路志芳　陳現(xiàn)臣　周民生

（安陽工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，河南安陽455000）

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超高壓對微生物的影響

路志芳陳現(xiàn)臣周民生

（安陽工學(xué)院生物與食品工程學(xué)院，河南安陽455000）

摘要：超高壓殺菌是1個十分復(fù)雜的過程，其殺菌效果受多重因素影響。如革蘭氏陽性菌比革蘭氏陰性菌的耐壓性強；水分降低，微生物的耐壓性增加；pH值降低時，微生物的殺滅效果增強；蛋白質(zhì)、碳水化合物和脂類有一定的抗壓性；在一定范圍內(nèi)，壓力越高，殺菌效果越好；而在相同壓力下，增加處理時間殺菌效果也在一定程度上得到提高；在一定溫度下，微生物中的蛋白質(zhì)、酶等物質(zhì)會發(fā)生一定程度的變性。通過殺菌動力學(xué)，可以描述微生物的致死特性和規(guī)律，對預(yù)測微生物的數(shù)量和保證食品微生物安全有重要的作用。

關(guān)鍵詞：超高壓；微生物；滅菌

超高壓通過破壞細胞膜、核糖體等細胞的外部與內(nèi)部結(jié)構(gòu)以及細胞內(nèi)重要蛋白質(zhì)，使細胞的物質(zhì)代謝和能量代謝失去平衡，從而導(dǎo)致微生物死亡[1]。

1　滅活機理

超高壓通過影響細胞膜的形態(tài)、微生物的生化反應(yīng)，從而滅活微生物。被普遍認可的觀點是，膜在壓力作用下受到損傷，胞內(nèi)組分外泄，從而導(dǎo)致細胞死亡。但所用的壓力不足以誘導(dǎo)細胞完全滲漏，滲漏僅限于外膜，如革蘭氏陰性菌，壓力釋放后，滲漏的膜就會迅速修復(fù)，此結(jié)果在Ritz[2]等進行的沙門氏菌膜蛋白研究中得到證實。Ritz等觀察到，超高壓處理后，大部分外膜蛋白消失，而質(zhì)膜蛋白仍然保留。高壓下微生物細胞膜的流動性發(fā)揮重要作用，流動性增強的膜可避免壓力傷害細胞。

被看作另一個重要的壓力殺死細胞的原因是壓力作用導(dǎo)致微生物中關(guān)鍵酶變性。胞內(nèi)酶似乎不是壓力抵抗性的決定因素，而ATP酶才是關(guān)鍵酶。

此外，HPP處理中的氧化脅迫似乎起著重要作用。厭氧條件下，隨著恢復(fù)活細胞的增加，編碼氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)元件（如oxyR和SOXS）的基因和編碼HPII氫過氧化物酶（katE）與過氧化物歧化酶（sodAB）的基因發(fā)生突變的大腸桿菌菌株的壓力敏感性增加，HPP引發(fā)鐵從Fe-S簇釋放，而鐵釋放會通過Fenton反應(yīng)產(chǎn)生游離羥基自由基。

細菌孢子具有較強的抗壓性，其滅活機理有別于營養(yǎng)體。中溫和脈沖壓力條件下，壓力先誘導(dǎo)孢子發(fā)芽，然后殺死發(fā)芽的孢子。從生化角度分析，發(fā)芽體結(jié)合到受體加速發(fā)芽并伴隨Ca2+與別的離子的流出和水流入孢子內(nèi)，使得孢子特定外皮裂解酶活化。因發(fā)芽期孢子組分不斷溶解，系統(tǒng)體積下降，壓力可增強發(fā)芽。根據(jù)Le Chatelier’s原理，任何導(dǎo)致活化體積減小的反應(yīng)都會在高壓作用下加速。這也意味著高壓誘導(dǎo)的發(fā)芽與生理途徑的活化有關(guān)，因此高壓不僅僅是水被壓進孢子原生質(zhì)體的理化過程，抑制營養(yǎng)誘導(dǎo)發(fā)芽的物質(zhì)也抑制壓力誘導(dǎo)型發(fā)芽。

