王 安，譚 波 綜述，王 躍△ 審校

(1.四川醫(yī)科大學研究生院2013級，四川 瀘州 646000；2.四川省醫(yī)學科學院.四川省人民醫(yī)院骨科，四川 成都 610072)

△通訊作者

液氮冷凍制備犬早期股骨頭壞死模型研究進展

王 安1，譚 波2綜述，王 躍2△審校

(1.四川醫(yī)科大學研究生院2013級，四川 瀘州 646000；2.四川省醫(yī)學科學院.四川省人民醫(yī)院骨科，四川 成都 610072)

隨著MRI技術(shù)的進一步發(fā)展使得股骨頭壞死的早期診斷成為可能，青壯年因股骨頭壞死而行人工髖關(guān)節(jié)置換術(shù)的失敗率比因其他原因而行關(guān)節(jié)置換的病例高，故在采用人工關(guān)節(jié)置換術(shù)之前，應選擇保留股骨頭的姑息性治療以延緩或替代髖關(guān)節(jié)置換。如何在軟骨下骨塌陷之前阻止病程進展。股骨頭壞死動物模型的建立是否成功對實驗結(jié)果的可靠性有著重要意義。本文就近年來國內(nèi)外動物模型制作的方法進行綜述 。

股骨頭壞死；動物模型；研究進展

股骨頭壞死(osteonecrosis of femoral head，ONFH)是一種進展性疾病，往往會在患者20～50歲這一階段癥狀明顯，影響生活質(zhì)量[1]。據(jù)估計，在美國每年有10000～20000名新發(fā)病例，如果不給予治療，將逐步導致髓關(guān)節(jié)的完全破壞。MRI技術(shù)的進步使得股骨頭缺血性壞死的早期診斷成為可能，還可以通過無創(chuàng)手段準確地進行分期并確定壞死范圍。這樣可以發(fā)現(xiàn)早期病變，很多治療方法都是在疾病早期更有效。骨壞死在軟骨下骨塌陷之前早期自然進程尚不清楚，但有證據(jù)表明其進展很快，特別是有癥狀的患者。無癥狀的骨壞死患者若病變范圍小于股骨頭的30%，那么95%的患者可以繼續(xù)維持無癥狀達5年以上；但隨著病變范圍的增加，骨壞死患者出現(xiàn)疼痛癥狀的百分比增加。一旦發(fā)生軟骨下骨塌陷、關(guān)節(jié)間隙消失，進行性骨關(guān)節(jié)炎就不可避免。許多研究證明本病預后很差，有癥狀的患者(Ⅰ或Ⅱ期)2年后股骨頭塌陷率極高[3]。所以建立股骨頭壞死動物模型對研究ONFH的預防措施、發(fā)病機制、治療策略都有著重要的意義。

1 液氮冷凍制備犬股骨頭壞死模型特征、基本原理及病理基礎

理想的股骨頭缺血性壞死動物模型除了要求與人類的股骨頭缺血性壞死有相似性和可比性外，還應具備以下幾個特征: ①符合人類股骨頭壞死病變的病理過程； ②模型有良好的可重復性； ③動物的解剖和生理特點盡可能與人類相似； ④經(jīng)濟可行[4]。靈長類動物解剖及生理特點與人類近似，是制造股骨頭缺血性壞死模型最理想的動物。但是由于靈長類動物存在馴養(yǎng)困難、費用昂貴、實驗周期較長等問題，影響了它們的使用。而犬的解剖和生理特點與人類相似、溫順聽話、費用適中、實驗周期短[5]。

