楊勇文，李從榮（武漢大學(xué)人民醫(yī)院，武漢430000）

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耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌耐藥基因研究進(jìn)展

楊勇文，李從榮
（武漢大學(xué)人民醫(yī)院，武漢430000）

摘要：隨著碳青霉烯類抗生素在臨床上廣泛使用，腸桿菌科細(xì)菌的耐藥性問題日益嚴(yán)重。產(chǎn)碳青霉烯酶是耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌（CRE）主要的耐藥機(jī)制，編碼這類酶的耐藥基因包括A、B、D三類。A類酶主要以肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶（KPC）為主；B類酶主要是在印度泛濫的新德里金屬β內(nèi)酰胺酶（NDM），可出現(xiàn)在肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌中；D類酶主要以肺炎克雷伯菌和大腸桿菌產(chǎn)苯唑西林酶-48（OXA-48）為主。大多數(shù)產(chǎn)KPC型酶菌株將造成院內(nèi)感染，而產(chǎn)NDM、OXA-48酶菌株可造成醫(yī)院和社區(qū)感染。雖然大部分CRE的耐藥分子類型影響范圍較為局限，但是其播散范圍呈擴(kuò)大趨勢，且新近很多突變類型出現(xiàn)，值得廣泛關(guān)注。

關(guān)鍵詞：碳青霉烯酶；腸桿菌科細(xì)菌；細(xì)菌耐藥；金屬β內(nèi)酰胺酶；苯唑西林酶

碳青霉烯類抗生素是治療產(chǎn)超廣譜β內(nèi)酰胺酶（ESBLs）和（或）頭孢菌素酶腸桿菌科細(xì)菌的一線藥物。隨著碳青霉烯類抗生素在臨床上廣泛使用，耐碳青霉烯類腸桿菌科細(xì)菌（CRE）不斷被報(bào)道，給臨床治療帶來極大困難。CRE耐藥分子廣泛傳播主要包括兩方面原因：自身的基因結(jié)構(gòu)（如周圍的轉(zhuǎn)座子和整合子）以及所屬的質(zhì)粒類型（如廣譜質(zhì)粒和窄譜質(zhì)粒）；外界抗生素的壓力選擇，感控措施不嚴(yán)格和人口的高流動(dòng)性。產(chǎn)碳青霉烯酶是CRE主要的耐藥機(jī)制，不同類型碳青霉烯酶具有不一樣的水解抗生素活性，耐藥譜有所差異。按照Ambler分類原則，編碼碳青霉烯酶的耐藥基因可分為A、B、D三類［1］。本文將從這三個(gè)方面分別進(jìn)行綜述。

1　A類碳青霉烯酶

A類碳青霉烯酶的活性中心均含絲氨酸結(jié)構(gòu)，可被酶抑制劑他唑巴坦和克拉維酸抑制，不被乙二胺四乙酸抑制。不能水解3代頭孢，可造成青霉素類、氨曲南、碳青霉烯類耐藥。第一個(gè)非金屬A類碳青霉烯酶從陰溝腸桿菌中檢出。隨后，黏質(zhì)沙雷菌酶（SME）在黏質(zhì)沙雷菌分離，SME包括1～5五個(gè)亞型，均由染色體編碼，散布于美國和加拿大［2，3］。水解亞胺培南β-內(nèi)酰胺酶（IMI）CRE在美國、歐洲均有檢出［4，5］。IMI基因大多位于染色體上，而在我國發(fā)現(xiàn)的陰溝腸桿菌攜帶的IMI-2型基因位于質(zhì)粒上［6］。2000年，圭亞那超廣譜β內(nèi)酰胺酶1（GES-1）被報(bào)道，最初被認(rèn)為是ESBLs，隨后發(fā)現(xiàn)的部分GES亞型由于活性中心內(nèi)的特定氨基酸置換使其具有水解碳青霉烯類抗生素的能力，其中GES2、GES4、GES5、GES6、GES11、GES14、GES18均可高效水解亞胺培南，故將這些GES酶歸入A類碳青霉烯酶。目前，GES系列包含24個(gè)亞型。值得注意的是，編碼GES-5酶的基因定位于I類整合子上，并且能在院內(nèi)和環(huán)境中廣泛傳播［7］。GES-5是在腸桿菌科細(xì)菌中主要水解碳青霉烯類抗生素的GES酶，目前國內(nèi)還沒有相關(guān)報(bào)道。

