黃荷云，周堯遠(yuǎn)，張榮軍，蔡剛明，顧曉波，潘棟輝，蔣孟軍

(1江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所，江蘇無(wú)錫 214063；2衛(wèi)生部核醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3江蘇省分子核醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；4南京醫(yī)科大學(xué)附屬無(wú)錫人民醫(yī)院)

?

白樺酸體外對(duì)人肝癌細(xì)胞、鼻咽癌細(xì)胞增殖及組織血管生成的影響

黃荷云1,2,3，周堯遠(yuǎn)1,2,3，張榮軍1,2,3，蔡剛明1,2,3，顧曉波1,2,3，潘棟輝1,2,3，蔣孟軍4

(1江蘇省原子醫(yī)學(xué)研究所，江蘇無(wú)錫 214063；2衛(wèi)生部核醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；3江蘇省分子核醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室；4南京醫(yī)科大學(xué)附屬無(wú)錫人民醫(yī)院)

摘要：目的觀察白樺酸(BA)對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖及組織血管生成的影響。方法 培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞株Bel-7402、人鼻咽癌細(xì)胞株CNE、人血管內(nèi)皮細(xì)胞株HMEC，分別以不同濃度的BA干預(yù)，比較Bel-7402細(xì)胞和CNE細(xì)胞增殖抑制率、凋亡率，并比較HMEC細(xì)胞增殖抑制率、遷移能力、血管形成能力。結(jié)果BA可抑制Bel-7402細(xì)胞、CNE細(xì)胞增殖，促進(jìn)其凋亡，且呈劑量依賴性(P均<0.05)；BA可抑制HMEC細(xì)胞增殖，減弱遷移能力及血管形成能力，且呈劑量依賴性(P均<0.05)。結(jié)論 BA可抑制人肝癌細(xì)胞、鼻咽癌細(xì)胞增殖及腫瘤組織血管生成。

關(guān)鍵詞：白樺酸；人肝癌細(xì)胞；人鼻咽癌細(xì)胞；人血管內(nèi)皮細(xì)胞

血管生成是實(shí)體腫瘤生長(zhǎng)的決定性因素，腫瘤細(xì)胞通過(guò)腫瘤血管獲得營(yíng)養(yǎng)與氧氣供應(yīng)，因此抗腫瘤血管生長(zhǎng)已成為腫瘤治療的研究熱點(diǎn)。白樺酸(BA)是從多種植物中分離得到的一種五環(huán)三萜類化合物，在自然界中分布廣泛。早期研究發(fā)現(xiàn)，BA對(duì)黑色素瘤有細(xì)胞毒性作用；近期研究發(fā)現(xiàn),BA具有抗人類免疫缺陷病毒活性、抗炎癥和廣譜抗腫瘤作用，且存在作用機(jī)制特異、分子質(zhì)量小、低毒性等優(yōu)點(diǎn)[1～7]。本研究觀察了BA對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖及組織血管生成的影響，為進(jìn)一步研究BA在血管生成中的機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1藥物、試劑及儀器BA；人血管內(nèi)皮細(xì)胞株HMEC由法國(guó)國(guó)家衛(wèi)生醫(yī)學(xué)研究院惠贈(zèng)；人肝癌細(xì)胞株Bel-7402，人鼻咽癌細(xì)胞株CNE；磺酰羅丹明B(SRB)，內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(EGF)；Matrigel；RPMI1640、MCDB-131培養(yǎng)基、胎牛血清；小牛血清；胰酶；細(xì)胞培養(yǎng)板。倒置顯微鏡；酶標(biāo)儀；CO2培養(yǎng)箱。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)Bel-7402細(xì)胞、CNE細(xì)胞用RPMI1640培養(yǎng)液(含10%小牛血清、1%雙抗)培養(yǎng)，HMEC細(xì)胞用MCDB-131培養(yǎng)液(含10%小牛血清、1%雙抗、1 mg/L氫化可的松、10 μg/L EGF)培養(yǎng)。培養(yǎng)箱設(shè)置條件為37 ℃、5%CO2。

