呂新年?。ㄉ綎|省昌樂縣畜牧獸醫(yī)局　262400）

濰坊地區(qū)雞場禽腺病毒分離鑒定

呂新年（山東省昌樂縣畜牧獸醫(yī)局262400）

2016年4月份，從山東濰坊一個肉雞場送檢一批病死雞，筆者對該病死雞進行臨床剖檢和分子生物學診斷。臨床診斷發(fā)現(xiàn)該病雞出現(xiàn)心包積液，肝臟腫大，有壞死點。初步診斷為腺病毒。取病死雞肝臟研磨并接種雞胚后，提取尿囊液DNA，使用腺病毒特異性引物擴增出片段，并在NCBI上比對與I群腺病毒IV型相似度最高。因此診斷為腺病毒感染引起。本報道確診了腺病毒在該地區(qū)養(yǎng)殖場中流行情況，給該病毒的預防和治療提供理論依據(jù)。

禽腺病毒(Fowl Adenovirus, FAV)根據(jù)群特異性抗原的不同分為三個群，I群禽腺病毒(Fowl Adenovirus Group I, FAVI)具有共同的群抗原，包括傳統(tǒng)的禽腺病毒及其它禽類分離物，共12個血清型，代表株為雞胚致死孤兒病毒(Chicken embryo-lethal orphan virus)[1]。該群病毒在雞、鴨、鵝體內(nèi)普遍存在，能使雞群呈隱性感染，作為繼發(fā)病原共同作用家禽，并能垂直傳播，污染雞胚，而我國現(xiàn)有的禽用生物制品大多是用非免疫雞胚制備，因此該群病毒的潛在污染嚴重影響了胚源生物制品的質(zhì)量[2]。最近，在山東地區(qū)發(fā)現(xiàn)一些雞群感染發(fā)病，病雞大群精神萎靡，有些雞只呈現(xiàn)猝死，死亡雞只剖檢觀察發(fā)現(xiàn)呈現(xiàn)明顯心包積液，肝臟壞死等病變。最近許多有文獻報道，在我國腺病毒流行且呈現(xiàn)類似癥狀[3,4]。對此雞群進行針對性檢測。現(xiàn)將結(jié)果報道如下。

1　材料和方法

1.1材料山東省濰坊市某雞場送檢病死雞數(shù)只；SPF授精種蛋購自山東無特定病原種雞場。Taq酶購自上海生物工程公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒為Qiagen 公司產(chǎn)品；其它試劑均為國產(chǎn)或進口分析純試劑 。

1.2臨床癥狀及剖檢觀察通過詢問和到場觀察雞群情況，并剖檢觀察病死雞臨床癥狀。

1.3病毒分離及鑒定從病雞肝臟研磨后，加生理鹽水浸泡1ml，10000r/min，離心5min，取上清用0.2μm濾器過濾，采用絨毛尿囊膜途徑接種9～10日齡SPF雞胚，置35℃溫箱孵育24h后觀察，剔除死胚，繼續(xù)孵育2d后收獲尿囊液。按常規(guī)方法制備不同濃度(2%)的雞紅細胞和大鼠紅細胞，檢測尿囊液是否具有凝集這些紅細胞的特性。并使用H9流感病毒和新城疫病毒特異性抗體進行血凝抑制試驗。

1.4病毒基因組的提取按常規(guī)方法進行尿囊液病毒基因組的提取。

1.5PCR擴增根據(jù)GenBank中I群禽腺病毒代表株CELO病毒的全基因組序列，設計合成了如下1對引物：PL1：5′ggggcggccgcgatgatgtataataacct3′FL2：5′gggtctagactcacgcg acatgactgtct3′ 分別擴增I群禽腺病毒基因組左末端L片段。上述引物由大連寶生物工程公司合成。然后取0.1μg的病毒DNA進行PCR擴增，采用50μl的PCR體系：DNA 0.1μg，10×PCR buffer5μl，25mM MgCl23μl，10mM dNTP1μl，上游引物和下游引物各25pmol，Taq酶0.5U，加滅菌超純水至50μl，經(jīng)94℃5min變性，然后94℃1min，55℃1min，72℃2min，30個循環(huán)擴增，72℃10min延長，4℃保存。

