黃丹，李春梅，毛建文

(1廣東藥學(xué)院，廣州 510006；2廣東省生物活性藥物研究重點實驗室)

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腎上腺素對新生大鼠心肌細(xì)胞體積的影響及其作用機(jī)制

黃丹1,2，李春梅1，毛建文1,2

(1廣東藥學(xué)院，廣州 510006；2廣東省生物活性藥物研究重點實驗室)

摘要：目的觀察腎上腺素(Adr)對新生大鼠心肌細(xì)胞體積的影響，并探討其機(jī)制。方法 原代培養(yǎng)新生大鼠心肌細(xì)胞，分為觀察組和對照組，觀察組加入Adr(1 μmol/L)，對照組加入等體積PBS，培養(yǎng)48 h。采用CountStar自動細(xì)胞計數(shù)儀測量各組心肌細(xì)胞體積變化；熒光顯微鏡觀察心肌細(xì)胞氯通道蛋白3(ClC-3)熒光強(qiáng)度，在所有拍攝條件相同尤其是曝光時間相同的條件下對心肌細(xì)胞拍照，用Image Pro Plus分析軟件定量分析心肌細(xì)胞ClC-3的平均光密度(AOD)；Western blotting法檢測心肌細(xì)胞ClC-3。結(jié)果觀察組及對照組心肌細(xì)胞體積分別為(964.80±60.00)、(716.28±57.49) μm3，心肌細(xì)胞ClC-3的AOD分別為0.037±0.012、0.062±0.009，心肌細(xì)胞ClC-3的相對表達(dá)量分別為0.372±0.027、1.040±0.210，兩組比較，P均<0.05。結(jié)論 Adr能誘導(dǎo)新生大鼠心肌細(xì)胞肥大，其機(jī)制可能與下調(diào)ClC-3表達(dá)有關(guān)。

關(guān)鍵詞：腎上腺素；心肌細(xì)胞；氯通道蛋白3；動物實驗

心肌肥大是一種以心肌細(xì)胞體積增大為主要特征的緩慢而有力的代償形式，然而它不是無限度的，長期持續(xù)的心肌肥大將引起心室功能異常，可能導(dǎo)致患者心力衰竭而死亡[1~3]。腎上腺素(Adr)是腎上腺髓質(zhì)的主要激素，可與腎上腺素受體結(jié)合，介導(dǎo)兒茶酚胺作用，使心肌收縮力增強(qiáng)、傳導(dǎo)加速及心輸出量增多，長期反應(yīng)會引起心肌細(xì)胞體積增大[4,5]，但其機(jī)制尚不完全明確。氯通道蛋白3(ClC-3)是電壓門控的氯離子通道超級家族的一員，其參與細(xì)胞容積的調(diào)節(jié)，在維持細(xì)胞容積動態(tài)平衡中發(fā)揮重要作用[6,7]。本研究觀察了Adr對新生大鼠心肌細(xì)胞體積的影響，并探討其可能機(jī)制。

1材料與方法

1.1實驗動物及試劑1～3日齡SD新生大鼠10只，均購自廣州中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心。高糖DMEM培養(yǎng)基(Gibico公司)，F(xiàn)BS胎牛血清(Hyclone公司)，Adr、胰酶、脫脂奶粉(Sigma公司)，Tubulin抗體、鼠抗、兔抗(碧云天公司)，ClC-3抗體(Abcam公司)。

1.2新生大鼠心肌細(xì)胞培養(yǎng)、分組取SD新生大鼠10只，于75%乙醇中浸泡5～6 s迅速取出，用酒精棉球再次消毒胸腹部皮膚，剪開胸骨，擠出心臟。心臟用預(yù)冷的PBS洗兩次，去除殘留血液、結(jié)締組織、心房組織及部分血管，再于PBS中將心臟剪碎，用胰蛋白酶冰上消化20 min，后移至37 ℃恒溫磁力攪拌器上水浴，經(jīng)多次消化，新生大鼠心臟消化成單細(xì)胞懸液，差速貼壁1 h后，取上清，加入0.1 mmol/L的5-溴-2′-脫氧尿苷，抑制成纖維細(xì)胞生長。用含10%胎牛血清、1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，48 h后換無血清無雙抗培養(yǎng)基，饑餓細(xì)胞16～24 h，后隨機(jī)分為觀察組和對照組，觀察組加入Adr(1 μmol/L)，對照組加入等體積PBS。培養(yǎng)48 h。

