劉亞舉，岳俊濤

快速DNA指紋分析技術(shù)在個體識別中的應(yīng)用

劉亞舉，岳俊濤

目的 結(jié)合實(shí)際案例，探討快速DNA技術(shù)在個體識別案件中的應(yīng)用。方法 分別從實(shí)驗(yàn)室快速STR擴(kuò)增試劑盒和現(xiàn)場一體化DNA檢驗(yàn)設(shè)備兩個方面進(jìn)行說明，列舉了采樣工具及檢材處理流程、擴(kuò)增試劑及成分配比優(yōu)化、電泳檢測及數(shù)據(jù)分析等對快速檢驗(yàn)的影響。結(jié)果 兩者在案件中均取得了成功的STR分型結(jié)果，其相應(yīng)的快速檢驗(yàn)流程能夠滿足日常案件檢驗(yàn)需求。結(jié)論 個體識別DNA快速檢驗(yàn)與分析可以被充分應(yīng)用到案件實(shí)戰(zhàn)中，對促進(jìn)DNA證據(jù)的及時提取與鑒定具有重要的意義。

法醫(yī)遺傳學(xué)；快速DNA指紋分析；STR技術(shù)；個體識別

DNA個體識別技術(shù)由經(jīng)典的3個步驟組成，即DNA提取、PCR擴(kuò)增、毛細(xì)管電泳，而快速DNA分析研究主要集中在3個環(huán)節(jié)的檢驗(yàn)時間縮短上，也有直接省去DNA提取步驟的[1-2]。不管怎樣，都會帶動DNA規(guī)模化樣本檢驗(yàn)，促進(jìn)個體識別DNA證據(jù)價值的快速應(yīng)用。

1 案例資料

案例1：2014年1月下旬，農(nóng)婦李某(女，46歲)被殺死在家中，其上身著紅色保暖衣，下身赤裸，仰臥于床上，系銳器致頸動脈破裂死亡。在死者咖啡色床單上和臥室垃圾簍內(nèi)分別發(fā)現(xiàn)6根脫落毛發(fā)和3枚煙蒂。提取上述檢材和使用NUCLEIC-CARDTM(美國AB公司)提取死者血樣，排查出的數(shù)百名嫌疑人血樣使用FTA卡(美國GE公司)提取。剪取死者血樣采集卡和煙蒂咬痕部斑跡，以及帶有毛囊的毛發(fā)2根，將上述檢材放入0.2 mL的PCR管(鼓蓋)中，直接加入Prep-n-GoTM緩沖液3 μL，離心10 s，然后在室溫中靜置10 min，最后加入12 μL的GlobalFilerTMExpress試劑盒(美國AB公司)PCR反應(yīng)混合液(Master Mix6μL、Primer Set6μL)。按照試劑盒說明書進(jìn)行直接擴(kuò)增檢驗(yàn)，置3500XL型遺傳分析儀上毛細(xì)管電泳，Collection軟件收集數(shù)據(jù)，用GeneMapperID-X軟件進(jìn)行STR分型。

案例2： 2015年5月中旬，王某(女，17歲)約見網(wǎng)友時，被3名男子灌醉，然后在賓館遭到輪奸。使用斑跡查找系統(tǒng)(激光)和佩戴防炫目眼罩(美國Leeds公司)，發(fā)現(xiàn)粉紅色的床單和被罩上有大小不等的熒光反應(yīng)區(qū)5處，最大2.6 cm×1.7 cm、最小1.8 cm×1.1 cm，以及8根脫落毛發(fā)；在床頭柜和地面上有飲料瓶4個、煙蒂10枚。提取上述檢材和使用Bode Buccal DNA CollectorTM裝置(美國AB公司)收集受害人口腔拭子，排查出的嫌疑人員的血樣使用國產(chǎn)專用采集卡(武漢驥騰公司)提取。用4N6FLOQSwabsTM植絨拭子(意大利COPAN公司)擦拭飲料瓶口，剪取受害人口腔拭子采集卡、植絨拭子、煙蒂咬痕部斑跡、床單被罩上斑跡檢材適量，以及帶有毛囊的毛發(fā)2根，將上述檢材直接利用RapidHIT 200快速檢測系統(tǒng)(美國IntegenX公司)和配套的試劑耗材進(jìn)行DNA檢驗(yàn)(其中擴(kuò)增試劑為GlobalFilerTMExpress)，用GeneMarkerTMHID V2.7.1軟件(美國SoftGenetics公司)進(jìn)行STR分型。

