辛茶香，張周云綜述，熊國亮審校(江西省胸科醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西南昌330006)

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分枝桿菌菌種鑒定方法及其進(jìn)展

辛茶香，張周云綜述，熊國亮審校
(江西省胸科醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西南昌330006)

摘要：分枝桿菌及其所致疾病的基礎(chǔ)研究、預(yù)防和治療中，菌種鑒定具有十分重要的意義。隨著分子生物學(xué)診斷技術(shù)的不斷進(jìn)步，分枝桿菌菌種鑒定方法得到了很快的發(fā)展。本文從細(xì)菌學(xué)、生化反應(yīng)、免疫學(xué)、分子生物學(xué)等技術(shù)對分枝桿菌菌種鑒定及進(jìn)展做一綜述。

關(guān)鍵詞：分枝桿菌；菌種鑒定；進(jìn)展

分枝桿菌（Mycobacterium）是人類歷史上最重要的病原微生物群之一。分枝桿菌屬的250多種菌種中，分別包括結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群、非結(jié)核分枝桿菌、麻風(fēng)分枝桿菌（臨床上已少見）。我國現(xiàn)有結(jié)核病患者700萬，據(jù)2010年第五次全國結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查，其中非結(jié)核分枝桿菌（NTM）的感染率為22.9%[1]，對人類致病的NTM有20余種。近年來，NTM病呈快速增多趨勢，并已成為威脅人類健康的重要公共衛(wèi)生問題[2]。分枝桿菌感染引起的肺結(jié)核病和非結(jié)核分枝桿菌（NTM）肺病二者在臨床特點(diǎn)極其相似，臨床上極易將NTM肺病誤診為肺結(jié)核病，不同菌種感染引起的疾病其治療方案是截然不同的，尤其是由不同的NTM引起的NTM病，在化療方案的選擇和用藥時間都各不相同。有研究認(rèn)為62%抗結(jié)核治療效果不佳的肺結(jié)核為NTM感染[3]，也就是說臨床上誤將NTM肺病當(dāng)肺結(jié)核病治療導(dǎo)致治療效果不佳的現(xiàn)象比較常見。因此，2012年我國專家在診斷和治療分枝桿菌病達(dá)成了一個共識，要求在診斷和治療前進(jìn)行分枝桿菌菌種鑒定[4]，明確是結(jié)核分枝復(fù)合群感染還是非結(jié)核分枝桿菌感染、以及是何種非結(jié)核分枝桿菌感染，以便能對不同分枝桿菌感染進(jìn)行對癥治療。所以，在分枝桿菌及其所致疾病的基礎(chǔ)研究、預(yù)防和治療中，菌種鑒定具有十分重要的意義。分枝桿菌菌種鑒定的方法較多，如細(xì)菌學(xué)法、免疫學(xué)法等，近年來，隨著分子生物學(xué)診斷技術(shù)的不斷進(jìn)步，分枝桿菌菌種鑒定方法得到了很快的發(fā)展?，F(xiàn)對分枝桿菌菌種鑒定方法及其進(jìn)展做一綜述。

1　生化反應(yīng)方法鑒定菌種

該方法為傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室方法，包括液體和固體培養(yǎng)基培養(yǎng)，最常用的液體培養(yǎng)技術(shù)為Bactec960方法，該培養(yǎng)技術(shù)僅能鑒定結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群（MTB）和NTM。固體培養(yǎng)基以羅氏培養(yǎng)基為主，如培養(yǎng)出分枝桿菌菌株后，在進(jìn)行抗結(jié)核藥物的藥敏試驗(yàn)時，將菌種接種于含對硝基苯甲酸和噻吩-2-羧酸酰肼鑒別培養(yǎng)基上，并輔以硝酸還原試驗(yàn)、煙酸試驗(yàn)和耐68℃熱觸酶試驗(yàn)，初步鑒定為結(jié)核分枝桿菌、牛分枝桿菌或NTM。然后，再觀察細(xì)菌的最適宜生長溫度、生長速度和光反應(yīng)等，通過觀察一系列生化反應(yīng)來進(jìn)行菌種鑒定[5-7]。傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室鑒定方法簡單，并易于推廣而一直沿用至今，但是耗時較長，操作繁瑣，污染大，缺乏可重復(fù)性，不能及時、準(zhǔn)確為臨床提供參考[8]，臨床難以常規(guī)開展。

