李亞坤，杜建新，呂志華 ，孫勇 ，朱新紅，林存智

(1青島大學(xué)，山東青島266071；2青島大學(xué)附屬醫(yī)院;3中國海洋大學(xué)藥學(xué)院；4青島市市立醫(yī)院)

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·基礎(chǔ)研究·

仿刺參糖胺聚糖對健康人和肺癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞體外增殖活性的影響

李亞坤1，杜建新2，呂志華3，孫勇2，朱新紅4，林存智2

(1青島大學(xué)，山東青島266071；2青島大學(xué)附屬醫(yī)院;3中國海洋大學(xué)藥學(xué)院；4青島市市立醫(yī)院)

摘要：目的探討不同濃度的仿刺參糖胺聚糖(HGAG)對健康人和肺癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)體外增殖活性的影響。方法 采用Ficoll密度梯度離心法分別從健康人和肺癌患者外周血分離PBMC，在體外與0、0.1、1、10、50、100 μg/mL的HGAG共同培養(yǎng)，CCK-8法檢測PBMC增殖的光密度(OD)值。結(jié)果HGAG在1~50 μg/mL濃度范圍內(nèi)健康人PBMC的OD值均增高，與0 μg/mL相比P均<0.05，濃度為10 μg/mL時(shí)OD值最高(P均<0.05)，0.1、100 μg/mL與0 μg/mL相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；HGAG在10~100 μg/mL濃度范圍內(nèi)肺癌患者PBMC的OD值均增高，與0 μg/mL相比P均<0.05，且HGAG濃度越高其OD值越高(P均<0.05)。結(jié)論 HGAG在一定濃度范圍內(nèi)均能夠促進(jìn)健康人和肺癌患者PBMC的增殖，從而有助于提高機(jī)體的免疫功能，發(fā)揮抗腫瘤作用。

關(guān)鍵詞：肺癌;仿刺參糖胺聚糖;外周血單個(gè)核細(xì)胞;免疫調(diào)節(jié)

海參屬棘皮動(dòng)物門海參綱生物，具有較高的營養(yǎng)價(jià)值和藥用價(jià)值[1，2]。海參多糖是海參的主要活性成分之一，其生物活性廣泛，具有抗腫瘤、抗凝血、抗病毒及免疫調(diào)節(jié)等作用[3，4]。其中抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)作用一直備受關(guān)注，且多糖的免疫調(diào)節(jié)作用是多靶點(diǎn)的。2014年9～12月，我們采用CCK-8法檢測不同濃度的仿刺參糖胺聚糖(HGAG)對體外培養(yǎng)的健康人及肺癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)增殖活性的影響。現(xiàn)報(bào)告如下。

1材料與方法

1.1臨床資料收集青島大學(xué)附屬醫(yī)院收治的肺癌患者30例，其中男17例、女13例，年齡(55.40±4.25)歲。健康查體中心的健康體檢者30例，排除腫瘤及其他自身免疫缺陷性疾病以及長期服用糖皮質(zhì)激素者，其中男16例、女14例，年齡(34.60±8.83)歲。兩組性別、年齡具有可比性。

1.2PBMC的分離及增殖活性觀察取上述健康人及肺癌患者外周血，采用Ficoll密度梯度離心法分離PBMC。用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度5×104/mL，接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100 μL，共設(shè)6組，每組3個(gè)復(fù)孔。前5組分別加入HGAG使其終濃度為0.1、1、10、50、100 μg/mL，第6組加入PBS為對照組，放置于 37 ℃、5% CO2濃度的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。于培養(yǎng)24 h后，每孔加10 μL CCK-8，輕微震蕩，在 37 ℃、5%CO2濃度的培養(yǎng)箱中孵育4 h，用酶標(biāo)儀測定在450 nm處的光密度(OD)值。