兩個案件均得到了完整的STR分型，相關(guān)DNA分別與受害人(死者)、嫌疑人的分型一致。

2 討論

2.1 檢材的快速檢驗(yàn)流程

檢材的快速檢驗(yàn)前提條件是有效發(fā)現(xiàn)遺留于犯罪現(xiàn)場的生物檢材，茚三酮薰顯法對人體接觸細(xì)胞(汗斑類)[3]、菲德倍斯試劑對唾液斑類[4]、近紅外反射照相對深色衣料上血跡等有一定的指示作用[5]，可提高此類生物檢材的發(fā)現(xiàn)率。而聯(lián)苯胺血痕預(yù)試驗(yàn)對后續(xù)STR分型影響較大，可能使血痕不能繼續(xù)進(jìn)行STR分型檢測[6]，短波紫外激光照射會對汗?jié)撌钟z材的DNA檢驗(yàn)結(jié)果產(chǎn)生嚴(yán)重影響[7]，而對血跡、唾液斑、有毛囊的毛發(fā)的DNA檢驗(yàn)結(jié)果影響較小[8]。激光光源光純度高、方向性強(qiáng)、光斑均勻，光源在防炫眼罩的配合下可以去除深顏色底物對精斑和血痕的掩蓋；魯米諾試驗(yàn)是血紅蛋白或正鐵血紅素的氧化活性，在反應(yīng)中顯現(xiàn)熒光，可以將微量血痕進(jìn)行放大表現(xiàn)，引起人視覺上的感應(yīng)[9]。

2.2 檢材的采集和儲存

人體生物樣本，如血液和唾液，一般選擇紙質(zhì)承載體，包括FTA卡類(FTA卡、NUCLEIC-CARDTM)和非FTA卡類(Bode Buccal DNA CollectorTM裝置、OmniSwabsTM、S&S903濾紙)。用紙質(zhì)承載體采集的檢材或樣本，在后繼檢驗(yàn)中須用洗液進(jìn)行特殊處理，而且價格昂貴，不建議使用。優(yōu)質(zhì)采集卡應(yīng)具備以下條件：①紙厚度在(0.093±0.002) cm范圍，如果紙片過薄，在使用打孔器取樣時容易漂移，過厚則不能使液體快速吸收且均勻滲透和擴(kuò)散，采集的樣本不是雙面血痕，降低后續(xù)檢驗(yàn)結(jié)果的成功率。②紙灰分在0.1%±0.001%范圍，以保證紙漿純度。③殺菌防腐情況，經(jīng)納米銀或磷酸鹽溶液處理[10]，具有抗菌、防腐及殺菌效果。