2　免疫學(xué)方法鑒定菌種

免疫法只能將分枝桿菌區(qū)分為MTB還是NTM。待測樣本預(yù)處理后接種到液體培養(yǎng)基或固體培養(yǎng)基上，在37℃的條件下，對樣本中的分枝桿菌進(jìn)行分離增菌培養(yǎng)。分枝桿菌在生長過程中，會分泌多達(dá)240多種的分泌蛋白。而其中的MTB64是分枝桿菌分泌蛋白中分泌時間早，分泌量最多的分泌蛋白，也是結(jié)核分枝桿菌群的特異分泌蛋白，而非結(jié)核分枝桿菌則不具有該蛋白。因此，檢測和鑒定該特異分泌蛋白的有無可以被應(yīng)用于鑒定結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌[9]。沈瑤杰[10]等應(yīng)用免疫膠體法鑒定了臨床樣本中培養(yǎng)出的51株分枝桿菌，以16SrRNA測序結(jié)果為金標(biāo)準(zhǔn)，16株膠體法鑒定為非結(jié)核分枝桿菌經(jīng)測序確定的有9株，35株膠體法鑒定為結(jié)核分枝桿菌以測序確定的有34株，其敏感性為56.3%，特異性為97.1%。

3　高效液相色譜法（HPLC）

高效液相色譜法是運(yùn)用高效液相色譜儀直接檢測分枝桿菌細(xì)胞壁枝菌酸和對細(xì)菌染色體的GC%進(jìn)行菌種鑒定，HPLC能有效地鑒定50多種分枝桿菌。該方法具有準(zhǔn)確、可靠、結(jié)果穩(wěn)定等優(yōu)點(diǎn)，適于細(xì)菌分類研究，但限于對標(biāo)本純度的要求及操作的復(fù)雜性，以及HPLC設(shè)備價格昂貴，臨床推廣有一定困難[11]。

4　核酸探針法

由美國Hologic Gen-Probe開發(fā)的Accuprobe系統(tǒng)，主要用于對分枝桿菌分離培養(yǎng)物（固體或液體培養(yǎng)物）中結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群和胞內(nèi)分枝桿菌、鳥分枝桿菌、戈登分枝桿菌、堪薩斯分枝桿菌等非結(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)物的鑒定。該方法的原理為以吖啶酯標(biāo)記的菌種特異性DNA探針與分枝桿菌的16SrRNA進(jìn)行雜交，在培養(yǎng)陽性的標(biāo)本中2h即可獲得結(jié)果，同時操作簡單，結(jié)果準(zhǔn)確性高等優(yōu)點(diǎn)。目前，商品化的AccuProbe cDNA探針及配套的化學(xué)發(fā)光檢測儀已在臨床應(yīng)用，但是，該商業(yè)化探針僅用于少數(shù)NTM菌種的鑒定[12]。

5　PCR或多重PCR法

用各種分枝桿菌特異性引物對標(biāo)本中的菌株DNA進(jìn)行一系列PCR擴(kuò)增或多重PCR擴(kuò)增，根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)生的特異性片段進(jìn)行鑒定；或先用分枝桿菌屬特異的外部引物擴(kuò)增，然后再用菌種特異的內(nèi)部引物進(jìn)行套式擴(kuò)增鑒定。該方法具有靈敏度高和快速等優(yōu)點(diǎn)，但目前僅能鑒定MAC、副結(jié)核分枝桿菌、MTB和麻風(fēng)分枝桿菌等27種分枝桿菌[13]。

