唐寅思，曹蓉，翁洋，李春麗，溫艷惠，周一軍

（1中國醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院，沈陽110032；2遼寧省腫瘤醫(yī)院）

幽門螺桿菌陽性患者胃黏膜組織中NOD1受體的表達變化

唐寅思1，曹蓉2，翁洋1，李春麗1，溫艷惠1，周一軍1

（1中國醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院，沈陽110032；2遼寧省腫瘤醫(yī)院）

目的 觀察幽門螺桿菌陽性患者胃黏膜組織中NOD1受體的表達變化。方法 選擇病理組織標本120例，其中Hp陽性90例（胃癌組30例、癌前病變組30例、胃炎組30例）、Hp陰性30例（胃炎，對照組），采用免疫組化法檢測各組NOD1受體表達，采用RT-PCR法檢測各組NOD1受體mRNA表達。結果 與對照組比較，其他三組NOD1陽性表達率、NOD1 mRNA相對表達量均升高（P均＜0.05）；且胃癌組NOD1陽性表達率、NOD1 mRNA相對表達量最高，與其他兩組比較差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。結論 幽門螺桿菌陽性患者胃黏膜組織中NOD1受體高表達，且組織病理類型惡性程度越高，NOD1受體表達水平越高。

幽門螺桿菌；核苷酸結合寡聚化結構域樣受體；胃腫瘤；胃炎；癌前病變

幽門螺桿菌（Hp）感染已經被證明與多種消化系統(tǒng)疾病相關，如消化道潰瘍、胃炎、胃惡性腫瘤、炎癥性腸病、食道炎、胃黏膜相關淋巴組織淋巴瘤、功能性消化不良等，然而其致病機制還未完全闡明，目前得到公認的學說有四種，其中免疫學說越來越受到重視［1］。模式識別受體（PRRs）是通過與病原相關分子模式相結合的方式來識別外源性病原微生物，并將其清除，從而介導天然免疫［2］。近年來關于核苷酸結合寡聚化結構域樣（NOD）受體的研究在國內外均有相關報道。NOD1受體廣泛表達于成人的組織細胞中，它可以識別細菌的成分（肽聚糖），活化核因子κB（NF-κB），參與固有免疫并誘導炎癥反應的發(fā)生和細胞凋亡［3］。NOD1受體是否在Hp感染的過程中發(fā)揮作用，目前尚不清楚。2014年3月～2015年5月本研究觀察Hp感染患者胃黏膜組織中NOD1受體的表達情況，探討NOD1介導的信號通路在Hp感染中的作用。

1　資料與方法

1.1臨床資料 病理組織標本均來源于中國醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院內鏡中心及病理科，共120例，患者男56例、女64例，年齡30～84歲、平均52歲。經快速尿素酶試驗及病理檢查證實Hp陽性90例，根據(jù)病理檢查結果分為胃癌組30例、癌前病變組30例、胃炎組30例；Hp陰性30例作為對照組，病理檢查結果為胃炎。各組患者性別、年齡比較差異無統(tǒng)計學意義。排除標準：慢性疾病及其他惡性腫瘤（不包括胃癌）患者；妊娠期婦女；甲狀腺功能亢進或減退者；飲酒者；應用降脂藥、口服避孕藥及激素者；4周內使用影響Hp的藥物，如抗生素、質子泵抑制劑、氫受體拮抗劑、非甾體抗炎藥、鉍劑等。

1.2各組NOD1受體表達檢測 采用免疫組織化學染色法。病理組織用甲醛固定，石蠟包埋，步驟按試劑盒說明書進行。胞質內出現(xiàn)淺黃色、棕黃色、棕褐色染色提示陽性。采用半定量積分法判斷結果［4］：每例切片觀察5個高倍鏡視野，每視野觀察100個細胞，觀察陽性細胞占總細胞的百分比和染色程度。陽性細胞百分比＜30%計0分，30%～60%計1分，61%～90%計2分，＞90%計3分；染色程度：未染色計0分，淺黃色計1分，棕黃色計2分，棕褐色計3分；以上兩項乘積≥1為NOD1受體陽性表達。

1.3各組NOD1受體mRNA表達檢測 采用RTPCR法。用TRIzol提取總RNA，應用Oligo（dT）引物和逆轉錄酶將RNA逆轉錄為cDNA，然后用RNA酶處理產物。設計特異性引物用于擴增NOD1。其正向引物：5′-AAGCATTTCTGCTACCCGGAG-3′，反向引物：5′-AAGCATTTCTGCTACCCGGAG-3′；GAPDH內參正向引物：5′-ACCTCAGTCAATGGCATCGC-3′，反向引物：5′-TACACCACTCTGGTGCCGTG-3′。通過Light Cycler軟件直接獲得各樣本中NOD1受體mRNA的Ct值，與同樣本中內參的Ct值相減，即獲得該樣本中NOD1受體mRNA的ΔCt值，根據(jù)2-ΔΔCt公式計算目的基因相對表達量

1.4統(tǒng)計學方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。計量資料用±s表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗；計數(shù)資料比較采用χ2檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.1各組NOD1陽性表達率比較 胃癌組、癌前病變組、胃炎組、對照組NOD1陽性表達率分別為90%（27／30）、67%（20／30）、53%（16／30）、17%（5／30）；與對照組比較，其他三組NOD1陽性表達率均升高（P均＜0.05）；胃癌組、癌前病變組、胃炎組NOD1陽性表達率比較差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。

