

6 Boybeyi ?, Gunal YD, Atasoy P, et al. The effect of colchicine and low-dose methotrexate on intestinal ischemia/reperfusion injury in an experimental model[J]. J Pediatr Surg, 2014, 49 (10): 1471-1474.

7 McKenna S, Gossling M, Bugarini A, et al. Endotoxemia Induces IκBβ/NF-κB-Dependent Endothelin-1 Expression in Hepatic Macrophages[J]. J Immunol, 2015, 195 (8): 3866-3879.

8 Wang L, Xu Y, Yu Q, et al. H-RN, a novel antiangiogenic peptide derived from hepatocyte growth factor inhibits inflammationinvitroandinvivothrough PI3K/AKT/IKK/NF-κB signal pathway[J]. Biochem Pharmacol, 2014, 89 (2): 255-265.

9 Zhang J, Yao Y, Xiao F, et al. Administration of dexamethasone protects mice against ischemia/reperfusion induced renal injury by suppressing PI3K/AKT signaling[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2013, 6 (11): 2366-2375.

(2015-05-23收稿；2015-07-21修回)

*基金項目：湖北省衛(wèi)生計生委科研項目(WJ2015MB299)；咸寧市科技局一般項目(201510)

DOI:10.3969/j.issn.1008-7125.2016.01.004

#本文通信作者, Email: 23843212@qq.com