1.3Bel-7402細(xì)胞和CNE細(xì)胞增殖、凋亡情況觀察①細(xì)胞增殖情況：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Bel-7402細(xì)胞、CNE細(xì)胞，分別接種于96孔板中，每孔1×104個(gè)細(xì)胞，每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)平行孔，培養(yǎng)過(guò)夜。鋪Bel-7402細(xì)胞的96孔板中分別加入0、5、10、12、14、16、18、20、30 mg/L的BA，鋪CNE細(xì)胞的96孔板中分別加入0、5、10、20、30、40、50、60、80 mg/L的BA。培養(yǎng)72 h后去掉上清液，加入100 g/L三氯醋酸固定1 h后用去離子水洗5遍干燥。4 g/L SRB染色，室溫放置30 min，用1%醋酸液洗5遍，加150 μL的10 mmol/L Tris(pH 10.5)溶解，酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)531 nm測(cè)定吸光度。計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，抑制率(%)=[(1-實(shí)驗(yàn)組A值)/對(duì)照組A值]×100%。②細(xì)胞凋亡情況：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期Bel-7402細(xì)胞、CNE細(xì)胞，接種于96孔板，每孔1×104個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)24 h，后在Bel-7402細(xì)胞的96孔板中分別加0、5、10、20、40、60 mg/L的BA，CNE細(xì)胞的96孔板中分別加0、3.125、6.25、12.5、25、50 mg/L的BA，24 h后加Hochest33342和PI，其終濃度均為10 mg/L，培養(yǎng)10 min后，熒光顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)并拍照。

1.4HMEC細(xì)胞增殖情況、遷移能力、血管形成能力觀察①細(xì)胞增殖情況：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HMEC細(xì)胞，分別接種于96孔板中，每孔1×104個(gè)細(xì)胞，每個(gè)濃度設(shè)4個(gè)平行孔，培養(yǎng)過(guò)夜。鋪HMEC細(xì)胞的96孔板中分別加入0、5、10、20、30、40、50、60、80 mg/L的BA。培養(yǎng)72 h后去掉上清液，加入100 g/L三氯醋酸固定1 h后，用去離子水洗5遍干燥。4 g/L SRB染色，室溫放置30 min，用1%醋酸液洗5遍，加150 μL的10 mmol/L Tris(pH 10.5)溶解，酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)531 nm測(cè)定吸光度。計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，抑制率(%)=[(1-實(shí)驗(yàn)組A值)/對(duì)照組A值]×100%。②細(xì)胞遷移能力：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HMEC細(xì)胞，以2×108/L的細(xì)胞接種于24孔板中，每孔2 mL，放置于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過(guò)夜。用剪平的槍頭在鋪有細(xì)胞的24孔板中間劃線，培養(yǎng)液洗滌3次，洗去劃下的細(xì)胞，分別加入0、6.25、12.5、25、50 mg/L的BA。72 h后，在倒置顯微鏡下觀察并用顯微鏡拍照，Image Pro Plus6.0軟件計(jì)算劃痕區(qū)域細(xì)胞的面積。③細(xì)胞血管形成能力：實(shí)驗(yàn)材料先在4 ℃冰箱中預(yù)冷，取50 μL的Matrigel加入96孔培養(yǎng)板中，37 ℃孵育4 h待其凝固。分別取BA、含15%血清的MCDB-131培養(yǎng)液和HMEC細(xì)胞(4×104個(gè)/孔)混勻后加入到96孔培養(yǎng)板中，BA終濃度為0、6.25、12.5、25、50 mg/L。培養(yǎng)24 h，顯微鏡下觀察血管形成。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS11.0統(tǒng)計(jì)軟件。組間比較采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1Bel-7402細(xì)胞、CNE細(xì)胞增殖抑制率比較BA濃度為5、10、12、14、16、18、20、30 mg/L時(shí)，Bel-7402細(xì)胞增殖抑制率分別為0.5%、5.0%、28.9%、43.0%、58.8%、76.3%、86.2%、93.1%。BA濃度為5、10、20、30、40、50、60、80 mg/L時(shí)，CNE細(xì)胞增殖抑制率分別為51.7%、72.7%、78.5%、90.0%、92.7%、93.6%、95.0%、95.3%。BA對(duì)Bel-7402細(xì)胞和CNE細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用，且呈劑量依賴性(P均<0.05)。

2.2Bel-7402細(xì)胞、CNE細(xì)胞凋亡率比較Bel-7402細(xì)胞分別加入0、5、10、20、40、60 mg/L的BA，其凋亡率分別為8.0%、11.2%、24.0%、67.2%、82.4%。CNE細(xì)胞分別加入0、3.125、6.25、12.5、25、50 mg/L的BA，其凋亡率分別為1.6%、4.9%、6.1%、11.1%、59.9%。BA對(duì)Bel-7402細(xì)胞和CNE細(xì)胞的凋亡有明顯的促進(jìn)作用，且呈劑量依賴性(P均<0.05)。

