呂樹作,李雪紅,王潔瓊,張燦軍(洛陽農(nóng)林科學(xué)院,河南 洛陽 471023)

小麥小孢子胚胎發(fā)生機(jī)制及培養(yǎng)技術(shù)研究進(jìn)展

呂樹作,李雪紅,王潔瓊,張燦軍
(洛陽農(nóng)林科學(xué)院,河南 洛陽 471023)

小孢子培養(yǎng)技術(shù)是獲得雙單倍體的最佳途徑,在育種和基礎(chǔ)研究方面均具有很大的應(yīng)用潛力。從小麥小孢子胚胎發(fā)生的形態(tài)學(xué)、生理生化水平及分子水平等方面闡述小麥小孢子胚胎發(fā)生機(jī)制,從供體材料基因型、生理狀態(tài)、取材時期及供試材料預(yù)處理、小孢子的分離純化、誘導(dǎo)培養(yǎng)、再生培養(yǎng)等培養(yǎng)技術(shù)方面綜述了小孢子培養(yǎng)的主要影響因素,并提出了研究中亟待解決的問題。

小麥; 小孢子培養(yǎng); 小孢子胚胎發(fā)生

雙單倍體不僅能應(yīng)用于育種,加速育種進(jìn)程,還可用于遺傳分析、遺傳圖譜的構(gòu)建和分子標(biāo)記等基礎(chǔ)研究,成為多種作物研究的熱點。不同作物獲得雙單倍體的方法不盡相同。目前,小麥獲得雙單倍體的方法有花藥培養(yǎng)[1]、與玉米雜交[2]及游離小孢子培養(yǎng)。與其他培養(yǎng)技術(shù)相比,小麥游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)培養(yǎng)效率高,小孢子分離數(shù)量大,短時間內(nèi)可以獲得大量生理一致的小孢子;其次,可觀察研究單個小孢子,便于進(jìn)行細(xì)胞學(xué)、生理生化及遺傳方面的研究。因此,小麥小孢子培養(yǎng)逐漸成為獲得小麥雙單倍體的首選途徑。概述了小麥小孢子胚胎發(fā)生機(jī)制及其培養(yǎng)技術(shù)中影響游離小孢子培養(yǎng)的主要因素,并提出了待解決的相關(guān)問題,旨在為小麥游離小孢子培養(yǎng)后續(xù)研究提供參考。

1 小麥小孢子胚胎發(fā)生機(jī)制

1.1 小麥小孢子胚胎發(fā)生的形態(tài)學(xué)研究

小孢子胚胎形成過程可劃分為小孢子胚性潛力的獲得、孢子壁包裹的多細(xì)胞結(jié)構(gòu)的形成、胚狀體結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生3個階段。

小孢子胚性的獲得是胚胎發(fā)生的首要條件,是游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)中的關(guān)鍵步驟。在正常情況下,小孢子的配子體發(fā)育途徑是經(jīng)過不均等的有絲分裂形成1個營養(yǎng)細(xì)胞和1個生殖細(xì)胞,生殖細(xì)胞繼續(xù)分裂形成2個精細(xì)胞[3]。在外界誘導(dǎo)因素作用下,游離小孢子形態(tài)和亞細(xì)胞器發(fā)生變化,如細(xì)胞膨大、液泡破裂、細(xì)胞核向中央移動、淀粉粒和核糖體減少、細(xì)胞質(zhì)形態(tài)改變等,使發(fā)育途徑由配子體途徑向孢子體途徑改變[4]。外界誘導(dǎo)因素對小孢子的影響,無論是直接或是間接,都會改變肌動蛋白細(xì)胞骨架和微管的結(jié)構(gòu)。由微管和肌動蛋白絲形成的早前期帶決定細(xì)胞板的形成位置和細(xì)胞能否發(fā)生均等分裂,連續(xù)的早前期帶可使小孢子均等分裂,進(jìn)而發(fā)育成胚[5]。Indrianto等[6]將小麥小孢子經(jīng)33 ℃熱激處理后鏡檢，發(fā)現(xiàn)存在3種形態(tài)的小孢子，Ⅰ-型小孢子形似單核晚期,具有中央大液泡,細(xì)胞核位于萌發(fā)孔對面細(xì)胞壁邊緣的層狀細(xì)胞質(zhì)中;Ⅱ-型小孢子液泡被細(xì)胞質(zhì)鏈分割成幾個小液泡,細(xì)胞核緊貼小孢子壁;Ⅲ-型小孢子細(xì)胞質(zhì)包裹著位于小孢子中央的細(xì)胞核,呈現(xiàn)出星狀結(jié)構(gòu)。3種形態(tài)小孢子中,Ⅲ-型小孢子大多數(shù)能夠發(fā)育成胚。經(jīng)誘導(dǎo)處理一段時間后,部分Ⅰ-型和Ⅱ-型小孢子能夠發(fā)育成Ⅲ-型小孢子,推測這3種形態(tài)并不是判斷小孢子具有胚胎發(fā)生能力的標(biāo)準(zhǔn),而是處于小孢子不同發(fā)育階段。因此,小麥小孢子胚性誘導(dǎo)過程中,小孢子在顯微鏡下呈現(xiàn)星狀(纖維狀)結(jié)構(gòu)被普遍認(rèn)為是小孢子獲得胚性的標(biāo)志[5,7]。

