徐亮，劉振宇，李中新，理永霞，呂全，張星耀*

1.中國林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所，北京1000912.南京林業(yè)大學(xué)南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇南京2100373.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，山東泰安2710184.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報編輯部，山東泰安721018

松樹響應(yīng)松材線蟲侵染的分子特征

徐亮1，2，劉振宇2，3*，李中新4，理永霞1，2，呂全1，2，張星耀1，2*

1.中國林業(yè)科學(xué)研究院森林生態(tài)環(huán)境與保護(hù)研究所，北京100091
2.南京林業(yè)大學(xué)南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇南京210037
3.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，山東泰安271018
4.山東農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報編輯部，山東泰安721018

松材線蟲病是松屬樹種的重大病害之一，“松樹-松材線蟲”互作的分子機制是病害監(jiān)測與防控的基礎(chǔ)。近年來，隨著新發(fā)展分子研究技術(shù)的介入，學(xué)者們揭示了松樹應(yīng)答松材線蟲侵染的系列分子特征，主要包括氧化脅迫、解毒、病程相關(guān)、次生代謝、轉(zhuǎn)錄調(diào)控等方面。本文對此進(jìn)行綜合評述，以期為“松樹-松材線蟲”互作的分子機制研究提供重要參考。

松材線蟲；侵染；分子特征

松材線蟲病由松材線蟲［Bursaphelenchus xylophilus（Steiner et Buhrer）Nickle］侵染引起的世界性病害，是以病原松材線蟲為主導(dǎo)，寄主松樹、媒介天牛傳播、人為參與等因素綜合的復(fù)雜病害系統(tǒng)［1，2］。1905年在日本首次發(fā)現(xiàn)，目前主要分布在中國、日本、韓國、墨西哥、葡萄牙、加拿大、美國等國家［1-5］，尤其在東亞地區(qū)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)和生態(tài)損失。在日本曾造成每年1，000，000m3松樹死亡［6］，截止2005年已在韓國造成7，811 ha松樹死亡［7］，在中國其引起的經(jīng)濟(jì)損失約合2.5億人民幣［1，2］。

松材線蟲病是我國一種重要的外來入侵有害生物，自1982年傳入以來，其擴散速度和范圍越來越大。至2016年，我國的江蘇、浙江、江西、山東、安徽、福建、河南、湖南、湖北、廣東、廣西、重慶、貴州、四川和陜西15個省的多個區(qū)縣都被列為松材線蟲病疫區(qū)；較2015年，有25個縣區(qū)新發(fā)生松材線蟲?。▏伊謽I(yè)局2016年第6號公告）。擴散蔓延趨勢依然存在，防控形勢嚴(yán)峻，迄需行之有效的防控策略與技術(shù)的形成。

科學(xué)家給予松材線蟲病廣泛的關(guān)注。大量研究揭示了松材線蟲侵染后松樹的結(jié)構(gòu)和生理生化響應(yīng)，近年來，松樹響應(yīng)松材線蟲侵染的分子特征也逐步被闡釋。本文即圍繞松樹響應(yīng)松材線蟲侵染所發(fā)生的分子事件，對國內(nèi)外相關(guān)研究進(jìn)行綜合論述，以期為理解“松樹-松材線蟲”互作機制，及為下一步從分子水平上深入開展“松樹-松材線蟲”互作機制研究提供參考。

1　感染松材線蟲侵染的主要樹種

松材線蟲寄主范圍廣，研究揭示，松材線蟲能夠侵染包括松屬（Pinus spp.）、落葉松屬（Larix spp.）、云杉屬（Picea spp.）、雪松屬（Cedrus spp.）等多屬植物。其中松屬植物是最主要的寄主，包括馬尾松（P.massoniana）、日本黑松（P.thunbergii）、日本赤松（P.densiflora）、濕地松（P.elliottii）、白皮松（P.bungeana）、華南五針?biāo)桑≒.kwuangtungensis）、琉球松（P.luchuensis）、歐洲黑松（P. nigra）、海岸松（P.pinaster）、歐洲赤松（P.sylvestris）和意大利松（P.pinea）等［1-5］。

