楊曉云，劉蕊，穆小燕

(1 天津醫(yī)科大學(xué)，天津300070；2天津市人民醫(yī)院)

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實時熒光定量PCR法鑒定耐甲氧西林金黃色葡萄球菌效果觀察

楊曉云1，2，劉蕊2，穆小燕2

(1 天津醫(yī)科大學(xué)，天津300070；2天津市人民醫(yī)院)

摘要：目的探討實時熒光定量PCR法鑒定耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的效果。方法 采用實時熒光定量PCR法檢測131例金黃色葡萄球菌感染患者送檢標(biāo)本中nuc基因和mecA基因的表達(dá)情況。nuc基因陰性且mecA基因陽性者判定為耐甲氧西林凝固酶陰性葡萄球菌(MRCNS)，nuc基因陽性且mecA基因陰性者判定為甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(MSSA)，nuc、mecA基因共同陽性者判定為MRSA。藥敏試驗檢測結(jié)果MRCNS感染25例、MSSA感染66例、MRSA感染40例。結(jié)果131例患者送檢標(biāo)本中nuc基因陽性106例、mecA基因陽性85例，其中MRSA 60例、MRCNS 25例、MSSA 46例。20例藥敏試驗檢測為MSSA患者的送檢標(biāo)本中檢出mecA基因，將其判定為MRSA。結(jié)論 實時熒光定量PCR法檢測MRSA的效果優(yōu)于藥敏試驗。

關(guān)鍵詞：耐甲氧西林金黃色葡萄球菌；nuc基因；mecA基因

耐甲氧西林金黃色葡萄球(MRSA)已成為導(dǎo)致醫(yī)院和社區(qū)感染的重要病原菌，快速、準(zhǔn)確地檢出MRSA有極其重要的臨床意義[1，2]。nuc基因為金黃色葡萄球菌的標(biāo)志性基因。MRSA的耐藥機制主要由mecA基因決定，此基因負(fù)責(zé)編碼特異性青霉素結(jié)合蛋白(PBP2a)，從而使MRSA對所有β-內(nèi)酰胺類抗菌藥物具有耐藥性。美國臨床試驗室標(biāo)準(zhǔn)化委員會(NCCLS)建議，凡檢出mecA基因的金黃色葡萄球菌即可判定為MRSA[3]。2013年7月～2014年9月，我們采用實時熒光定量PCR法檢測了131例金黃色葡萄球菌感染患者送檢標(biāo)本中的nuc、mecA基因表達(dá)情況，觀察其診斷MRSA的效果?，F(xiàn)報告如下。

1資料與方法

1.1臨床資料納入標(biāo)本來自131例患者，其中男71例、女60例，年齡3個月～92歲。送檢科室包括ICU、兒科、外科、神經(jīng)外科、血管外科、肛腸科、骨科、婦科、泌尿科、耳鼻喉科、皮膚科。標(biāo)本類型包括痰、鼻咽拭子、傷口或泌尿生殖道分泌物、尿液。

1.2藥敏試驗鑒定 采用VITEK-Ⅱ全自動微生物分析系統(tǒng)鑒定131例患者送檢標(biāo)本，操作按說明書進(jìn)行。用實驗室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(CLSI)2013和歐洲抗菌藥敏試驗委員會(EUCAST)藥敏標(biāo)準(zhǔn)判定細(xì)菌類別。用ATCC29213為敏感株。

1.3實時熒光定量PCR法鑒定采用Taqman探針和實時熒光定量PCR法檢測131例患者送檢標(biāo)本金黃色葡萄球菌中nuc基因和mecA基因,操作嚴(yán)格按試劑盒說明書進(jìn)行。nuc基因陰性且mecA基因陽性者為耐甲氧西林凝固酶陰性葡萄球菌(MRCNS)，nuc基因陽性且mecA基因陰性者為甲氧西林敏感金黃色葡萄球菌(MSSA)，nuc、mecA基因共同陽性者為MRSA。

2結(jié)果

131例患者送檢標(biāo)本中，經(jīng)細(xì)菌培養(yǎng)和藥敏試驗鑒定MRCNS 25例、MSSA 66例、MRSA 40例。實時熒光定量PCR法檢測nuc基因陽性106例，mecA基因陽性85例；其中MRSA 60例，MRCNS 25例，MSSA 46例。20例藥敏試驗檢測為MSSA患者的送檢標(biāo)本中檢出mecA基因，將其列為MRSA。