2　影響超高壓殺菌效果的因素

2.1與微生物有關(guān)的變量

此類變量包括微生物的種類和數(shù)量及細胞的狀態(tài)。一般而言，革蘭氏陽性菌比革蘭氏陰性菌具有更強的耐壓性。病毒結(jié)構(gòu)多種多樣，對壓力抗性變化較大。酵母對壓力敏感，霉菌營養(yǎng)體相對敏感，而囊孢子非常耐壓。通常營養(yǎng)體能夠在400～600MPa壓力下被滅活，而一些孢子在室溫下能夠耐受1000MPa以上的壓力。

2.2與產(chǎn)品有關(guān)的變量

2.2.1水分活度（Aw）

一般認為，隨著Aw的降低，微生物的耐壓性增加，細胞質(zhì)表現(xiàn)為不可壓縮性，蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性得到增強。345MPa、21℃保壓5min，當Aw>0.98時，拜耳結(jié)合酵母完全失活；當Aw為0.92、0.91和0.90時，酵母數(shù)量減少量的對數(shù)值為1。在不同Aw下，超高壓（600 MPa）300s對李斯特菌凍干細胞的影響試驗結(jié)果顯示，當配制李斯特菌凍干細胞懸浮液的蛋白胨水濃度減少至60％（Aw0.8）時，細菌存活率明顯增加。

2.2.2pH值

每種微生物都有適應(yīng)其生長的pH值范圍，不同pH值條件下，微生物的耐壓性均有所不同。已發(fā)現(xiàn)酸性比中性壓力對細胞的破壞更大。蒸餾水中的細胞比緩沖液中的細胞對壓力更敏感。據(jù)報道，壓力會改變介質(zhì)的pH值，并逐漸縮小微生物生長的pH值范圍。在低pH值下，芽孢對壓力更敏感，明顯失活。Alpas等人[3]研究了8種微生物在不同pH環(huán)境下超高壓處理效果，結(jié)果證明，當pH降低時，微生物的殺滅效果得到增強。比如大腸桿菌0157：H7933在25℃、345MPa下處理5min，當環(huán)境pH為6.5時可殺滅1.86個對數(shù)值；當pH值降低至4.5時，滅菌效果增強了兩倍多。此外，高壓造成的損傷微生物可在營養(yǎng)豐富環(huán)境中復(fù)活，卻不能在酸性條件下修復(fù)。

2.2.3產(chǎn)品組成

蛋白質(zhì)、碳水化合物和脂類在壓力傳遞的過程中具有一定的抗壓性，因此它們對微生物具有保護作用。一般來說，鹽的濃度越高，細菌對超高壓的耐性越大。

2.2.4過程變量

主要包括壓力大小、保壓時間、溫度、使用的脈沖。在一定范圍內(nèi)，壓力越高，殺菌效果越好；而在相同壓力下，增加處理時間，殺菌效果也在一定程度上得到提高。對牛奶中大腸桿菌的耐壓性進行試驗，結(jié)果表明，處理時間越長，壓力越大，大腸桿菌存活數(shù)越少。處理壓力（100～600MPa）和保壓時間對鮮榨蘋果汁和胡蘿卜汁中的菌落總數(shù)的降低均有顯著影響，但在低壓下，時間對殺菌效果影響不大。