2結(jié)果

2.1HGAG對健康人PBMC增殖活性的影響對照組及0.1、1、10、50、100 μg/mL HGAG組健康人PBMC的OD值分別為0.740±0.011、0.750±0.015、0.761±0.023、0.770±0.027、0.763±0.026、0.752±0.016。1、10、50 μg/mL HGAG組OD值與對照組相比P均<0.05，10 μg/mL HGAG組OD值高于1、50 μg/mL HGAG組(P均<0.05)。0.1、100 μg/mL HGAG組的OD值與對照組相比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2HGAG對肺癌患者PBMC增殖活性的影響對照組及0.1、1、10、50、100 μg/mL HGAG組肺癌患者PBMC的OD值分別為0.735±0.010、0.741±0.012、0.747±0.019、0.759±0.020、0.774±0.031、0.780±0.032。10、50、100 μg/mL HGAG組OD值與對照組相比P均<0.05，且100 μg/mL HGAG組OD值>50 μg/mL HGAG組OD值>10 μg/mL HGAG組OD值(P均<0.05)。0.1、1 μg/mL HGAG組OD值與對照組相比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3討論

近年來，多項(xiàng)研究已經(jīng)證實(shí)海參多糖具有抗腫瘤作用[5～8]，且其抗腫瘤作用與其免疫調(diào)節(jié)作用密切相關(guān)[9，10]。HGAG可以增強(qiáng)肝癌腹水小鼠的單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)功能，提高腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬百分率和吞噬指數(shù)，達(dá)到抑瘤作用，同時(shí)在體外還能促進(jìn)小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖[11]。刺參酸性黏多糖通過刺激免疫器官組織增生，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和T細(xì)胞的免疫能力，調(diào)節(jié)TNF-α、IL-2等細(xì)胞因子，肝癌產(chǎn)生明顯的抑制作用[12]。日本刺參可通過提高荷瘤小鼠脾指數(shù)及胸腺指數(shù)、血清溶血素水平、抗體形成的細(xì)胞數(shù)、遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)水平和脾淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化能力，促進(jìn)NK細(xì)胞活性和巨噬細(xì)胞的吞噬能力，抑制小鼠S180肉瘤的生長[13]。因此，海參多糖可以通過全面調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能間接發(fā)揮抗腫瘤作用，然而在體外對淋巴細(xì)胞的直接作用少有報(bào)道。本研究觀察了不同濃度HGAG對健康人及肺癌患者免疫細(xì)胞PBMC增殖活性的影響，結(jié)果顯示，HGAG在1~50 μg/mL濃度范圍內(nèi)能明顯提高健康人PBMC的增殖活性，且濃度為10 μg/mL時(shí)促增殖作用最明顯。此后隨著濃度降低或升高，促進(jìn)作用逐漸降低，這可能是由于高濃度的HGAG會使?jié)B透壓、pH等條件發(fā)生改變，從而影響細(xì)胞的增殖活性。與正常人相比，0.1~100 μg/mL濃度范圍內(nèi)，肺癌患者的PBMC的增殖活性隨著HGAG濃度的升高而升高，且濃度為100 μg/mL時(shí)仍有明顯的促增殖作用。其原因可能是肺癌患者的免疫功能低下，需較高濃度的HGAG刺激才能提高PMBC增殖活性。

綜上所述，HGAG在一定的濃度范圍內(nèi)能夠促進(jìn)健康人和肺癌患者PBMC的增殖，說明HGAG不僅能提高健康人的免疫功能，而且也能提高免疫低下的肺癌患者的免疫功能，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。由于正常人與肺癌患者的基礎(chǔ)免疫狀態(tài)不同，產(chǎn)生促PBMC增殖作用所需要的HGAG濃度亦不同。

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(收稿日期：2015-08-25)

中圖分類號：R734.2

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)06-0028-02

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.06.009

通信作者：林存智(E-mail： lindoc@126.com)，杜建新(E-mail： jianxindu@163.com)

基金項(xiàng)目：海洋藥物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室科研基金資助項(xiàng)目(KLMDOUC201307)。