1.6PCR產(chǎn)物的回收、連接及測序?qū)CR產(chǎn)物通過0.8%瓊脂糖凝膠電泳，切下目的片段，并用瓊脂凝順收試劑盒回收純化，并送上海生物工程公司測序 。

1.7序列比較將序列使用NCBI中的Nuclear acid blasting進行序列比對。

2　結(jié)果

2.1病雞臨床觀察雞群大群精神萎靡，食欲不振，病雞在3天時開始死亡，死亡率達40%左右，病死雞剖檢觀察發(fā)現(xiàn)明顯心包積液，肝臟明顯腫大，有壞死點。有的有繼發(fā)大腸桿菌感染，出現(xiàn)包心包肝癥狀。

2.2病毒分離鑒定結(jié)果收集雞胚尿囊液后，使用雞和大鼠紅細胞進行血凝反應發(fā)現(xiàn)，尿囊液血凝效價高達log25，然而H9流感病毒和新城疫病毒血凝抑制試驗沒有檢測到抗原存在。分離到了腺病毒。

2.3分子生物學鑒定為了進一步驗證該雞群發(fā)病是由于腺病毒引起，將設計引物，擴增腺病毒基因，并通過測序后，將序列與NCBI數(shù)據(jù)庫中的序列并比對發(fā)現(xiàn)，與I群腺病毒IV血清型病毒相似性最高，達到99.9%。

3　討論

（1）根據(jù)本研究的結(jié)果，判定該雞群感染I群血清IV型腺病毒，最近有文獻報道在我國許多地區(qū)該病毒的感染都有報道，證明在濰坊地區(qū)，該病毒已經(jīng)流行。在本病例報道中，發(fā)現(xiàn)該病毒感染性較強，傳播性較強，一個雞群發(fā)病后，該雞群的其他雞只也相應發(fā)病。在周邊雞場中也發(fā)現(xiàn)該病的流行，說明該病毒傳播性較強。另外，感染該病后，死亡率高達40%。有的報道發(fā)現(xiàn)死亡率還高。主要引起心包積液和肝臟腫大及壞死點等臨床病變，可以作為特征性癥狀進行初步診斷。（2）為了更準確的診斷，進行了病毒的分離與分子生物學鑒定。成功分離到含有血凝性的尿囊液，對尿囊液使用流感、新城疫等抗血清進行血凝抑制，發(fā)現(xiàn)并沒有流感和新城疫的感染。為了進一步確定該尿囊液中含有腺病毒。設計腺病毒特異性引物擴增，PCR結(jié)果呈現(xiàn)陽性，將DNA回收后送測序，并將序列上傳NCBI進行核酸序列比對發(fā)現(xiàn)與近期我國分離的I群血清IV型腺病毒相似性搞到99%以上[3,4]，進一步證明了判定的準確性。（3）針對該病毒已經(jīng)在該地區(qū)流行，對于腺病毒的預防和控制迫在眉睫?，F(xiàn)在市場上已經(jīng)有針對該血清型的腺病毒疫苗，可以在使用疫苗防控的同時對已經(jīng)感染發(fā)病毒的雞場進行用藥，一定程度減輕經(jīng)濟損失并預防該病毒的傳播。然而，最重要的還是做好生物安全工作，只有做好生物安全，切斷傳播途徑，才能更好的控制住病毒的暴發(fā)。

[1] 殷震. 動物病毒學[M]. 北京: 科學出版社; 1997.

[2] 周斌, 曹瑞兵, 蘆銀華, 陳德勝, 陳溥言. 隨機引物PCR擴增雞胚致死孤兒病毒DNA的研究[J]. 中國病毒學. 2003;18(2):137-40.

[3] Zhao J, Zhong Q, Zhao Y, Hu YX, Zhang GZ. Pathogenicity and Complete Genome Characterization of Fowl Adenoviruses Isolated from Chickens Associated with Inclusion Body Hepatitis and Hydropericardium Syndrome in China. PLoS One. 2015;10(7):e0133073.

[4] Niu YJ, Sun W, Zhang GH, Qu YJ, Wang PF, Sun HL, et al. Hydropericardium syndrome outbreak caused by fowl adenovirus serotype 4 in China in 2015. The Journal of general virology. 2016.

S858.31

B

1007-1733(2016)12-0040-02

（2016–08–31）