A類碳青霉烯酶中最常見的是肺炎克雷伯菌碳青霉烯酶（KPC），能夠水解青霉素類、β內(nèi)酰胺酶抑制劑、頭孢菌素類以及碳青霉烯類等各種抗生素。1996年第1株產(chǎn)KPC-2的肺炎克雷伯菌在美國卡羅來納州檢出。之后在多個(gè)國家和地區(qū)報(bào)道了KPC，已有22個(gè)KPC亞型被發(fā)現(xiàn)，均由相互之間個(gè)別氨基酸的突變產(chǎn)生，以位于質(zhì)粒的KPC-2最為常見，這種質(zhì)粒常攜帶ESBLs基因，表現(xiàn)出多重耐藥甚至全耐藥。我國KPC已在浙江等多個(gè)省市出現(xiàn)，情況較為嚴(yán)峻；在印度也有KPC的報(bào)道［8］。在歐洲（包括意大利、希臘等地區(qū)），旅行是造成產(chǎn)KPC肺炎克雷伯菌跨區(qū)域播散的重要原因；在中東地區(qū)，KPC可同時(shí)導(dǎo)致院內(nèi)和社區(qū)爆發(fā)流行，提示中東地區(qū)可能是KPC的聚集地。值得注意的是，產(chǎn)KPC-2的肺炎克雷伯菌已經(jīng)在世界范圍內(nèi)流行，KPC-2周圍的遺傳環(huán)境可能超過抗生素的選擇壓力起到舉足輕重的作用。

2　B類碳青霉烯酶

B類碳青霉烯酶又稱金屬β內(nèi)酰胺酶（MBLs），目前發(fā)現(xiàn)的所有金屬酶均含有鋅離子活性中心，可水解包括碳青霉烯類在內(nèi)的具有β內(nèi)酰胺環(huán)的抗生素，其活性不受克拉維酸、舒巴坦等酶抑制劑的影響，但巰基化合物及乙二胺四乙酸等金屬離子螯合劑可使其失活。最常見的MBLs為新德里金屬β內(nèi)酰胺酶（NDM）、維羅納整合子編碼金屬酶（VIM）和亞胺培南耐藥金屬酶（IMP），GIM-1和KHM-1偶有報(bào)道［9，10］。2009年，金屬酶中的新德里1型金屬酶（NDM-1）被報(bào)道，其來自于一名印度裔的瑞典患者分離鑒定的大腸桿菌和肺炎克雷伯菌菌株［11］。NDM主要來自印度［12］，NDM的傳播與印度環(huán)境中的攜帶有關(guān)。產(chǎn)NDM的CRE在法國和英國檢出最多，英國檢出的菌株經(jīng)同源性分析證實(shí)與印度和巴基斯坦的菌株密切相關(guān)，提示印度很有可能是NDM的源頭?？缇陈眯惺荖DM廣泛播散的重要原因［11］。目前，產(chǎn)NDM的CRE在全球均有報(bào)道。產(chǎn)NDM-1的CRE在我國雖不多見，但檢出率呈逐年增多趨勢，現(xiàn)北京已有報(bào)道［13］，雖然暫未形成大規(guī)模流行，但仍需警惕。

VIM主要分布在歐洲南部和地中海地區(qū)，IMP主要分布在我國東部沿海地區(qū)和日本。NDM-1與VIM-1／VIM-2的氨基酸同源性為32．4%，與其他酶相似性更低。NDM-1雖呈現(xiàn)出MBLs典型的耐藥譜，對單環(huán)β內(nèi)酰胺類抗生素氨曲南敏感。從NDM-1被發(fā)現(xiàn)以來，已報(bào)道了8個(gè)亞型（NDM-1～8）。與NDM-1相比，NDM-4、NDM-5和NDM-7對碳青霉烯類抗生素水解活性增加。1997年，VIM首次在意大利自銅綠假單胞菌檢出［14］，已發(fā)現(xiàn)41種亞型。VIM主要在銅綠假單胞菌中檢出，但其啟動(dòng)子P1在大腸埃希菌中的作用更強(qiáng)，以VIM-2亞型最為常見［15］。1991年，Osano等首先在日本分離的黏質(zhì)沙雷菌檢出IMP-1，編碼基因定位于染色體，已發(fā)現(xiàn)48種亞型。VIM和IMP的同源性小于20%，均由染色體或質(zhì)粒介導(dǎo)，其活性中心的氨基酸殘基需結(jié)合結(jié)合兩個(gè)鋅離子才能發(fā)揮催化作用。