2.3HMEC細(xì)胞增殖抑制率比較BA濃度為5、10、20、30、40、50、60、80 mg/L時(shí)，Bel-7402細(xì)胞增殖抑制率分別為27.4%、55.9%、61.7%、69.5%、73.7%、78.2%、78.3%、79.1%，BA對(duì)HMEC細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用，且呈劑量依賴性(P均<0.05)。

2.4HMEC細(xì)胞遷移能力比較BA濃度為6.25、12.5、25、50 mg/L時(shí)，HMEC細(xì)胞遷移抑制率分別為3.7%、12.7%、13.0%、18.2%。BA對(duì)HMEC細(xì)胞遷移能力有明顯的抑制作用，且呈劑量依賴性(P均<0.05)。

2.5HMEC細(xì)胞血管形成能力比較加入0 mg/L BA的HMEC細(xì)胞形成了典型的細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)，內(nèi)皮細(xì)胞之間排列有序，組成一個(gè)個(gè)環(huán)狀管腔結(jié)構(gòu)；而加入6.25 mg/L BA時(shí)，血管形成受到抑制；當(dāng)BA濃度提高到12.5 mg/L時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞小管不能形成完整的環(huán)狀結(jié)構(gòu)；BA濃度為50 mg/L時(shí)，內(nèi)皮細(xì)胞幾乎無(wú)移動(dòng)，也不能形成管狀結(jié)構(gòu)。

3討論

1971年，F(xiàn)olkman[8,9]首次提出腫瘤生長(zhǎng)依賴于新血管生成的假說(shuō)，后來(lái)隨著毛細(xì)血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)的研究和血管生成劑的發(fā)現(xiàn)，腫瘤血管成為腫瘤治療的新靶點(diǎn)。腫瘤的生長(zhǎng)從無(wú)血管的緩慢生長(zhǎng)階段轉(zhuǎn)變?yōu)橛醒艿目焖僭鲋畴A段，血管生成使腫瘤細(xì)胞獲得足夠營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)而快速增殖，尋找一種能抑制腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移、血管生成的藥物成為腫瘤研究的熱點(diǎn)。中藥是我國(guó)的傳統(tǒng)醫(yī)藥庫(kù)，在腫瘤治療方面有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。BA是一種從白樺樹(shù)樹(shù)皮中提取的醇類化合物，能抑制上皮細(xì)胞和黑色素瘤細(xì)胞的增殖，對(duì)腫瘤細(xì)胞具有選擇性殺傷作用，是一個(gè)非常有前途的新化療藥物。Damle等[10]報(bào)道，BA能抑制MCF-7細(xì)胞的增殖、遷移，其IC50為13.5 mg/L，可延遲模型鼠腫瘤的形成。也有學(xué)者報(bào)道[11]，BA通過(guò)線粒體膜電位下降以及上調(diào)死亡受體等誘導(dǎo)了多種腫瘤細(xì)胞的凋亡。本研究顯示，BA在體外不僅抑制Bel-7402細(xì)胞、CNE細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，且呈明顯的劑量依賴性。腫瘤細(xì)胞的遷移活性是評(píng)價(jià)腫瘤惡化程度的最重要生物學(xué)指標(biāo)之一，也是影響腫瘤治療效果和預(yù)后判斷的重要因素[12]，因此抑制腫瘤的遷移是治療腫瘤的關(guān)鍵。本研究顯示，BA在體外抑制了HMEC細(xì)胞的增殖和遷移，而且隨BA濃度增加，其抑制作用增強(qiáng)。

Matrigel是一種由EHS小鼠肉瘤細(xì)胞分泌，富含各種促進(jìn)血管新生因子的細(xì)胞外基質(zhì)，可提供三維空間環(huán)境，便于內(nèi)皮細(xì)胞分化成類似新微血管網(wǎng)狀的管腔，模擬血管新生作用的過(guò)程。Matrigel實(shí)驗(yàn)表明，BA能抑制內(nèi)皮細(xì)胞管腔的形成，從而為誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、死亡及抑制腫瘤組織血管生成提供了有力佐證。我們前期實(shí)驗(yàn)[13]曾報(bào)道23-羥基白樺酸對(duì)HMEC細(xì)胞的作用，證實(shí)其有明顯體外抗血管生成作用。本研究說(shuō)明，BA也同樣具有體外抗血管生成作用，且抑制效果比23-羥基白樺酸更明顯。因此，BA體外可顯著抑制腫瘤細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，并且減弱細(xì)胞的遷移及抗血管生成的作用，其有可能成為一個(gè)具有較好應(yīng)用前景的抗腫瘤血管生成藥物。

參考文獻(xiàn)：

[1] 畢毅,徐進(jìn)宜,吳曉明.白樺酸類化合物的研究進(jìn)展[J].中國(guó)新藥雜志,2005,14(1):23-26.