在一定溫度下，微生物中的蛋白質(zhì)、酶等物質(zhì)會發(fā)生一定程度的變性。一些學(xué)者證明，當在15～30℃室溫下采用超高壓處理時，微生物有最大的抗性，因而，高于或低于室溫的處理傾向增加殺滅效果。Alpas等人[3]研究8種微生物對高壓結(jié)合中溫處理后發(fā)現(xiàn)，在溫度從25℃升到50℃后，8種微生物的死亡率都顯著提高。如金黃色葡萄球菌485在345MPa、25℃下處理5min，只能殺滅1個對數(shù)值；而當溫度升至50℃時，滅菌效果增強了5倍。曾慶梅等[4]發(fā)現(xiàn)，在壓力為450MPa、保壓時間為10min的條件下，協(xié)同溫度≥29℃時，梨汁中菌落總數(shù)為70CFU/ mL，大腸菌群、霉菌和酵母菌未被檢出，完全達到國家食品衛(wèi)生標準。Koseki等[5]對牛奶進行中溫協(xié)同滅菌（李斯特菌），在550MPa壓力下，將溫度從37℃提高到50℃，保壓時間可以從4h減少為10min。Ailine[6]等人研究了前后施加熱處理對超高壓處理黑曲霉的效果的影響，結(jié)果顯示，在高壓前施加熱處理只有疊加作用，并沒有協(xié)同作用。而先超高壓處理，后進行熱處理時，就表現(xiàn)出了協(xié)同作用。除金黃色葡萄球菌（增加不明顯）、枯草芽孢桿菌、生芽孢梭狀桿菌和嗜熱脂肪芽孢桿菌外，大多數(shù)微生物在-20℃條件下的高壓殺菌效果要比20℃條件下好。超高壓處理（100～500MPa）羊奶時，4℃條件下比常溫（25℃）條件下，殺滅熒光假單胞菌、無害李斯特（氏）菌和瑞士乳桿菌的效果要好，而大腸桿菌和金黃色葡萄球菌恰好相反。

加壓可以是靜態(tài)或動態(tài)，不同模式的效果直接相關(guān)于壓力大小和保壓時間。動態(tài)加壓可以是脈沖或循環(huán)式，而后者是脈沖和靜態(tài)的結(jié)合。脈沖加壓滅菌效果顯著。

此外，加壓泄壓的速度也影響超高壓殺菌的效果。60℃和70℃條件下緩慢加壓結(jié)合緩慢泄壓對枯草芽孢桿菌孢子的破壞力大于快速加壓和快速泄壓。但快速加壓和緩慢泄壓時，致傷細胞的數(shù)量會更大。

3　殺滅動力學(xué)

通過殺菌動力學(xué)可以描述微生物的致死特性和規(guī)律，對預(yù)測微生物的數(shù)量和保證食品微生物安全有重要的作用。有幾種方式用來報道滅菌效果，普遍被認可的是在恒溫下加熱菌懸液時，活菌數(shù)的下降可用一級反應(yīng)方程描述：-dN/dt=k·N，N為活菌數(shù)，k為滅菌反應(yīng)中的一級速率常數(shù)。在開始時刻，N=N0，方程就可變成：Ln（N/N0）=-kt，則D值（降低活菌數(shù)90％所需的時間）可定義為：D=-t/log（N/N0）。一級滅活速率常數(shù)k和D值是解釋熱處理滅菌原因中常用到的概念。對應(yīng)于熱滅活中的D值，高壓處理中的90％致死所需時間（Dp值）可被定義。在這種情況下，時間表示恒壓下的處理時間。采用一級動力學(xué)模型來分析超高壓殺菌效果，是基于所有微生物菌群同時暴露于壓力下，并且具有相同的致死時間的假設(shè)。事實上，不同微生物菌群的致死時間不同，純菌亦因生物的多樣性，其不同細胞的致死時間不同。因而，在半對數(shù)坐標中滅活曲線也可能是非線性的，典型的是肩部和（或）拖尾。描述具有非線性殺滅特點的模型有biphasic，n級動力學(xué)、修訂Gompertz、Baranyi、log-logistic、Weibull等。概率論模型Weibull假定死亡率為可能性結(jié)果，且破壞曲線表示的是死亡事件的累積分布。在Weibull模型中，級差因子b和形狀因子分別描述殺滅效果和曲線凹凸程度。此幾類模型也可用于預(yù)測各種壓力溫度組合的殺菌效果，并為不犧牲微生物安全性條件下選擇最佳處理參數(shù)提供靈活性。

一組動力學(xué)參數(shù)獲得后，動力學(xué)參數(shù)的壓力靈敏性就可以評估。超高壓中微生物或酶的滅活的線性動力學(xué)可用Arrhenius類模型或壓力死亡時間模型進行分析。壓力殺滅模型分析中的動力學(xué)參數(shù)壓力依賴性可通過Dp的十進制對數(shù)對壓力作圖來確定。從log（Dp）對壓力的回歸斜率可以確定壓力Z值（Zp）為斜率的負倒數(shù)：Zp=-（l/slope），因此Zp值代表導(dǎo)致Dp值10倍改變的壓力變化值。在Arrhenius模型中，k值的壓力依賴性被作為活化體積變化從ln（k）對壓力的回歸斜率算得，見方程：ΔV#=-RT（slope）or -T[Δ（1nk）/ΔP]，P為壓力（MPa），k為速率常數(shù)（min-1），T為絕對溫度（K），R為氣體常數(shù)，ΔV#為活化的條件變化（m3mole-l）。