小孢子獲得胚性之后,經(jīng)誘導(dǎo)培養(yǎng)首先分裂成由孢子壁包裹的多細(xì)胞結(jié)構(gòu)。Liu等[8]觀察到小麥多細(xì)胞結(jié)構(gòu)形成是在誘導(dǎo)培養(yǎng)開始12 h至1周內(nèi)完成,1周內(nèi)小孢子體積變化不大。小麥中小孢子細(xì)胞的分裂途徑主要有A、B、C 3種,3種途徑形成的基礎(chǔ)在于第1次有絲分裂是否發(fā)生均等分裂。A途徑是小孢子不均等分裂產(chǎn)生1個營養(yǎng)核和1個生殖核,營養(yǎng)核持續(xù)分裂形成多細(xì)胞結(jié)構(gòu);B途徑是單核期小孢子發(fā)生均等分裂產(chǎn)生2個對稱的、類似的細(xì)胞核,進(jìn)而持續(xù)分裂形成多細(xì)胞結(jié)構(gòu),是小孢子胚胎發(fā)生過程中細(xì)胞分裂的主要途徑;C途徑是營養(yǎng)核或生殖核分裂途徑中發(fā)生核融合,產(chǎn)生具有二倍體染色體數(shù)的愈傷組織或胚胎[6,9-10]。分裂通過A途徑或B途徑,取決于第一次細(xì)胞分裂是否為均等分裂,而C途徑在2種情況下均有可能發(fā)生。小孢子第1次有絲分裂是否發(fā)生均等分裂,與預(yù)處理方式有關(guān),在甘露醇預(yù)處理中通常觀察到均等分裂,而在低溫預(yù)處理中卻常觀察到不均等分裂,且胚胎發(fā)生誘導(dǎo)率不受分裂途徑的影響[9,11]。

獲得胚性的小孢子經(jīng)某一分裂途徑不斷分裂形成由孢子壁包裹的多細(xì)胞結(jié)構(gòu)后繼續(xù)發(fā)育突破花粉壁,繼而形成各種類型的胚。

1.2 小麥小孢子胚胎發(fā)生的生理生化及分子水平研究

小孢子在一定外界條件下由配子體途徑向孢子體途徑轉(zhuǎn)變,在脅迫誘導(dǎo)過程中會發(fā)生一系列生理生化變化,如淀粉合成受阻、熱激蛋白高效表達(dá)、脫落酸大量合成及蛋白質(zhì)合成、磷酸化和糖基化的改變[12]。在該過程中抑制配子體發(fā)育途徑基因表達(dá)、激發(fā)孢子體途徑基因表達(dá)的過程是如何調(diào)控的,胚胎發(fā)生過程中差異表達(dá)基因有哪些,這些問題的探究有助于對胚胎發(fā)生機(jī)制的研究。用于鑒定小孢子胚胎發(fā)生差異表達(dá)基因的途徑有2條：一是利用體內(nèi)胚胎發(fā)生過程中合成的基因產(chǎn)物作為小孢子胚胎發(fā)生的探針;二是對配子發(fā)生和小孢子胚胎發(fā)生進(jìn)行基因表達(dá)比較研究[13]。Reynolds等[14-16]通過構(gòu)建cDNA文庫分離出2個在胚胎發(fā)育初期特異表達(dá)的基因,其中一個基因是小麥金屬硫蛋白(EcMt)基因,并將該基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)作為胚胎發(fā)生的標(biāo)志,進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn),脫落酸(ABA)含量及Ca2+濃度均影響該基因的表達(dá)。Sánchez-Díaz等[17]在小麥胚胎發(fā)生的各個時期均進(jìn)行基因檢測,檢測到細(xì)胞抗脅迫保護(hù)基因谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶基因GSTF2和GSTA2、與信號機(jī)制有關(guān)的TaTPD1-like(tapetum determinant 1-like)和TAA1b基因、阿拉伯半乳糖蛋白基因TaFLA26和TaAGP31-like、新的胚胎特有基因TaEM1等,同時發(fā)現(xiàn)Tad1是小麥小孢子胚胎發(fā)生特有的基因;有趣的是,前人研究報道中在植物體細(xì)胞胚胎發(fā)生、玉米和油菜小孢子胚胎發(fā)生中均有表達(dá)的體細(xì)胞胚受體激酶基因(SERKs)在上述研究的小麥易出胚品種中卻未表達(dá);對易出胚品種與難出胚品種胚胎發(fā)生進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn),難出胚品種小孢子壁破裂前的基因表達(dá)提前。