松樹感染松材線蟲侵染后，其發(fā)病過程分為早期、晚期兩個階段。早期階段，在接種點附近出現(xiàn)典型癥狀，皮層韌皮組織和形成層壞死，皮層樹脂道破壞，樹脂道周圍的皮層薄壁細(xì)胞創(chuàng)傷周邊形成以及乙烯釋放。晚期階段，乙烯大量產(chǎn)生，形成層破壞以及木栓化增加，最終導(dǎo)致針葉枯萎，樹木死亡［8］。伴隨著主要癥狀的發(fā)展，過敏反應(yīng)啟動，導(dǎo)致酚的釋放，毒素和植物抗毒素的合成以及木質(zhì)部和其他組織的分離，最后管胞充滿樹脂油和毒性物質(zhì)［9，10］。隨著這些特征的揭示，其分子機制也逐步被發(fā)現(xiàn)。

2　松樹響應(yīng)松材線蟲侵染分子特征研究的主要方法

松樹響應(yīng)松材線蟲侵染的分子特征研究，早期主要采用單基因克隆與功能鑒定的研究策略與方法，發(fā)現(xiàn)了與松樹抗、感病特征相關(guān)的部分基因及其功能。近年來，隨著研究技術(shù)的發(fā)展，更多的分子手段用于松樹響應(yīng)松材線蟲侵染的研究。

Shin等［11］采用引物退火控制技術(shù)（Annealing Control Primer System，ACP）以及差異消減雜交技術(shù)（Suppression Subtractive Hybridization，SSH）研究了松材線蟲侵染的日本紅松在發(fā)病過程中的相關(guān)基因表現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)一些涉及防衛(wèi)反應(yīng)、次生代謝以及轉(zhuǎn)錄相關(guān)的基因誘導(dǎo)表達(dá)。Santos等［12］采用SSH技術(shù)在松材線蟲侵染的意大利松和海岸松鑒定了表達(dá)序列標(biāo)簽，發(fā)現(xiàn)松樹在分子水平上啟動了防衛(wèi)反應(yīng)，涉及氧脅迫、木質(zhì)素和乙烯合成、核酸的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。Santos等［13］進(jìn)一步采用高通量篩選（High ThroughputScreening）發(fā)現(xiàn)在感病海岸松品種中，蘋果酸脫氫酶、ABA、水分脅迫相關(guān)蛋白以及PAR1等基因高水平表達(dá)，而在不感病意大利松品種中蓖麻蛋白質(zhì)B凝集素、SNARE蛋白以及高遷移率族蛋白等基因高水平表達(dá)。Hirao等［14］構(gòu)建了松材線蟲侵染日本黑松的7個SSH cDNA數(shù)據(jù)庫，發(fā)現(xiàn)抗菌肽和病程相關(guān)蛋白等基因的差異表達(dá)特征。Xu等［15］基于SSH技術(shù)，發(fā)現(xiàn)松材線蟲侵染早期，馬尾松中參與防衛(wèi)反應(yīng)、ROS積累以及防衛(wèi)信號誘導(dǎo)產(chǎn)生、增強植物細(xì)胞壁的基因等基因顯著上調(diào)表達(dá)。此外，Kuroda等［16］基于Megasort的珠分離技術(shù)（MegasortBeads Technology）發(fā)現(xiàn)從抗病黑松品種中篩選獲得的差異表達(dá)的EST數(shù)量是感病品種的3倍，認(rèn)為抗病品種在線蟲侵染時啟動了防衛(wèi)反應(yīng)，而感病品種防衛(wèi)反應(yīng)基因表達(dá)可能受限制。Nose等［17］使用修飾的長基因表達(dá)序列標(biāo)簽技術(shù)（Modified Long SAGETechnique）發(fā)現(xiàn)在抗、感病黑松品種中，病程相關(guān)蛋白基因及次生代謝相關(guān)基因表現(xiàn)出響應(yīng)松材線蟲侵染的典型特征。這些研究方法與技術(shù)對系統(tǒng)揭示松樹響應(yīng)松材線蟲侵染的分子特征給予了良好技術(shù)支撐。