其理論依據(jù)主要包括兩個方面：首先液氮冷凍可直接損傷骨細胞、骨髓間充質(zhì)細胞；其次低溫造成血管痙攣、血管內(nèi)皮細胞受損、血管內(nèi)凝血、血管通透性增加，繼而發(fā)生出血和復溫后的缺血再灌注損傷，進一步誘發(fā)血栓形成，冷凍區(qū)域血供減少，加重骨細胞的損傷、骨質(zhì)的壞死[6]。髖關(guān)節(jié)脫位會進一步傷害股骨頭周圍的血管，就更像人類的ONFH的過程[7]。通過研究發(fā)現(xiàn)脫位和液氮制冷相結(jié)合的方法有兩個主要優(yōu)勢：首先，它沒有殘留的化學物質(zhì)，也不會影響細胞動脈灌注治療期間，這是不同于其他化學方法；第二，它有短時間模型建立，成功率高、死亡率低的動物和良好的重現(xiàn)性。液體氮和位錯導致完整的股骨頭壞死瞬變，同時允許逐步修復過程，適用于我們的血管修復和血管生成研究股骨壞死的頭上。然而，狗作為ONFN的動物模型有不同于人類固有生物力學特性的缺點。因為狗是一種四足動物，它可以改變負載的四肢，然后改變機械環(huán)境機制過程中骨修復[8]。徐俊等[9]將克氏針固定于犬的腕掌關(guān)節(jié)，并將克氏針埋于皮下，使犬適應三足行走，建立三足動物模型，使其骸關(guān)節(jié)機械應力符合人類病理過程。

2 液氮冷凍建立犬股骨頭壞死模型制備方法

液氮冷凍制備犬股骨頭壞死模型大體可分為三種:骨外部分冷凍、骨外全頭冷凍、骨內(nèi)冷凍，同時伴或不伴股骨頭脫位及其周圍血管破壞。這三種方法對與犬股骨頭壞死骨內(nèi)外損失各有優(yōu)缺點，不同的實驗對與犬模型的選擇也有所差異。

2.1 骨外部分冷凍制備犬股骨頭壞死模型 即為使用浸過液氮的棉簽或紗布接觸動物股骨頭負重區(qū)表而，冷凍損傷由軟骨而向骨質(zhì)深而傳導。早在20世紀80年代Takaoka[10]就成功采用液氮冷凍法建立動物模型，其后液氮冷凍法被國內(nèi)外學者廣泛用于不同的研究[11，12]。顧曉峰等[13]采用12只健康成年犬，剪斷圓韌帶脫出股骨頭頸，用浸透液氮棉球或紗布濕敷股骨頭，時間為3 min。第7周可見承重區(qū)略有塌陷，于11周X射線發(fā)現(xiàn)股骨頭負重區(qū)軟骨下骨明顯囊性變及承重部軟骨明顯塌陷，但軟骨面完整，病理切片示造模術(shù)后11周見致密結(jié)締組織，伴有骨樣組織出現(xiàn)。

單純冷凍比較適用于較小的動物[14，15]，但體型較大的動物，仍難以模擬出十分理想的股骨頭缺血性壞死動物模型。顧曉峰等采用液氮冷凍法結(jié)合血管破壞法的優(yōu)點，所需時間短，壞死塌陷成功率高，動物死亡率低，但股骨頭修復組織是一種不夠成熟的骨組織，其機械強度較差，在 “爬行替代” 的過程中容易在負重部位發(fā)生塌陷，可用于模擬壞死晚期臨床治療和刮除死骨后的植骨研究。想模擬早期股骨頭壞死，還有待對冷凍時間和血管破壞程度等方法進一步研究。