現(xiàn)場生物檢材，現(xiàn)場人體接觸細(xì)胞的采樣方法有雙拭子擦拭、粘取、剪取、壓力吸附等[11-12]，要將采集到的細(xì)胞高效率轉(zhuǎn)移到后期DNA檢驗(yàn)環(huán)節(jié)，就要視情況而定。通常雙拭子擦拭法轉(zhuǎn)移承載體有紗線(不常使用)、棉簽(尖頭，方便微量檢材濃縮集中，利于DNA直接擴(kuò)增)、植絨拭子，如果是干的需要借助液體，如無菌去離子水、納米銀或磷酸鹽溶液[10]。其中植絨拭子檢驗(yàn)效果較為明顯，其表面的原子數(shù)目在體系中所占的比例較大，表面效應(yīng)十分突出。對于粗糙接觸面的作案工具上述擦拭和粘取則效果不明顯，把EZ-tape膠帶制成雙面膠帶(雙面膠帶之間的夾心為海綿，膠帶寬度1.5 cm左右，膠粘性略低于EZ-tape)，使用時將膠帶一面貼于藍(lán)色或黃色槍頭上，另一面膠帶借助槍頭外力來提取客體上的人體細(xì)胞。壓力吸附的濾膜應(yīng)為厚度小于0.2 mm、孔徑100～200 μm之間的纖維膜，孔徑大小不一，纖維成無序排列，這樣的濾膜韌性較強(qiáng)，可以有效攔截脫落細(xì)胞。另外，還有高效現(xiàn)場DNA物證采集儀(Microbial-Vac Systems，簡稱M-Vac DNA采集儀)是利用濕法真空原理，首先在一定壓力下將一種無菌的收集液噴灑到被采集樣品表面，然后利用真空吸力將這些收集液和樣品表面人體細(xì)胞一起收集，最終在收集瓶中將收集液和表面微粒分離，達(dá)到高標(biāo)準(zhǔn)回收生物檢材。

血卡和唾液卡上的人體細(xì)胞較為豐富，直接裝在透氣的牛皮紙袋內(nèi)即可。有些把承載體原物提取的現(xiàn)場檢材，可以用一次性醫(yī)用布包裝，隨后在DNA實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)移和檢驗(yàn)。人體細(xì)胞類檢材可采用套管式儲存[13]，透明塑料套管內(nèi)的變色硅膠和干燥片(與檢材保持一定距離)能實(shí)現(xiàn)檢材的無損、干燥、可視化儲存，防止檢材的污染、損耗、腐敗霉變。為了達(dá)到檢材的識別，常用的有二維條形碼、物流條形碼編碼，有發(fā)展趨勢的是無線射頻識別技術(shù)(radio frequency identification,RFID)，與前者比較，RFID具有非接觸、閱讀速度快、無磨損、不受環(huán)境影響、壽命長和防沖突功能。

2.3 檢材的預(yù)處理方法

DNA提取法：小體積Chelex100+PK法，IQ磁珠法(Promega公司)、M48磁珠法(Qiagen公司)、AGOWA sbeadex磁珠法(LGC公司)、PrepFiler磁珠法(AB公司)，硅膠膜法(Qiagen公司)，硅珠法，既可手動操作又可在工作站上進(jìn)行(目前使用最廣泛的自動化提取平臺有Maxwell?16、EZ1 Advanced/XL、Hamilton STAR-LET、Automate Express、QIAcube)，方便使用。磁珠優(yōu)劣主要取決于磁珠顆粒的大小，納米級的最好。另外，對于性侵案件中的精子—陰道上皮細(xì)胞混合斑，一直都是至關(guān)重要的生物物證，而兩者的分離也一直是法醫(yī)檢驗(yàn)中的難點(diǎn)。傳統(tǒng)的“兩步消化”分離法雖然能滿足案件需求，但耗費(fèi)時間較長。采用免疫磁珠定向捕獲精子細(xì)胞的方法[14]，可以定向捕獲混合斑中的精子細(xì)胞，能夠分離開女性上皮細(xì)胞與精子細(xì)胞，并能得到準(zhǔn)確的精子DNA分型結(jié)果，這種方法可快速分離出精子。

免DNA提取(即直接擴(kuò)增法)：一般使用協(xié)同作用的緩沖液，基于FTA卡類型樣本，加入Low TE buffer或純水即可[9]；非FTA卡類型檢材，配用Punch Solution試劑(Promega公司)或Prep-n-GoTMBuffer(AB公司)，而唾液類樣本，加入Swab Solution試劑(Promega公司)需70 ℃孵育樣本30 min，Prep-n-GoTMBuffer則需室溫孵育樣本20 min，因此根據(jù)不同的擴(kuò)增試劑盒應(yīng)采用不同的緩沖液達(dá)到增效作用[15-16]。另外，采用多重置換擴(kuò)增(multiple displacement amplification, MDA)是一種全基因組擴(kuò)增(whole genome amplification, WGA)技術(shù)，其針對樣本全部基因組序列進(jìn)行非選擇性擴(kuò)增的技術(shù)，目的是在無序列傾向性的前提下大幅增加樣本DNA總量。為保證模板高度精確復(fù)制，說明書中要求模板DNA量大于10 ng。實(shí)際上法醫(yī)微量檢材得到的模板DNA量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于10 ng，結(jié)果會造成雜合子基因座擴(kuò)增不平衡、等位基因丟失等問題。因此，該技術(shù)和方法應(yīng)用于單一來源微量生物檢材DNA檢測時，結(jié)果的判讀要慎重，為避免這種現(xiàn)象的出現(xiàn)，建議在同等條件下重復(fù)數(shù)次PCR擴(kuò)增。