模型擬合度的優(yōu)劣由精確因子（Accuracy factor，Af）、偏差因子（Bias factor，Bf）、根均方差（Rootmean square error，RMSE）相關(guān)系數(shù)（Correlation coefficient，R2）4個參數(shù)來評判。參數(shù)Af和Bf用于衡量模型的有效性，Af值表示預(yù)測值與實測值偏離的程度。Af值越小表明模型預(yù)測值與實測值越接近，模型越精確。當Bf>1，表示模型預(yù)測值比實測值高；當Bf<1，表示模型預(yù)測值比實測值低。因此，當Bf越接近1，模型擬合度越高。相關(guān)系數(shù)R2和RMSE表示模型的精確度、可靠度，R2越接近于1，RMSE越小，模型擬合度越高。

Lim[7]發(fā)現(xiàn)超高壓處理的辣椒醬（Kochujang），其活菌數(shù)為1.56×103CFU/g，明顯低于熱處理樣品（1.43×106CFU/g）和未處理樣品（3.78×106CFU/g）。37℃貯藏120d后，熱處理的樣品中活菌數(shù)降到3.10×10 CFU/g，而超高壓處理的樣品貯藏到90d時，就檢測不到活菌。滴定酸含量，高壓處理樣品低于未處理樣品，而高于熱處理樣品。還原糖和乙醇含量三者沒有明顯差異。此外，處理樣品的Hunter L、a和b值下降速度明顯低于未處理樣品。這說明超高壓可以有效地抑制辣椒醬中的微生物，并能保持原有營養(yǎng)成分和品質(zhì)。超高壓的殺菌效果隨黃豆醬（Doenjang）中鹽濃度增加而下降，壓力敏感性下降的次序依次為霉菌、酵母和細菌。650MPa下處理40min可以殺滅黃豆醬中的大部分酵母和霉菌。高壓作用于生物分子和微生物的效果不同于熱處理，并且會因食品體系的不同有所差異。

參考文獻

[1] Huang HW，Lung HM，Yang BB，et al.Responses ofmi?croorganisms to high hydrostatic pressure processing[J].Food Control，2014，40∶250～259.

[2] Ritz M，F(xiàn)reulet M，Orange N and Federighi M.Effects of high hydrostatic pressure onmembrane proteins of Salmonella typhimurium[J].International Journal of Food Microbiology，2000，55∶115～119.

[3] Alpas H，Kalchayanand N，Bozoglu F and Ray B.Inter?actions of high hydrostatie pressure，pressurization temperature and pH ondeath and injury of pressure～resistant and pres?sure～sensitive strains of foodborne pathogens[J].International Journal of Food Microbiology，2000，60∶33～42.

[4]曾慶梅，潘見，謝慧明，等.中溫協(xié)同超高壓處理對梨汁中微生物的影響[J].食品科學(xué)，2004，25（8）：30～34.

[5] Koseki S，Mizuno Y，Yamamoto K.Use ofmild～heat treatment following high～pressure processing to prevent recov?ery of pressure～injured Listeriamonocytogenes inmilk [J].Food Microbiology，2008，25（2）：288～293.

[6] Alline A L Tribst，Mark A Franehi，Marcelo Cristianini and Pilar Rde Massaguer.Inactivation of Aspergillus niger inmango nectar by high～pressure homogenization combined with heat shock [J].Food Microbiology and Safety，2009，74（9）：509～514.

[7] Lim S，Kim B-O，Mok C，Park Y-S.Quality changes?during storage ofgochujang treated with heat and high hydrostat?ic pressure[J].Journal of Korean Society of Food Science and Nu?trition，2001，30（4）：611～616.