[2] Reiner T, Parrondo R, de Las Pozas A, et al. Betulinic acid selectively increases protein degradation and enhances prostate cancer-specific apoptosis: possible role for inhibition of deubiquitinase activity[J]. PLoS One, 2013,8(2):e56234.

[3] 蔣孟軍,周堯遠(yuǎn),楊敏,等.白樺酸對(duì)人胰腺癌細(xì)胞增殖、遷移、細(xì)胞周期和凋亡的影響[J].中國(guó)中藥雜志,2010,35(22):3056-3059.

[4] 徐萍,周金培,徐進(jìn)宜,等.白樺酸類化合物抗腫瘤活性的研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥師,2006,9(2):172-174.

[5] 姜瑩.白樺脂酸的研究進(jìn)展及其應(yīng)用前景[J].黑龍江生態(tài)工程職業(yè)學(xué)院學(xué)報(bào),2010,23(4):32-33.

[6] Fulda S. Betulinic acid for cancer treatment and prevention[J]. Int J Mol Sci, 2008,9(6):1096-1107.

[7] Park SY, Kim HJ, Kim KR, et al. Betulinic acid, a bioactive pentacyclic triterpenoid, inhibits skeletal-related events induced by breast cancer bone metastases and treatment[J]. Toxicol Appl Pharmacol, 2014,275(2):152-162.

[8] Folkman J. Tumor angiogenesis: therapeutic implication [J]. New Engl J Med, 1971,285(21):1182-1186.

[9] Folkman J. Anti-angiogenesis: new concept for therapy of solid tumors[J]. Ann Surg, 1972,175(3):409-416.

[10] Damle AA, Pawar YP, Narkar AA. Anticancer activity of betulinic acid on MCF-7 tumors in nude mice[J]. Indian J Exp Biol, 2013,51(7):485-491.

[11] Chintharlapalli S, Papineni S, Ramaiah SK, et al. Betulinic acid inhibits prostate cancer growth through inhibition of specificity protein transcription factors[J]. Cancer Res, 2007,67(6):2816-2823.

[12] 孫紅,朱青,任娟,等.溶血磷脂酸對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖、黏附、遷移和凋亡的影響[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2009,25(8):702-705.

[13] 蔣孟軍,楊敏,周堯遠(yuǎn),等.23-羥基樺木酸體外抑制血管生成的實(shí)驗(yàn)研究[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志,2006,22(1):88-91.

Effects of Betulinic acid in vitro on proliferation and angiogenesis of human hepatocellular carcinoma cells and nasopharyngeal carcinoma cells

HUANGHeyun1,ZHOUYaoyuan,ZHANGRongjun,CAIGangming,GUXiaobo,PANDonghui,JIANGMengjun

(1JiangsuInstituteofNuclearMedicine,Jiangsu214063,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the effects of Betulinic acid (BA) in vitro on the proliferation and angiogenesis of tumor cells. MethodsThe human hepatocellular carcinoma cells (Bel-7402), human nasopharyngeal carcinoma cells (CNE) and human microcapillary endothelial cells (HMEC) were intervened by different concentrations of BA. The proliferation inhibition rates and apoptosis rates of Bel-7402 cells and CNE cells were compared. In addition, the proliferation inhibition rate, migratory ability and angiogenesis of HMEC cells were compared.Results BA inhibited the proliferation and promoted the apoptosis of Bel-7402 cells and CNE cells, which were in a dose-dependent manner (all P<0.05). BA also inhibited the proliferation and reduced the migratory ability and angiogenesis with a dose-dependent manner (all P<0.05).ConclusionBA can inhibit the proliferation and angiogenesis of human hepatocellular carcinoma cells and human nasopharyngeal carcinoma cells.

Key words:Betulinic acid; human hepatocellular carcinoma cells; human nasopharyngeal carcinoma cells; human vascular endothelial cells

(收稿日期:2015-09-13)

中圖分類號(hào)：R979.1

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1002-266X(2016)03-0005-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.03.002

通信作者簡(jiǎn)介：蔣孟軍(1972-)，男，本科，副研究員，主要研究方向?yàn)榧?xì)胞生物學(xué)與核醫(yī)學(xué)。E-mail： jmj16888@126.com

作者簡(jiǎn)介：第一黃荷云(1974-)，女，大專，主管藥師，主要研究方向?yàn)樗帉W(xué)。E-mail： whyjzx@126.com

基金項(xiàng)目：江蘇省衛(wèi)生廳基金資助項(xiàng)目(H200735)。