3　松樹響應(yīng)松材線蟲侵染的分子特征

3.1氧化脅迫和解毒相關(guān)的分子特征

在松材線蟲侵染過程中，線蟲分泌的酶及毒素作用，以及寄主自身的次生代謝物，通常局限在特殊細(xì)胞或亞細(xì)胞位置，進(jìn)而導(dǎo)致了植物細(xì)胞遭受高毒性的氧脅迫［18，19］。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)一些上調(diào)表達(dá)的氧脅迫相關(guān)蛋白在維持細(xì)胞內(nèi)的氧化還原平衡以及環(huán)境脅迫/忍受方面發(fā)揮了重要的作用，并且這些氧脅迫相關(guān)蛋白基因的誘導(dǎo)表達(dá)揭示了活性氧（ROS）的積累以及防衛(wèi)信號在線蟲侵染早期的松樹體內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)，進(jìn)而能夠快速誘導(dǎo)防衛(wèi)反應(yīng)基因的表達(dá)［13］。

膜NADPH氧化酶（NOX）系統(tǒng)是H2O2產(chǎn)生的主要來源之一［20，21］。研究發(fā)現(xiàn)松材線蟲侵染松樹早期（24 h）就會導(dǎo)致活性氧和丙二醛積累，膜脂過氧化作用加劇［22］。在松材線蟲侵染24 h的海岸松中發(fā)現(xiàn)醛酮還原酶基因誘導(dǎo)表達(dá)，該酶可催化還原松材線蟲侵染的松樹中由于膜脂過氧化產(chǎn)生的活性碳［13，20，21］；Shin等［11］在線蟲侵染7 d的日本紅松中發(fā)現(xiàn)了氧脅迫誘導(dǎo)的NADP依賴的氧化還原酶上調(diào)表達(dá)?？箟难徇^氧化物酶（APX）參與了還原H2O2生成H2O的過程，是植物參與氧化脅迫響應(yīng)的重要分子［23，24］，APX被證實在線蟲侵染的日本紅松里誘導(dǎo)表達(dá)［11］，何龍喜等［25］發(fā)現(xiàn)松材線蟲侵染松樹早期（24 h），APX活性顯著升高。APX的積累進(jìn)一步提供了松材線蟲侵染早期松樹參與活性氧代謝的功能基因響應(yīng)特征。此外，氧化脅迫相關(guān)的黃素單核苷酸還原酶、硫氧還蛋白家族在先前的研究中被證實與松材線蟲侵染相關(guān)，而一個phox/Bem1（PB1）結(jié)構(gòu)域在線蟲侵染的意大利松也高表達(dá)，并且這個機構(gòu)域通常在信號蛋白包括氧化酶、胞質(zhì)因子中被發(fā)現(xiàn)［13，26］。Shin等［11］在松材線蟲侵染24 h的日本紅松上發(fā)現(xiàn)金屬硫因蛋白和重金屬相關(guān)蛋白等在松材線蟲侵染的松樹體內(nèi)強烈的誘導(dǎo)表達(dá)，尤其在氧脅迫的組織中高表達(dá)，而Hirao等［14］揭示編碼金屬硫因蛋白的EST序列響應(yīng)松材線蟲侵染，在1 d、3 d的敏感黑松體內(nèi)顯著下調(diào)表達(dá)。這些基因它們涉及在金屬的動態(tài)平衡以及重金屬的解毒，具有高的活性氧清除能力。