1.3新生大鼠心肌細(xì)胞體積測量心肌細(xì)胞用PBS洗3次，用0.25%的胰酶消化細(xì)胞，終止消化后吹打混勻，加入CountStar細(xì)胞計數(shù)板中，每孔選擇3個視野測量細(xì)胞直徑，每組測量3次。

1.4新生大鼠心肌細(xì)胞ClC-3的平均光密度(AOD)分析吸棄培養(yǎng)基，PBS洗3次，固定15 min，吸除固定液，洗滌后加入封閉液，37 ℃下封閉1 h。加入ClC-3抗體(1∶100)4 ℃孵育過夜，移除抗體洗滌后加入ClC-3二抗，37 ℃孵育1 h，洗滌后DAPI染核，加入抗熒光淬滅劑，最后封片，用熒光顯微鏡觀察，在所有拍攝條件相同尤其是曝光時間相同的條件下拍照，所得圖片用Image Pro Plus分析軟件定量分析心肌細(xì)胞ClC-3的AOD。

1.5新生大鼠心肌細(xì)胞ClC-3檢測采用Western blotting法。提取心肌細(xì)胞總蛋白，用Qubit2.0熒光定量儀檢測蛋白，調(diào)整蛋白上樣量，SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)膜2 h，室溫封閉2 h后加入一抗(Tubulin，1∶1 000；ClC-3，1∶1 000)4 ℃孵育過夜。TBS/T漂洗后加入相應(yīng)二抗，室溫孵育1 h。顯影、定影后將膠片進(jìn)行掃描，用Image J分析軟件定量分析條帶，以灰度值表示所得結(jié)果。

2結(jié)果

2.1兩組新生大鼠心肌細(xì)胞體積變化觀察組及對照組心肌細(xì)胞體積分別為(964.80±60.00)、(716.28±57.49)μm3，兩組比較，P<0.05。

2.2兩組新生大鼠心肌細(xì)胞ClC-3的AOD比較觀察組及對照組心肌細(xì)胞ClC-3的AOD分別為0.037±0.012、0.062±0.009，兩組比較，P<0.05。

2.3兩組新生大鼠心肌細(xì)胞ClC-3的相對表達(dá)量比較觀察組及對照組心肌細(xì)胞ClC-3的相對表達(dá)量分別為0.372±0.027、1.040±0.210，兩組比較，P<0.05。

3討論

心血管疾病是威脅人類健康的常見疾病，而心肌肥大是其發(fā)病率和病死率升高的重要因素之一[8]。心肌細(xì)胞體積增大，由代償轉(zhuǎn)為失代償，最終可能導(dǎo)致患者因心力衰竭而死亡[9]。Adr是腎上腺髓質(zhì)嗜鉻細(xì)胞分泌的主要激素，屬于兒茶酚胺類[10]。研究[11]顯示，交感-兒茶酚胺系統(tǒng)參與高血壓左室肥厚的形成。文獻(xiàn)[12]報道，兒茶酚胺能夠直接導(dǎo)致心肌肥大，促進(jìn)肌球蛋白表達(dá)。另有研究[13]表明，在肥大心肌中，兒茶酚胺的合成減少而消耗增多。Adr與心肌肥大的形成有一定聯(lián)系，但其具體機(jī)制目前尚不完全明確。