3　D類碳青霉烯酶

D類β內(nèi)酰胺酶也稱為苯唑西林酶（OXA），目前已發(fā)現(xiàn)400余種，大多對碳青霉烯類抗生素產(chǎn)生低水平耐藥，不能水解氨曲南。腸桿菌科細(xì)菌中主要流行的是OXA-48，對亞胺培南有較高的水解活性。當(dāng)OXA-48存在外膜蛋白缺失、外排泵亢進(jìn)等耐藥機(jī)制的作用時(shí)，CRE可表現(xiàn)對碳青霉烯類抗生素的高水平耐藥［16］。OXA-48上游含有IS1999插入序列，具有啟動(dòng)子的作用，可使酶表達(dá)水平增強(qiáng)，并參與基因的同源重組。在中國、伊朗、歐洲、美國及日本均有關(guān)于該酶的報(bào)道。OXA-48定位于高轉(zhuǎn)換率的廣譜接合型質(zhì)粒上，能夠跨菌屬傳播［17］。其次為由OXA-48點(diǎn)突變而來OXA-181，二者僅存在4個(gè)氨基酸的差異，編碼基因均位于質(zhì)粒上，耐藥譜相似，但OXA-181周圍的基因結(jié)構(gòu)與OXA-48不同。OXA-181已在挪威、英國、法國等歐洲國家被報(bào)道，經(jīng)多位點(diǎn)序列分型同源性分析發(fā)現(xiàn)與印度的分離株有聯(lián)系。證明產(chǎn)OXA-181的CRE來源于印度［18］。

在阿根廷分離的肺炎克雷伯菌中先后發(fā)現(xiàn)OXA-163和OXA-247［19］。盡管OXA-163活性比OXA-48低，但可水解廣譜頭孢菌素且部分地被克拉維酸抑制，與ESBLs的耐藥譜極為相似，值得臨床微生物工作者關(guān)注。經(jīng)分子流行病學(xué)和分子生物學(xué)相關(guān)實(shí)驗(yàn)證明，OXA-247基因由OXA-163單個(gè)氨基酸突變而來，二者具有相同抗生素的水解活性［20］。目前，在突尼斯和阿爾及利亞分離鑒定的肺炎克雷伯菌中發(fā)現(xiàn)OXA-204。通過比對OXA-204和OXA-48的氨基酸一級結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，后者2個(gè)氨基酸被取代后產(chǎn)生OXA-204。在法國分離鑒定的肺炎克雷伯菌中發(fā)現(xiàn)OXA-232，其來自于毛里求斯和印度［21］。由OXA-18點(diǎn)突變而來的OXA-232與OXA-48相比有5個(gè)氨基酸被取代，OXA-232水解碳青霉烯類抗生素的能力更弱。這些被取代的氨基酸基團(tuán)水解碳青霉烯類的機(jī)制有待研究。最近，在美國分離鑒定的肺炎克雷伯菌發(fā)現(xiàn)同時(shí)產(chǎn)OXA-232與NDM-1，其來源于印度［22］。盡管大部分OXA亞型僅僅是小規(guī)模流行，但近年來OXA突變速度非常之快，且絲氨酸酶和金屬酶有同時(shí)作用的趨勢，需引起足夠的警惕。

4　結(jié)語

目前，碳青霉烯類抗生素作為臨床治療產(chǎn)ESBLs菌株的首選藥物正受到嚴(yán)峻考驗(yàn)，CRE給臨床治療方案的選擇帶來了極大挑戰(zhàn)。聯(lián)合多種抗菌藥物治療的過程中，這類細(xì)菌面臨新的選擇壓力可進(jìn)一步篩選出新的耐藥機(jī)制，并且碳青霉烯酶均可在染色體或質(zhì)粒的介導(dǎo)下垂直或水平傳播。臨床微生物室應(yīng)建立一套耐藥基因初篩體系，快速準(zhǔn)確地診斷CRE；臨床醫(yī)生應(yīng)審慎、合理地使用碳青霉烯類抗生素，密切關(guān)注醫(yī)院感控部門的耐藥情況；院感辦應(yīng)采取有效措施預(yù)防醫(yī)院感染的爆發(fā)。多方協(xié)作以防止CRE耐藥基因和耐藥細(xì)菌的廣泛傳播。

參考文獻(xiàn)：

［1］Ambler RP，Coulson AF，F(xiàn)rere JM，et al．A standard numbering scheme for the class A β-lactamases［J］．Biochem J，1991，276 （pt1）：269-270．

［2］Fairfax MR，Queenan AM，Lephart PR，et al．Detection of two SME-1 carbapenemase-producing Serratia marcescens in Detroit ［J］．Diagn Microbiol Infect Dis，2011，71（3）：325-326．

［3］Naas T，Nordmann P．Analysis of a carbapenem-hydrolyzing class A β-lactamase from Enterobacter cloacae and of its LysR-type regulatory protein［J］．Proc Natl Acad Sci USA，1994，91（16）：7693-7697．

［4］Rasmussen BA，Bush K，Keeney D，et al．Characterization of IMI-1 beta-lactamase，a class A carbapenem-hydrolyzing enzyme from Enterobacter cloacae［J］．Antimicrob Agents Chemother，1996，40（9）：2080-2086．