3.2病程相關(guān)蛋白特征

病程相關(guān)蛋白（PR）是寄主植物響應(yīng)病原侵染誘導(dǎo)表達(dá)的一類防衛(wèi)相關(guān)蛋白，它們通常積累于侵染處，也被誘導(dǎo)系統(tǒng)表達(dá)［27，28］。研究表明PRs參與了松樹和松材線蟲互作，包括PR-2（β-1，3-葡聚糖酶），PR-3（幾丁質(zhì)酶），PR-4（幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白）以及PR-5（類甜蛋白）。Shin等［11］在松材線蟲侵染24 h的日本紅松上，發(fā)現(xiàn)編碼PR-2，PR-3以及PR-4的基因表達(dá)上調(diào)。Hirao等［14］在接種松材線蟲的感病黑松品種上同樣也發(fā)現(xiàn)PR-5基因高表達(dá)；Nose等［17］研究發(fā)現(xiàn)PR-1和PR-3基因的表達(dá)僅在接種松材線蟲的非抗性日本黑松樹種中檢測到，PR-2基因在非抗性黑松中的表達(dá)量高于接種的抗性黑松中的表達(dá)量。Hirao等［14］觀察到在感病日本黑松樹種中，PR-9（過氧化物酶）基因在松材線蟲侵染1 d、3 d高表達(dá)，在抗性黑松樹種7 d、14 d高表達(dá)。PR-10（類核糖核酸酶）基因在松材線蟲侵染21 h的日本紅松上發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)表達(dá)上調(diào)［11］，同樣，Hirao等［14］在線蟲侵染7 d抗性黑松品種中，也發(fā)現(xiàn)PR-10基因明顯上調(diào)表達(dá)。分析認(rèn)為，PR10可能起到了抵抗松材線蟲分泌的纖維素酶、β-1，3-葡聚糖酶以及果膠酸脂裂解酶的作用［29，30］。此外，Santos等［12，13］先后在松材線蟲侵染3 h和24 h的海岸松上發(fā)現(xiàn)PR-14（脂轉(zhuǎn)移酶）基因表達(dá)上調(diào)。PR-14作為抗菌肽，除了通過可能的信號途徑以及參于角質(zhì)屏障的形成來增強植物的防御功能外，自身也能通過改變病原細(xì)菌或真菌細(xì)胞膜的通透性來殺死或限制病原菌的生長［31］。

3.3次生代謝相關(guān)分子特征

次生代謝物是針葉物種防衛(wèi)反應(yīng)的重要物質(zhì)，越來越多的次生代謝相關(guān)基因被發(fā)現(xiàn)在松材線蟲侵染松樹過程中差異表達(dá)［32-36］。陳玉惠等［22］研究發(fā)現(xiàn)馬尾松植株接種松材線蟲早期，苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonialyase，PAL）的活性水平高于對照；Shin等［11］在線蟲侵染24 h的日本紅松上同時檢測到查爾酮合酶（Chalcone and stilbene synthase fam ily Protein，CHS）和苯丙氨酸解氨酶基因（PAL）表達(dá)上調(diào)。苯丙氨酸解氨酶（PAL）位于初生代謝和次生代謝分界處，因此被定位為是苯丙烷類化合物代謝的中心酶，該途徑可形成包括植保素、木質(zhì)素和酚類化合物等在內(nèi)的抗病次生物質(zhì)；查爾酮合酶則是將苯丙烷類代謝途徑引向黃酮類合成的第一個酶。細(xì)胞色素P450涉及在針葉植物樹脂油的一系列二萜樹脂酸形成過程［37，38］，編碼CYP450的基因在線蟲侵染1 d、3 d的抗性樹種被發(fā)現(xiàn)顯著下調(diào)，其下調(diào)表達(dá)可能引起線蟲侵染的松樹內(nèi)二萜樹脂酸的減少［17］。Abrahams等［39］在非抗性松樹樹種發(fā)現(xiàn)線蟲侵染引起的活性氧的增加能夠加強編碼無色花色素加雙氧酶（LDOX）基因的表達(dá)，無色花色素加雙氧酶（LDOX）在產(chǎn)生凝縮類丹寧前體即表兒茶酸的途徑中起作用。Santos等［13］發(fā)現(xiàn)（E）-4-hydroxy-3-methylbut-2-enyldiphosphate（HMB-PP）還原酶以及類硫解酶蛋白的編碼基因在松材線蟲侵染的海岸松中差異表達(dá)，它們參與了松樹萜烯次生代謝途徑。此外，Wei等［40］研究發(fā)現(xiàn)，松材線蟲侵染30 d時，抗性馬尾松ABC轉(zhuǎn)運蛋白基因表達(dá)顯著上調(diào)，揭示了不斷分泌的樹脂限制了松材線蟲的遷移和繁殖。