3討論

目前，MRSA已成為國內(nèi)外院內(nèi)感染的首要致病菌，與HBV、HIV并列為世界范圍的三大難題[4~7]。MRSA 的耐藥機制主要為耐藥島，其中MRSA 對甲氧西林耐藥的編碼基因mecA位于金黃色葡萄球菌mec基因盒上，mecA基因表達(dá)的PBP2a蛋白在細(xì)菌耐藥中起關(guān)鍵作用。mecI和mecR1是一對在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控mecA基因轉(zhuǎn)錄的調(diào)節(jié)基因，位于mecA基因的啟動子上游。在無抗生素刺激的情況下，mecI 所編碼產(chǎn)生的mecI蛋白結(jié)合在mecA基因的啟動子部位，使得mecA 基因表達(dá)處于抑制狀態(tài)。但是，當(dāng)環(huán)境中存在相應(yīng)抗生素(如青霉素、苯唑西林等)時，抗生素一方面攻擊正常PBPs的轉(zhuǎn)肽酶功能域，使其失去活性而喪失合成細(xì)菌細(xì)胞壁的功能，另一方面可以作為誘導(dǎo)劑，與分布在細(xì)菌胞膜上的由mecR1 基因編碼的mecR1蛋白相結(jié)合，使其發(fā)生自裂解而發(fā)揮肽酶活性，分解結(jié)合在mecA 啟動子上的阻遏蛋白mecI,從而啟動mecA的表達(dá)，產(chǎn)生PBP2a，代替PBP2 的轉(zhuǎn)肽酶活性，繼續(xù)金黃色葡萄球菌肽聚糖的合成，維持MRSA 耐藥性[8]。

本研究結(jié)果顯示，實時熒光定量PCR法在20例藥敏試驗為MSSA感染者的基因中檢測到mecA 基因，并將其判定為MRSA感染，這提示實時熒光定量PCR法診斷MRSA的能力要高于藥敏試驗。MRSA因其傳播途徑廣、致病性強、多重耐藥性等特點，成為臨床治療的難點[9,10]。本研究證實，應(yīng)用實時熒光定量PCR法可快速鑒定金黃色葡萄球菌及MRSA，檢測簡便，敏感性強，準(zhǔn)確性高，能夠在疾病早期及時發(fā)現(xiàn)MRSA的感染或潛在的mecA耐藥基因，為臨床合理使用抗生素提供可靠依據(jù)，防止病情惡化，有效避免院內(nèi)感染，有推廣價值。

參考文獻(xiàn)：

[1] 吳霞, 王傳清, 嚴(yán)秀峰,等.兒童耐甲氧西林金黃色葡萄球菌感染臨床及分子學(xué)特征研究[J]. 中華傳染病雜志,2013,31(11)：641-645.

[2] 汪復(fù),朱德妹,胡付品,等.2012年中國CHINET細(xì)菌耐藥性監(jiān)測[J]. 中國感染與化療雜志,2013,13(15)：321-330.

[3] 李耀華,費春榮,葉愛春.實時熒光PCR快速檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的臨場評估[J]. 診斷學(xué)理論與實踐,2011,10(5)：449-453.

[4] Cercenado E, Marin M, Burillo A, et al. Rapid detection of staphylococcus aureus in lower respiratory tract secretions from patients with suspected ventilator-associated pneumonia: evaluation of the cepheid xpert MRSA/SA SSTI assay[J]. J Clin Microbiol, 2012,50(12)：4095-4097.

[5] 周俊,陳旭,李敏,等.實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)快速檢測下呼吸道痰液標(biāo)本耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的臨床應(yīng)用[J].上海醫(yī)學(xué),2013,36(1)：23-26.

[6] 李春, 方欣, 王中新.耐甲氧西林金黃色葡萄球菌耐藥性分析及基因同源性檢測[J].中國抗生素雜志年,2013,38(9)：688-690.

[7] 王斌, 史友權(quán), 司怡然.耐甲氧西林金黃色葡萄球菌流行病學(xué)征的研究進(jìn)展[J].大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報,2013,35(2)：183-187.

[8] 袁文常.金黃色葡萄球菌適應(yīng)性耐藥及MRSA耐藥調(diào)控機制的研究[D].重慶：第三軍醫(yī)大學(xué),2013.

[9] 劉曄華,王世瑜,張堅磊,等.醫(yī)院內(nèi)感染耐甲氧西林金黃色葡萄球菌分型及臨床分析[J].中華流行病學(xué)雜志,2014,35(1)：71-76.

[10] 中華醫(yī)學(xué)會甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌感染治療策略專家組，中華醫(yī)學(xué)會感染與抗微生物治療策略高峰論壇.甲氧西林耐藥金黃色葡萄球菌感染的治療策略專家共識[J]．中國感染與化療雜志,2011,1l(6)：401-416．

(收稿日期：2015-05-12)

中圖分類號：R631

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：B

文章編號：1002-266X(2016)06-0080-02

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.06.031

通信作者：劉蕊(E-mail: lr3595@163.com)