［5］Osterblad M，Kirveskari J，Hakanen AJ，et al．Carbapenemaseproducing Enterobacteriaceae in Finland：the first years（2008-11）［J］．J Antimicrob Chemother，2012，67（12）：2860-2864．

［6］Yu YS，Du XX，Zhou ZH，et al．First isolation of blaIMI-2 in an Enterobacter cloacae clinical isolate from China［J］．Antimicrob A-gents Chemother，2006，50（4）：1610-1611．

［7］Manageiro V，F(xiàn)erreira E，Canica M，et al．GES-5 among the βlactamases detected in ubiquitous bacteria isolated from aquatic environment samples［J］．FEMS Microbiol Lett，2014，351（1）：64-69．

［8］Kumarasamy K，Kalyanasundaram A．Emergence of Klebsiella pneumoniae isolate co-producing NDM-1 with KPC-2 from India ［J］．J Antimicrob Chemother，2012，67（1）：243-244．

［9］Castanheira M，Toleman MA，Jones RN，et al．Molecular characterization of a β-lactamase gene，blaGIM-1，encoding a new subclass of metallo-β-lactamase［J］．Antimicrob Agents Chemother，2004，48（12）：4654-4661．

［10］Sekiguchi J，Morita K，Kitao T，et al．KHM-1，a novel plasmidmediated metallo-β-lactamase from a Citrobacter freundii clinical isolate［J］．Antimicrob Agents Chemother，2008，52（11）：4194-4197．

［11］Yong D，Toleman MA，Giske CG，et al．Characterization of a new metallo-β-lactamase gene，bla NDM-1，and a novel erythromycin esterase gene carried on a unique genetic structure in Klebsiella pneumonia sequence type 14 from India［J］．Antimicrob Agents Chemother，2009，53（12）：5046-5054．

［12］Dortet L，Poirel L，Nordmann P．Worldwide dissemination of the NDM-type carbapenemses in Gram-negative bacteria［J］．Biomed Res Int，2014，2014：249856．

［13］Zhou G，Guo S，Luo Y，et al．NDM-1 producing strains，family Enterobacteriaceae，in hospital，Beijing，China［J］．Emerg Infect Dis，2014，20（2）：340-342．

［14］Lauretti L，Riccio ML，Mazzariol A，et al．Cloning and characterization of blaVIM，a new integron-borne metallo-β-lactamase gene from a Pseudomonas aeruginosa clinical isolate［J］．Antimicrob A-gents Chemother，1999，43（7）：1584-1590．

［15］Poirel L，Pitout JD，Nordmann P．Carbapenemases：molecular diversity and clinical consequences［J］．Future Microbiol，2007，2 （5）：501-512．

［16］Poirel L，Naas T，Nordmann P．Diversity，epidemiology，and genetics of class D β-lactamases［J］．Antimicrob Agents Chemother，2010，54（1）：24-38．

［17］Potron A，Poirel L，Nordmann P．Derepressed transfer properties leading to the efficient spread of the plasmid encoding carbapenemase OXA-48［J］．Antimicrob Agents Chemother，2014，58（1）：467-471．

［18］Potron A，Nordmann P，Lafeuille E，et al．Characterization of OXA-181，a carbapenem-hydrolyzing class D β-lactamase from Klebsiella pneumoniae［J］．Antimicrob Agents Chemother 2011，55（10）：4896-4899．

［19］Poirel L，Castanheira M，Carrer A，et al．OXA-163，an OXA-48-related class D β-lactamase with extended activity toward expanded-spectrum cephalosporins［J］．Antimicrob Agents Chemother 2011，55（6）：2546-2551．

［20］Gomez S，Pasteran F，F(xiàn)accone D，et al．Intrapatient emergence of OXA-247：a novel carbapenemase found in a patient previously infected with OXA-163-producing Klebsiella pneumoniae［J］．Clin Microbiol Infect，2013，19（5）：E233-235．

［21］Potron A，Rondinaud E，Poirel L，et al．Genetic and biochemical characterisation of OXA-232，a carbapenem-hydrolysing class D βlactamase from Enterobacteriaceae［J］．Int J Antimicrob Agents 2013，41（4）：325-329．

［22］Doi Y，O′Hara JA，Lando JF，et al．Co-production of NDM-1 and OXA-232 by Klebsiella pneumoniae［J］．Emerg Infect Dis，2014，20（1）：163-165．

收稿日期：（2015-10-09）

通信作者：李從榮（E-mail：1225870670＠qq．com）

基金項(xiàng)目：國家臨床重點(diǎn)?？平ㄔO(shè)項(xiàng)目（財(cái)社2010305）。

中圖分類號：R378

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1002-266X（2016）02-0096-03

doi：10．3969／j．issn．1002-266X．2016．02．043