3.4細(xì)胞壁相關(guān)蛋白特征

細(xì)胞壁相關(guān)蛋白是植物防衛(wèi)病原菌的第一道防線，它們能夠限制線蟲的遷移［41，42，43］。木質(zhì)素不僅可以增強細(xì)胞的機械支持力或抗壓強度，而且與富含羥脯氨酸糖蛋白（HRGP）一起作為結(jié)構(gòu)屏障物保護(hù)細(xì)胞免受病原菌的侵害［14，44，45］。木質(zhì)素被發(fā)現(xiàn)在松材線蟲侵染的松樹中較多形成［45］，Shin等［11］在線蟲侵染1 d的日本紅松中發(fā)現(xiàn)咖啡酰輔酶A-O-甲基轉(zhuǎn)移酶基因上調(diào)表達(dá)，其參與了木質(zhì)素單體的甲基化過程；而Hirao等［14］觀察到在感病日本黑松樹種中，羥脯氨酸糖蛋白（HRGPs）、伸展蛋白基因高表達(dá)，其高表達(dá)特征，在感病樹種中發(fā)生在松材線蟲侵染1 d、3 d，但在抗性樹種中則在7 d、14 d高表達(dá)。Nose等［17］也發(fā)現(xiàn)伸展蛋白家族的編碼基因在松材線蟲侵染的非抗性日本黑松樹種中上調(diào)表達(dá)。Nose等［17］還發(fā)現(xiàn)在線蟲侵染1 d的抗、感病樹種中，木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶（XET）基因表達(dá)下調(diào)。木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶（XET）的作用涉及在纖維素-微纖維素間的葡聚糖交聯(lián)重排引起的細(xì)胞膨脹過程中調(diào)節(jié)細(xì)胞壁松弛，揭示了線蟲侵染過程中，木葡聚糖內(nèi)糖基轉(zhuǎn)移酶（XET）下調(diào)表達(dá)限制了木質(zhì)部、韌皮部的膨脹，或者細(xì)胞壁被羥脯氨酸糖蛋白（HRGPs）和伸展蛋白的交聯(lián)作用所固定。

3.5轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子的特征

轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子是特異基因表達(dá)的關(guān)鍵因子，并且保證了細(xì)胞響應(yīng)胞內(nèi)、胞外的刺激［46，47］。上述松樹響應(yīng)松材線蟲侵染的差異表達(dá)基因，包括涉及松樹防衛(wèi)反應(yīng)、氧化脅迫應(yīng)答、次生代謝物形成等基因，這些基因都具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控特征。研究發(fā)現(xiàn)，部分轉(zhuǎn)錄因子在松材線蟲侵染的松樹中發(fā)現(xiàn)特異表達(dá)。在線蟲侵染1 d的松樹中，檢測到編碼同源域轉(zhuǎn)錄因子、類bZIP蛋白以及推測的包含AP2結(jié)構(gòu)域蛋白的基因特異表達(dá)，而編碼轉(zhuǎn)錄起始因子和推測的螺旋-環(huán)-螺旋轉(zhuǎn)錄因子基因在線蟲侵染7 d的松樹中被檢測到［11］。這些調(diào)節(jié)子在松材線蟲侵染的松樹體內(nèi)的差異表達(dá)，顯示了在松樹響應(yīng)松材線蟲侵染中表現(xiàn)出的轉(zhuǎn)錄調(diào)控特征。當(dāng)然，松樹響應(yīng)松材線蟲侵染的復(fù)雜生理學(xué)和生物化學(xué)反應(yīng)背后，必然有更為復(fù)雜的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制，因此松樹體內(nèi)與松材線蟲侵染相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子以及它們對下游基因的調(diào)節(jié)模式在以后的研究中將被更加重視。