2.2 骨外全頭冷凍制備犬股骨頭壞死模型 通過剪斷圓韌帶完全暴露股骨頭，周圍用干紗布充填，以保護股骨頭周圍組織，再用液氮完全浸泡股骨頭。朱建龍等[16]采用暴露股骨頭，股骨頭周圍用干紗布充填，以保護股骨頭周圍組織。用一鐵制漏斗套于股骨頭，將100～150 ml液態(tài)氮倒入漏斗內(nèi)，并維持冷凍3 min，用37 ℃溫鹽水將股骨頭復溫。造模后4周可見實驗側(cè)股骨頭內(nèi)于T1W上出現(xiàn)均質(zhì)低信號，T2W信號升高，STIR信號升高更為明顯，呈散在、點狀分布于股骨頭內(nèi)，關(guān)節(jié)腔內(nèi)可見少量關(guān)節(jié)積液； 股骨頭形態(tài)規(guī)則，邊緣光滑，大小與對側(cè)正常的股骨頭一致。造模后8周實驗側(cè)股骨頭內(nèi) T1W 低信號，T2W略高信號，STIR略高信號； 關(guān)節(jié)腔內(nèi)積液，股骨頭邊緣不規(guī)則，變扁，變小，股骨頭碎裂明顯塌陷。張怡元等[17]采用此方法行實驗研究，術(shù)后4周模型組呈早期ONFH表現(xiàn)，股骨頭外形規(guī)則，股骨頭區(qū)密度降低，髖關(guān)節(jié)結(jié)構(gòu)尚好。術(shù)后8周模型組壞死骨質(zhì)范圍有所增加，股骨頭區(qū)密度進一步降低，出現(xiàn)囊性改變。術(shù)后12周模型組出現(xiàn)瘢痕軟化，MRI信號持續(xù)減弱。術(shù)后24周模型組呈明顯ONFH表現(xiàn)，股骨頭區(qū)域密度不均一，負重區(qū)存在囊性改變，股骨頭塌陷。

此類方法經(jīng)過改良避免了原方法因紗布塊與股骨頭凍結(jié)造成即刻的股骨頭軟骨面人為損傷。液氮直接浸泡股骨頭部位冷凍效果可靠，冷凍時間可控性強，由于縮短了冷凍時間，并且周圍襯以泡沫保護，有效減少了周圍組織的副損傷。但破壞了股骨頭幾乎全部血液供應，修復反應受到抑制，在外力的作用下。壞死區(qū)支撐力不足，軟骨發(fā)生塌陷，快速出現(xiàn)典型的股骨頭缺血性壞死塌陷模型，也可用于模擬壞死晚期臨床治療，通過劉國柱等改良后，可延緩塌陷時間，仍難以符合早期股骨頭壞死模型標準。

2.3 骨內(nèi)冷凍凍制備犬股骨頭壞死模型 通過不破壞圓韌帶顯露股骨頭通過大轉(zhuǎn)子或頭頸交界轉(zhuǎn)孔，將液氮注入，從骨內(nèi)進行冷凍。龔躍昆等[18，19]采用雙側(cè)髖關(guān)節(jié)外側(cè)切口，剝離軟組織，顯露股骨頭。 在股骨頭頭頸交界處鉆孔，刮除約50%的松質(zhì)骨。用干紗布保護周圍軟組織，用漏斗將液氮灌入股骨頭髓芯并維持1 min，待股骨頭自然復溫后復位。術(shù)后3、6及12周都未出現(xiàn)股骨頭脫位，股骨頭表面光滑、無塌陷、外形規(guī)則，關(guān)節(jié)液數(shù)量及顏色未發(fā)現(xiàn)明顯異常。組織學表現(xiàn)在術(shù)后3及6周時原缺損區(qū)內(nèi)及軟骨下骨的壞死骨小梁的髓腔內(nèi)纖維組織長入，結(jié)締組織內(nèi)間充質(zhì)細胞含量極少；術(shù)后12周缺損區(qū)為致密結(jié)締組織，伴有骨樣組織出現(xiàn)，與缺損壁結(jié)合疏松，缺損壁硬化骨形成。

此類方法既避免軟骨面人為損傷又加強對股骨頭血供破壞的可選擇性，術(shù)后12周無塌陷且外形規(guī)則，股骨頭骨缺損仍然存在，進一步證明所建立的液氮冷凍犬股骨頭缺損壞死可作為模擬臨床股骨頭早期壞死，對植骨及多孔棒等治療的研究提供動物模型。