2.2各組NOD1 mRNA表達比較 胃癌組、癌前病變組、胃炎組、對照組NOD1 mRNA相對表達量分別為0.64±0.26、0.54±0.27、0.47±0.26、0.28± 0.17；與對照組比較，其他三組NOD1 mRNA相對表達量均升高（P均＜0.05）；胃癌組、癌前病變組、胃炎組NOD1 mRNA相對表達量比較差異有統(tǒng)計學意義（P均＜0.05）。

3　討論

固有免疫反應是機體抵御外來病原生物入侵的第一道防線。與固有免疫相關的PRRs中，Toll樣受體家族主要識別細菌、病毒、真菌和原生動物，而NLRs主要介導抗細菌感染。目前已鑒定出多種不同的炎癥復合體，包括NOD。NOD樣受體是一類在遺傳上高度保守的蛋白質家族，廣泛存在于植物、線蟲、脊椎動物和人類細胞內，是一種細胞內識別受體［5］。NOD樣受體家族中包括5個成員，其中最具代表性的是NOD1和NOD2（分別稱為CARD4和CARD15）。NOD1和NOD2可識別細菌細胞壁中的脂多糖和肽聚糖，并依靠其CARD募集受體相互作用蛋白激酶（RIP）家族成員中的受體相互作用蛋白2（RIP2），從而使絲裂原活化蛋白激酶（MAPKs）［6］和NF-κB活化［7］。活化的NF-κB可結合許多蛋白質基因的啟動子和增強子部位的κB序列，從而誘導細胞因子、生長因子、急性期蛋白、趨化因子、免疫受體和轉錄因子等多種物質的表達。相關研究已經表明，NOD1受體與感染、慢性炎癥性疾病、腫瘤（包括白血?。⒋x紊亂及自身免疫性疾病相關［8］。

目前關于Hp感染導致消化系統(tǒng)疾病的發(fā)病機制有幾種學說［1］，即漏頂學說、促胃液素聯(lián)系學說、基因學說和免疫學說；其中對免疫學說的研究近年來比較廣泛，該觀點認為作為一種長期定植于人體胃黏膜表面的細菌。Hp可通過多種細菌的黏附、毒力因子對黏膜細胞的直接損傷以及機體對細菌的免疫反應而導致的免疫和（或）炎癥組織損傷等機制而引起消化性潰瘍、慢性胃炎、胃癌、胃黏膜相關淋巴組織淋巴瘤的發(fā)生。Hp感染后，宿主的免疫應答反應在胃黏膜炎癥和損害方面也起著一定的作用。局部的細胞免疫和體液免疫反應，激活T細胞、巨噬細胞和補體反應，使中性粒細胞和單核細胞釋放IL-2、IL-6以及激活氧自由基和一氧化氮的釋放，導致炎癥和細胞損傷?，F(xiàn)已有研究證實，NOD1參與介導Hp感染性胃病，從不同層面證實了兩者具有相關性。其中Wang等［9］研究認為，在中國漢族人群中，NOD1基因多態(tài)性與胃癌發(fā)病相關。Kim等［10］研究認為，NOD1（796G＞A）單核苷酸改變與韓國地區(qū)Hp相關性胃病發(fā)病有相關性；Oikawa等［11］研究認為，日本人中NOD1基因多態(tài)性與糜爛性食管炎發(fā)病有相關性?；诩毎降难芯孔C明，NOD1信號通路在Hp感染中得以激活，從而介導了其相關疾病的發(fā)病及進展［12］；除此之外，以動物（小鼠）為研究對象的一些國內外報道也證實了上述觀點，通過Hp感染小鼠模型，驗證NOD1與Hp感染相關胃病的發(fā)病具有相關性［13］；且已有許多下游的細胞因子（如IL-18、IL-33等）被證實通過調控NOD1信號通路影響其表達水平。但通過人組織病理為實驗材料的相關實驗的研究相對較少。

本研究在RT-PCR和免疫組化兩項實驗中均得到相同提示：對照組與胃炎組中mRNA表達及NOD1受體的表達均存在差異，且其差異有統(tǒng)計學意義，表明NOD1受體可能參與介導了Hp感染相關疾病。胃癌組、癌前病變組、胃炎組之間NOD1 mRNA表達及NOD1受體的表達均存在統(tǒng)計學差異，表明組織病理惡性程度不同，NOD1受體表達情況也不相同。提示Hp感染后的胃炎、癌前病變及胃癌的胃黏膜組織中，在不同病理階段其表達程度存在差異，即NOD1受體介導的信號傳導通路對胃黏膜造成損傷在不同病理階段產生不同程度的作用。

本研究結果說明，NOD1受體的表達與Hp感染情況相關，即NOD1信號通路在Hp感染中得以激活。NOD1受體及其信號轉導過程和表達在Hp相關胃病中的研究有助于完善對Hp感染發(fā)病機制的探索，可能為Hp感染相關胃病的治療提供新的靶點，有希望為疫苗研制提供可行性思路；NOD1受體陽性表達對胃癌癌前病變黏膜組織的動態(tài)監(jiān)測可能成為胃癌診治的新方向。未來隨著更多的PRRs的發(fā)現(xiàn)及其識別機制的闡明，將促進更多的新型藥物問世，從而為人類戰(zhàn)勝更多疾病提供強有力武器。

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10.3969／j.issn.1002-266X.2016.21.032

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1002-266X（2016）21-0079-03

周一軍（E-mail：zhoudoctor＠163.com）

（2015-08-27）