6　PCR-限制性片段長度多態(tài)性（PCR-RFLP）技術(shù)

PCR-RFLP是將PCR技術(shù)、RFLP電泳方法聯(lián)合，通過PCR擴(kuò)增一段DNA片段，然后再選擇適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶，對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，最后經(jīng)電泳分析靶DNA片段，可得到有特異性的電泳譜帶，從而達(dá)到鑒定不同基因型的目的。Kim等[14]以hsp65基因和rpoB基因?yàn)榘谢?，分別擴(kuò)增MTB 和NTM的235、136bp的基因片段，對44株分枝桿菌參考株和379株臨床分離株進(jìn)行檢測，并進(jìn)一步對18株NTM選用限制性內(nèi)切酶MspⅠ、HaeⅢ進(jìn)行酶鑒定，以此建立了PCR-RFLP法。萬彥林[15]等以rpoB基因?yàn)榘谢蛟O(shè)計分枝桿菌屬特異性通用引物，用限制性內(nèi)切酶MspⅠ對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切，對酶切結(jié)果進(jìn)行分析，對98株分枝桿菌的鑒定結(jié)果與傳統(tǒng)鑒定法完全一致，其靈敏度、特異度和準(zhǔn)確度均為100%，方法學(xué)評價指標(biāo)結(jié)果達(dá)到診斷性實(shí)驗(yàn)的要求，為早期診斷結(jié)核病與NTM病提供了新的手段。在PCR-RFLP基礎(chǔ)上研制的線性探針反向雜交法（INNO-LiPA）分枝桿菌菌種鑒定方法可鑒定出堪薩斯分枝桿菌、膿腫分枝桿菌和龜分枝桿菌等16種分枝桿菌[16]。

7　PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性（PCR-SSCP）技術(shù)

PCR-SSCP技術(shù)是1989年日本Orita[17]創(chuàng)建的一種在PCR技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的篩查PCR擴(kuò)增產(chǎn)物點(diǎn)突變的新技術(shù)，它的原理是PCR擴(kuò)增后的DNA片段經(jīng)變性成單鏈DNA，單鏈DNA在非變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳時形成不同的立體構(gòu)象，其構(gòu)象直接影響泳運(yùn)速率，相同長度的DNA單鏈其核苷酸順序僅有單個堿基的差別，就可以產(chǎn)生立體構(gòu)象的不同，造成泳動速率的不同，產(chǎn)生不同的電泳帶，從而分離出構(gòu)象有差異的分子。根據(jù)SSCP電泳圖譜與分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株的電泳結(jié)果，進(jìn)行相似性比較。靳曉紅等[18]用PCR-SSCP方法通過設(shè)計2對引物分別擴(kuò)增16S rDNA 2條片段，根據(jù)SSCP電泳圖譜與分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)株的相似性鑒定結(jié)核分枝桿菌、NTM，對98株臨床分離株進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，該方法對MTC及NTB的鑒別比細(xì)菌學(xué)方法快速，僅用3d，且與細(xì)菌學(xué)方法具有良好的一致性。該方法可及時鑒別MTB與NTM，對于臨床復(fù)治、難治結(jié)核病的診斷及藥物選擇有重要作用。不足之處在于電泳條件要求比較嚴(yán)格，當(dāng)某些位置的點(diǎn)突變對單鏈DNA分子立體構(gòu)象的改變不起作用或作用很小時，可能會使聚丙烯酰胺凝膠電泳無法分辨，造成漏檢[8]。

8　DNA測序技術(shù)

DNA測序技術(shù)主要原理是通過比較同源基因/序列的差異來進(jìn)行菌種鑒定，是目前分枝桿菌菌種鑒定技術(shù)中分辨率最高、結(jié)果最為可靠的技術(shù)。目前最常用的分枝桿菌菌種鑒定的序列為16SrRNA編碼基因，可作為其他鑒定技術(shù)的參考標(biāo)準(zhǔn)。Ngan等[19]以16S-23SrRNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）為靶基因，建立多重PCR法結(jié)合產(chǎn)物直接測序技術(shù)檢測了臨床分離的247株分枝桿菌，結(jié)果顯示敏感性和特異性均為100%。王峰等[20]以16S-23SrDNA轉(zhuǎn)錄間隔序列（ITS）PCR-直接測序法檢測了21株分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和50株臨床分離株，結(jié)果21株分枝桿菌標(biāo)準(zhǔn)菌株中有18株鑒定到種，結(jié)核分枝桿菌、非洲分枝桿菌菌株只能鑒定到結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群，但海分枝桿菌無法鑒定到是海分枝桿菌還是潰瘍分枝桿菌；50株臨床分離株，鑒定結(jié)果為胞內(nèi)分枝桿菌10株，膿腫分枝桿菌19株，鳥分枝桿菌5株，鳥分枝桿菌復(fù)合群（MAC）3株，MTB6株，堪薩斯分枝桿菌3株，偶然分枝桿菌2株，蘇爾加分枝桿菌1株，慢黃分枝桿菌1株。該方法可以實(shí)現(xiàn)對分枝桿菌快速準(zhǔn)確的鑒定。