4　結(jié)語和展望

松材線蟲病是世界性森林重大生物災(zāi)害，松材線蟲是重要的外來入侵有害生物，研究者圍繞“松樹-松材線蟲”互作展開了系列研究工作，并取得了長足進(jìn)展，對于了解松樹和松材線蟲互作的分子機制提供了重要信息，對推動松材線蟲病的控制具有重要的基礎(chǔ)性意義。松樹響應(yīng)線蟲侵染的分子特征研究，目前，更多的集中在松樹響應(yīng)松材線蟲侵染的基因鑒定上，獲得了跟松樹抗、感病反應(yīng)相關(guān)的若干基因或者基因的EST。進(jìn)一步，研究者應(yīng)加強這些基因的功能鑒定，深入探討其在松樹響應(yīng)松材線蟲侵染所發(fā)揮的作用。隨著基因組學(xué)、后基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等組學(xué)理論與技術(shù)的不斷發(fā)展，松樹響應(yīng)松材線蟲侵染的分子特征，將會更多地向系統(tǒng)的水平發(fā)展，基因的功能研究不僅僅局限于單個基因的作用，單個路徑中多個基因的功能的互作，以及多個路徑的基因功能的交叉，都是值得發(fā)展的研究方向，也是目前松樹響應(yīng)松材線蟲侵染的重要研究內(nèi)容。同時，在基因功能的深入分析基礎(chǔ)上，開展基因在轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控研究，對于了解松樹響應(yīng)線蟲侵染的復(fù)雜機制具有重要意義。

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Molecular Characterization of Pinus spp. Response to the Infection of Bursaphelenchus xylophilus

XU Liang1，2，LIU Zhen-yu2，3*，LIZhong-xin4，LIYong-xia1，2，LV Quan1，2，ZHANG Xing-yao1，2*
1.Research Institute ofForestEcology，Environmentand Protection/Chinese Academy ofForestry，Beijing 100091，China
2.Co-Innovation Centerfor Sustainable Forestry in Sourthern China，Nanjing 210037，China
3.College ofPlantProtection/Shandong AgriculturalUniversity，Tai'an 271018，China
4.EditorialDepartmentofShandong AgriculturalUniversity，Tai'an 271018，China

Pinus pinew ilt disease is one of the key diseases of pines，which is infected by Bursaphelenchus xylophilus.The discorvery of molecular mechanism of pine-B.xylophilus interaction is the basis of disease management.With the developmentof new molecular techniques，a series ofmolecular characteristics of pine responding to B.xylophilus infection have been revealed，including oxidative stress，detoxification，pathogenesis-related proteins，secondary metabolism，transcription regulation，and so on.We discussed these researches in the paper to provide a reference for pine-B.xylophilus interaction studies.

Bursaphelenchus xylophilus；infection；molecular characterization

S763

A

1000-2324（2016）04-0525-06

2013-09-12

2016-05-20

國家林業(yè)局行業(yè)重點項目資助（項目編號：200904061）

徐亮（1982-），男，山東煙臺蓬萊人，博士，主要從事森林病理研究.Xuliang19824@163.com

Author for correspondence.E-mail：cosmosliuchina@gmail.com；E-Mail：zhangxingyao@126.com