2.4 擴(kuò)增系統(tǒng)和程序優(yōu)化

PCR擴(kuò)增反應(yīng)是DNA檢驗(yàn)中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，傳統(tǒng)STR分型技術(shù)因受限于聚合酶及熱循環(huán)技術(shù)參數(shù)，PCR擴(kuò)增過程需要約3 h以上，如果能進(jìn)一步縮短，將有利于提高鑒定效率?？焖貾CR是一種基于普通PCR原理，通過改進(jìn)DNA聚合酶、調(diào)整反應(yīng)添加劑和調(diào)整熱循環(huán)參數(shù)等[17]，實(shí)現(xiàn)較短時間內(nèi)高效擴(kuò)增目的片段的檢測技術(shù)。為實(shí)現(xiàn)快速檢驗(yàn)，一些快速熱循環(huán)儀、微流控芯片技術(shù)已被研發(fā)用于縮短PCR擴(kuò)增時間。以常規(guī)10 μL PCR擴(kuò)增體系進(jìn)行說明：①DNA聚合酶的活性，即擴(kuò)增速率與效率，需要高保真DNA聚合酶，由于酶要混合于Master Mix中，因此還要取決于酶的濃度；②Master Mix，包含Mg2+、dNTP、10×PCR Buffer，以及這些組分的濃度；③熱循環(huán)參數(shù)，一般包括預(yù)變性、變性、退火、延伸、最后延伸，退火溫度在59～61 ℃之間較為合適[18-19]，同時還可以省去延伸環(huán)節(jié)，根據(jù)情況設(shè)置不同的DNA模板量和PCR循環(huán)數(shù)進(jìn)行平行擴(kuò)增，以求獲得成功的STR分型；④熱循環(huán)儀，擴(kuò)增時間的長短主要取決于熱循環(huán)儀的升降溫速率與熱傳遞效率，升降溫速率快、溫控性能好的快速PCR儀，如AB 9700金制模塊擴(kuò)增儀的max升降溫模式；Eppendorf Mastercycler pro S銀制模塊擴(kuò)增儀[19]，其升降溫速率分別為：6 ℃·s-1和4.5 ℃·s-1；AB Veriti擴(kuò)增儀時，升溫模式選擇100%。

2.5 電泳檢測及分型分析

毛細(xì)管電泳檢測的改變主要體現(xiàn)在提高進(jìn)樣電壓延長進(jìn)樣時間以及PCR產(chǎn)物脫鹽處理方面。有研究比較了28個循環(huán)數(shù)的PCR產(chǎn)物脫鹽處理、改善毛細(xì)管電泳檢測電壓和時間、34個循環(huán)數(shù)的PCR擴(kuò)增在痕量法醫(yī)檢材上的應(yīng)用，結(jié)論是28個循環(huán)數(shù)的PCR產(chǎn)物脫鹽處理優(yōu)于其它方法[20]。由于微量生物檢材得到的模板DNA量有限，因此充分利用PCR擴(kuò)增產(chǎn)物顯得尤為重要，PCR產(chǎn)物脫鹽處理主要有凝膠、過濾、純化等[21]。PCR產(chǎn)物純化之前，在恒定的電壓下和一定的進(jìn)樣時間，DNA同時要和內(nèi)標(biāo)及PCR產(chǎn)物的其它組分競爭性進(jìn)入毛細(xì)管，如果DNA被電泳檢測的量少，就會影響到STR分型成功率。脫鹽純化后的PCR產(chǎn)物，純度更高，進(jìn)入毛細(xì)管的擴(kuò)增產(chǎn)物就增多，電泳檢測的STR峰型強(qiáng)度也高，大大地降低了背景干擾，使結(jié)果判讀清晰可見。