2 小麥游離小孢子胚胎發(fā)生的主要影響因素

2.1 供試材料

2.1.1 基因型 供試材料的基因型是決定小麥小孢子培養(yǎng)成功與否的重要因素。Liu等[8]用同種培養(yǎng)方式對8個小麥材料進(jìn)行小孢子培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)不同基因型的出胚率、植株再生率、綠苗比率及自然加倍率均有差異,最易出胚基因型可誘導(dǎo)出6 294個胚,而不易出胚基因型只誘導(dǎo)出68個胚,相差92.5倍,不同基因型的綠苗比率從8%至99%不等,差異懸殊。此外,小麥的冬春性對胚胎發(fā)生頻率也有影響,一般認(rèn)為春小麥的出胚率高于冬小麥[18-19]。由于胚胎發(fā)生能力可以穩(wěn)定遺傳[8],除通過培養(yǎng)技術(shù)改良外,可將不易出胚的小麥品種(系)與易成胚的品種(系)雜交克服某些品種(系)不易誘導(dǎo)出胚的缺點,提高小麥小孢子離體培養(yǎng)效率。

2.1.2 生理狀態(tài)和取材時期 供體植株長勢及病蟲害情況等也是小麥小孢子培養(yǎng)成功與否的重要因素。從健壯無病蟲害的小麥植株上取得的小孢子活力強(qiáng)、污染概率低,是小麥小孢子培養(yǎng)供體材料的最佳選擇。適宜的光溫控制、合理的水肥管理及嚴(yán)格的病蟲害防治是培育理想小麥植株的關(guān)鍵。由于供試材料的田間露地栽培狀況由其生長環(huán)境和管理水平共同決定,非人為控制因素過多,因此大多數(shù)研究在溫室或光照培養(yǎng)箱等環(huán)境可控設(shè)施中栽培供體植株[7-8]。

不同作物小孢子培養(yǎng)的最佳取材時期有差異,研究發(fā)現(xiàn),小麥小孢子處于單核中晚期時胚胎發(fā)生概率最高[9]。由于該發(fā)育時期較短,同一穗上小孢子的發(fā)育也不同步,應(yīng)盡量選取大部分小孢子處在單核中晚期的麥穗。不同基因型小麥材料處于該時期的形態(tài)可能會稍有差異,常用的方法是取穗子中部花用醋酸洋紅[8]或DAPI染色法[17]在顯微鏡下鏡檢鑒定。

2.2 培養(yǎng)技術(shù)

2.2.1 供試材料的預(yù)處理 預(yù)處理方式、處理時間、處理液濃度等因素不但與小孢子的分裂途徑、小孢子胚胎發(fā)生概率相關(guān),對植株再生過程中綠苗產(chǎn)生率、染色體自然加倍率等也有影響[20]。目前,已報道的小麥小孢子培養(yǎng)的供試材料預(yù)處理方式有：饑餓處理、4 ℃低溫脅迫、33 ℃高溫脅迫和化學(xué)物質(zhì)處理等,其中可用于小麥小孢子培養(yǎng)的預(yù)處理化學(xué)物質(zhì)較多,如甘露醇、秋水仙素、ABA、6-芐氨基嘌呤(6-BA)、2-萘甲酸(2-HNA)等[5,7,8,21-24]。甘露醇預(yù)處理的機(jī)制主要是其對小孢子內(nèi)源激素水平產(chǎn)生影響,一般其單獨(dú)使用濃度為0.3 mol/L或0.4 mol/L,或配合其他預(yù)處理方式使用;秋水仙素不僅能夠誘導(dǎo)合成脅迫蛋白,使小孢子內(nèi)發(fā)生適應(yīng)逆境的生理生化變化,增強(qiáng)小孢子對逆境的抵抗力,還能增加再生植株自然加倍率[23];6-BA不僅能夠增加活性小孢子數(shù)量還能縮短高溫預(yù)處理時間、減輕高溫傷害[24];2-HNA能夠增加誘導(dǎo)時期活性小孢子數(shù)量[5]?；诟黝A(yù)處理方式作用機(jī)制的差異,預(yù)處理技術(shù)的改良多采用饑餓處理、溫度脅迫處理與化學(xué)物質(zhì)處理結(jié)合的方式。