ClC-3主要存在于細(xì)胞器膜、突出囊泡、內(nèi)體等[14]，參與細(xì)胞的容積調(diào)節(jié)，被認(rèn)為是容積調(diào)節(jié)性氯通道的候選蛋白之一，細(xì)胞內(nèi)Cl-向細(xì)胞外轉(zhuǎn)運(yùn)能影響細(xì)胞容積調(diào)節(jié)。當(dāng)細(xì)胞發(fā)生腫脹后，容積激活性氯通道開放，Cl-外流，同時K-外流，滲透作用導(dǎo)致水分子外流，從而使細(xì)胞容積恢復(fù)[15]。除了參與細(xì)胞容積調(diào)節(jié)外，ClC-3還參與細(xì)胞電活動性、增殖、分化、遷移、凋亡和細(xì)胞內(nèi)pH值調(diào)節(jié)[16]。最近研究[17]表明，ClC-3在心血管系統(tǒng)中如房室心肌細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞中也有豐富的表達(dá)[18,19]。用β-腎上腺素受體激動劑除了激活心肌細(xì)胞β-腎上腺素受體外，還能激活心肌氯通道[20]，在心肌肥厚、高血壓、心肌缺血/再灌注、心臟衰竭中起重要作用。研究[21,22]發(fā)現(xiàn)，心臟特異性敲除ClC-3基因會導(dǎo)致成年鼠心肌肥大，提示ClC-3與心肌肥厚的發(fā)生有一定聯(lián)系。本研究顯示，觀察組心肌細(xì)胞體積大于對照組，ClC-3的AOD、相對表達(dá)量降低，提示使用Adr后，心肌細(xì)胞內(nèi)的某些基因或蛋白質(zhì)表達(dá)量發(fā)生改變，從而引起一系列生化反應(yīng)，最終導(dǎo)致心肌細(xì)胞肥大，而ClC-3能夠參與細(xì)胞的容積調(diào)節(jié)，可能通過影響細(xì)胞內(nèi)氯電流導(dǎo)致心肌細(xì)胞體積的增加。

總之，Adr能誘導(dǎo)新生大鼠心肌細(xì)胞肥大，其機(jī)制可能與下調(diào)ClC-3表達(dá)有關(guān)。

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Effect of adrenaline on volumes of cardiomyocytes in neonatal rats and its mechanism

HUANGDan1,LIChunmei,MAOJianwen

(1GuangdongPharmaceuticalUniversity,Guangzhou510006,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the effect of adrenaline (Adr) on volumes of cardiomyocytes in neonatal rats and to investigate its mechanism. MethodsThe cardiomyocytes of neonatal rats were cultured in vitro and were divided into the observation group which was added with 1 μmol/L Adr for 48 h and the control group which was added with the same volumes of PBS for 48 h. The volume of cells were measured by CountStar. The fluorescence intensity of chloride channel protein 3 (ClC-3) protein was detected by immunofluorescence. The average optical density (AOD) of ClC-3 was measured by Image Pro Plus or Image J software. Western blotting was used to detect ClC-3. ResultsThe volume of cardiomyocytes in the observation group and the control group was (964.80±60.00) and (716.28±57.49) μm3respectively. The AOD in the two groups was 0.037±0.012 and 0.062±0.009. The ClC-3 protein expression in the two groups was 0.372±0.027 and 1.040±0.210. Significant difference was found between these two groups (all P<0.05).ConclusionAdr can induce the cardiac hypertrophy of neonatal rats, and the mechanism may be related with the down-regulated expression of ClC-3.

Key words:epinephrine; myocardial cells; chloride channel protein 3; animal experimentation

(收稿日期:2015-09-10)

中圖分類號：R364.3

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)03-0020-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.03.007

通信作者簡介：毛建文(1975-)，男，教授，主要研究方向為離子通道轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)。E-mail: jianwenmao@hotmail.com

作者簡介：第一黃丹(1991-)，女，碩士在讀，主要研究方向為心血管藥理。E-mail: huangdan_2009@163.com

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目(31500926)；廣東省自然科學(xué)基金資助項目(2014A030310023)。