在法醫(yī)DNA檢驗(yàn)領(lǐng)域中，最終電泳數(shù)據(jù)的核查分析，一般采用GeneMapper系列軟件(如GeneMapperID-X)進(jìn)行分析，但為了防止引物設(shè)計不同而使分析軟件錯誤分型，先用一種軟件(如GeneMarkerTMHID或IDproof)分析[22]，再用另外一種軟件(如GeneMapperID-X)復(fù)核分析。GeneMarkerTMHID或IDproof Mixture Software是一款功能強(qiáng)大的STR分析工具，包含批量處理數(shù)據(jù)、生成質(zhì)量報告、顯示電泳圖、STR分型分析等基礎(chǔ)功能，還可以進(jìn)行混合斑的個體識別、DNA數(shù)據(jù)的同一性比對等DNA分型結(jié)果的生物統(tǒng)計學(xué)計算和結(jié)果解釋。

當(dāng)前的STR分型技術(shù)從樣本DNA的提取到最后得到分型結(jié)果都需要在實(shí)驗(yàn)室中分步完成，而且還要確保樣本轉(zhuǎn)移過程中不受污染，這都是耗時費(fèi)力的工作。為解決這一問題，需要有快速便攜的DNA分型裝置在現(xiàn)場實(shí)時進(jìn)行樣本的分析處理，將DNA分析的很多步驟微化集成到微芯片上，包括DNA提取、PCR擴(kuò)增和毛細(xì)管電泳分離，這些技術(shù)也已經(jīng)開始應(yīng)用到法醫(yī)中，也就是基于微流控芯片(MOVeTM)技術(shù)的一次性試劑盒，可以避免檢驗(yàn)者干預(yù)、檢材污染和樣品殘留風(fēng)險?？焖貲NA分析是發(fā)展的趨勢，微流控芯片技術(shù)是發(fā)展的重點(diǎn)，兩者的結(jié)合將是法醫(yī)遺傳領(lǐng)域研究的前沿?zé)狳c(diǎn)。目前，微流控芯片技術(shù)在法醫(yī)DNA分析中的應(yīng)用逐漸成熟，雖然現(xiàn)有的方法還有不足之處，但將來基于微流控芯片技術(shù)的DNA分析方法將會以其體積小、速度快、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)在犯罪現(xiàn)場的實(shí)時分析中發(fā)揮重要作用。

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Rapid DNA Fingerprint Technology for Individual Identification

LIU Ya-ju, YUE Jun-tao

(Institute of Criminal Science and Technology,Xuchang Public Security Bureau,Xuchang 461000,China)

ObjectiveTo explore the potential of rapid DNA fingerprint technology for forensic individual identification combined with the practical cases.MethodsThe rapid STR amplification kit and the on-site integrated DNA testing equipment were illustrated respectively. Sampling implement, sample processing, amplification reagents, optimization of distribution ratio, electrophoresis detection and data analysis were listed for the influence of rapid detect method.ResultsThe high quality and concordant STR profile were both attained and the protocols could meet the need of conventional laboratory testing.ConclusionThe rapid DNA fingerprint technology could be used for forensic individual identification, which would have important significance for DNA extraction and identification from the crime scene.

forensic genetics；rapid DNA fingerprint analysis；STR technology；individual identification

1672-688X(2016)04-0294-04

10.15926/j.cnki.issn1672-688x.2016.04.017

2015-10-09

許昌市公安局刑事科學(xué)技術(shù)研究所，河南許昌 461000

劉亞舉(1978-)，男，河南襄城人，副主任法醫(yī)師，從事DNA檢驗(yàn)及法醫(yī)遺傳學(xué)統(tǒng)計工作。

DF795.2

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