2.4 冷凍制備犬股骨頭壞死模型進展 徐俊等[20]通過計算機輔助采用FLUENT6.2 軟件對探針置入股骨頭后內(nèi)部溫度場分布進行三維有限元分析，設計出可最大化ONFH面積，最小化周圍組織損傷的低溫手術(shù)。在C臂X射線機引導下，自股骨大粗隆向股骨頭打直徑2.5 mm骨隧道，至關(guān)節(jié)軟骨面下2 mm。骨隧道置入特制探針，同時置熱電偶于股骨頭表面，透視確認位置滿意后，0.5 MPa液氮冷凍6.5 min，復溫5 min至2 ℃，再次冷凍6.5 min。取出探針，骨蠟封閉骨槽，關(guān)閉傷口。于術(shù)后1 周后病理組織學觀察，實驗組股骨頭髓腔內(nèi)有核細胞死亡，局部血管破裂。術(shù)后8周未見明顯變形，術(shù)后12周的X射線片和MRI均顯示股骨頭輕度變形，囊性變，股骨頭內(nèi)部密度不均，呈典型的 Ficat Ⅲ期改變。Wang D等[21，22]使用氫氦刀靶向冷凍系統(tǒng)制備犬股骨頭壞死模型，是一種微創(chuàng)低溫冷凍消融腫瘤的醫(yī)療設備。它通過MRI進行定位引導，將氫氣刀準確穿刺進入到組織內(nèi)，然后啟動氫氣，氫氣在刀尖可迅速冷卻至-170～-140 ℃。將該系統(tǒng)應用到制備動物股骨頭壞死模型上，可在不脫位髓關(guān)節(jié)的情況下，通過MRI引導下準確定位股骨頭區(qū)域，對該區(qū)域?qū)嵭欣鋬鲆粡蜏?，徹底摧毀骨質(zhì)細胞和血管從而造成股骨頭壞死，同時采用12只健康成年犬進行實驗，造模后8周未出現(xiàn)塌陷，在造模后12周X射線和MRI出現(xiàn)囊性變及塌陷等壞死表現(xiàn)。官建中等[23，24]通過建立幼犬股骨頭壞死模型模擬兒童股骨頭壞死(Perthes病)。采用10只1月齡健康雜種犬，手術(shù)脫出股骨頭，再用相當于花生米大小的紗布團蘸液氮即刻冷凍股骨頭上端，持續(xù)10s，然后用溫鹽水復溫，反復2～3次，術(shù)后8周出現(xiàn)較為典型股骨頭壞死表現(xiàn)?？勺鳛槟M臨床手術(shù)清除死骨、植骨治療研究的動物模型，較其他方法制備的模型更適合于Perthes病治療的研究。

3 小結(jié)與展望

綜上所述，液氮骨內(nèi)冷凍可以較好模擬人類早期股骨頭壞死，此方法可在不損失股骨頭表面軟骨情況下制備犬股骨頭壞死，同時最大程度減速周圍組織的破壞，為選擇性血管結(jié)扎提供基礎?？傮w來說，目前冷凍制備犬股骨頭壞死模型向兩個方向發(fā)展:第一，對冷凍器械進行改造，使液氮法制備犬股骨頭壞死更加精細化、定量化、標準化。第二，根據(jù)不同的病理階段或治療方法制定相應的壞死模型，使液氮法制備犬股骨頭壞死更加特異化。目前股骨頭壞死模型整體研究為符合人類生物力學開始向雙足動物[25，26]發(fā)展，股骨頭塌陷的實質(zhì)是一種生物力學現(xiàn)象，當股骨頭承受的壓力超過了骨結(jié)構(gòu)生理負荷時，塌陷不可避免，不太適合早期股骨頭壞死模型。所以在建模過程中要根據(jù)實驗設計的特異性、結(jié)合生物力學及壞死病變演變的不同時期選擇不同模型，是實驗最終結(jié)果可靠性的前提，從而更貼近于臨床實際，才能為臨床治療早期股骨頭壞死提供可靠治療方案。

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Research progress on the model of canine early stage femoral head necrosis by liquid nitrogen freezing

WANG An，TAN Bo，WANG Yue

R681.8

B

1672-6170(2016)02-0165-03

2015-09-17；

2015-12-20)