9　基因芯片技術(shù)

基因芯片技術(shù)是借助PCR技術(shù)，同時將大量的探針分子固定到固相支持物上，借助核酸分子雜交配對的特性，對DNA樣品的序列信息進(jìn)行高效的解讀和分析。目前的研究已闡明許多分枝桿菌的16SrRNA和rpoB基因的核苷酸序列是高度保守的，具有種屬特異性，因此可以鑒定分枝桿菌菌種。張立群等[21]利用分枝桿菌16SrRNA基因編碼序列為靶基因，用基因芯片技術(shù)有效的鑒別出17種分枝桿菌，且靈敏度為81.6%、特異度為100%。李洪敏等[22]利用rpoB基因芯片技術(shù)快速進(jìn)行分枝桿菌菌種鑒定。以分枝桿菌rpoB基因編碼序列為靶基因，用芯片技術(shù)檢測126株臨床分離株經(jīng)rpoB基因芯片鑒定為98株結(jié)核分枝桿菌，9株為NTM。分枝桿菌基因芯片鑒定技術(shù)提高了菌種鑒定的敏感性、準(zhǔn)確性，適用于臨床多標(biāo)本檢測的需要，省時，成本相對降低，有較為廣泛的臨床應(yīng)用價值。

10　PCR-反向點(diǎn)雜交技術(shù)

PCR-反向點(diǎn)雜交技術(shù)是近幾年來建立的一種快速鑒定分枝桿菌菌種的新方法，該技術(shù)的原理是以分枝桿菌rpoB基因編碼序列為靶基因，設(shè)計特異的PCR引物且其5’端用生物素進(jìn)行標(biāo)記，擴(kuò)增獲得一定長度的分枝桿菌基因片段，該片段包含了所要檢測的所有分枝桿菌菌種類型。根據(jù)不同分枝桿菌之間的差異，按照堿基互補(bǔ)配對原則，設(shè)計特異性識別某種分枝桿菌序列的寡核酸探針。探針5’端用氨基標(biāo)記，通過化學(xué)鍵作用固定在硝酸纖維膜上，制成包含探針陳列的膜條。將帶有生物素標(biāo)記的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物與膜條上的探針進(jìn)行分子雜交，再通過顯色，觀察膜條特定位置顯色，從而鑒定該分枝桿菌的種類。該技術(shù)最大特點(diǎn)就是，可以對標(biāo)本培養(yǎng)物或直接對患者痰標(biāo)本或支氣管肺泡灌洗液中的分枝桿菌進(jìn)行菌種鑒定，大大縮短了鑒定檢測時間，同時鑒定的菌種涵蓋了對人致病的結(jié)核分枝桿菌群和22種非結(jié)核分枝桿菌，是一種簡便、準(zhǔn)確、快速鑒定分枝桿菌菌種的方法。該技術(shù)有望成為臨床實(shí)驗(yàn)室鑒定分枝桿菌菌種的常規(guī)方法。展望

分子生物學(xué)技術(shù)在分枝桿菌菌種鑒定方面展現(xiàn)了其獨(dú)特的優(yōu)勢及巨大的應(yīng)用前景，為分枝桿菌菌種鑒定提供了一種快速、準(zhǔn)確、有效的方法。同時將分子生物學(xué)技術(shù)和細(xì)菌學(xué)、免疫學(xué)方法相結(jié)合，發(fā)揮各自的優(yōu)勢，是分枝桿菌菌種鑒定的一個方向[23，24]。相信隨著分子診斷技術(shù)的不斷完善和新技術(shù)的不斷涌現(xiàn)，將為臨床快速、準(zhǔn)確鑒定分枝桿菌菌種作出更大貢獻(xiàn)。

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·論著·

(收稿日期2015-11-30；修回日期2015-12-18)

作者簡介：辛茶香，女，1969年8月生，本科，副主任技師，主要從事結(jié)核病的細(xì)菌學(xué)、免疫學(xué)、分子生物學(xué)檢驗(yàn)工作。

DOI：10.3969/j.issn.1674-1129.2016.01.001

中圖分類號：R446.5，R378.91

文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

文章編號：1674-1129(2016)01-0001-03