此外,預(yù)處理對象對星狀結(jié)構(gòu)出現(xiàn)時間、活性小孢子數(shù)量、出胚率等也有影響。王春霞等[25]對小麥花藥和幼穗分別進(jìn)行低溫預(yù)處理,發(fā)現(xiàn)將花藥處理3 d和將幼穗處理7 d時預(yù)處理效果更好,說明處于裸露饑餓狀態(tài)的小麥小孢子比由旗葉或護(hù)穎包裹著的小孢子對環(huán)境更敏感。高增玉等[26]對小麥分蘗、穗子、花藥及小孢子分別進(jìn)行高溫預(yù)處理,發(fā)現(xiàn)直接處理小孢子和花藥比處理穗子和分蘗時星狀結(jié)構(gòu)出現(xiàn)得早、星狀結(jié)構(gòu)比率高,但小孢子越裸露活性小孢子數(shù)量越少,最終的結(jié)果是預(yù)處理穗子出胚數(shù)量最多,效果最好。

預(yù)處理為小孢子提供不利于正常發(fā)育的環(huán)境,脅迫小孢子胚胎發(fā)生,這種不利環(huán)境不但改變小孢子發(fā)育途徑,同時也增加了誘導(dǎo)階段乙烯、活性氧及NO等有害物質(zhì)的含量,導(dǎo)致細(xì)胞死亡。降低預(yù)處理中脅迫處理帶來的損傷,是解決細(xì)胞早期死亡的關(guān)鍵。Mehran等[18]比較有無預(yù)處理脅迫2種方法處理小麥小孢子：(1)利用饑餓脅迫與33 ℃高溫脅迫預(yù)處理小麥花藥4 d后,再進(jìn)行提取、分離純化及A2培養(yǎng)基(含新鮮子房)誘導(dǎo)培養(yǎng);(2)取新鮮麥穗直接提取、分離純化的新鮮小孢子，直接加入A2培養(yǎng)基中暗培養(yǎng)4 d,再加入1.0 mg/L 2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)、0.2 mg/L KT(激動素)和新鮮子房,發(fā)現(xiàn)后者植株再生率和綠苗數(shù)均增加。Sinha等[27]利用二甲基酪氨酸結(jié)合多肽處理小麥和黑小麥小孢子,可以阻止小孢子氧化損傷和死亡,增加小孢子綠色植株再生率。

2.2.2 小麥小孢子的分離和純化 小麥小孢子分離方法主要有6種：自然脫落法、渦流振蕩法、超聲法、磁力攪拌法、研磨法、微型攪拌器攪拌法。Hu等[21]采用渦流振蕩法、超聲法、磁力攪拌法和研磨法4種方法均分離出大量小麥小孢子,渦流振蕩法分離出有活力的小孢子數(shù)最多,分離效果最佳;研磨法獲得的小孢子數(shù)最多,但有活力的小孢子數(shù)量最少,分離效果最差。Gustafson等[28]比較微型攪拌器攪拌法、磁力攪拌法、離析法及自然脫落法對小孢子的分離效果,發(fā)現(xiàn)微型攪拌器攪拌法分離的小孢子存活率最高,可達(dá)75%,與其他分離方法相比,該法還具有操作簡單、分離速度快、分離數(shù)量大等優(yōu)點,被廣泛應(yīng)用于小麥小孢子的分離[7,8,21]。

通常,分離出的小孢子中含有死亡小孢子、無胚胎發(fā)育能力小孢子、細(xì)胞碎片、花藥壁破碎物質(zhì)等雜質(zhì),可能會釋放酚類等有害物質(zhì),改變誘導(dǎo)培養(yǎng)基pH值或滲透壓,從而影響小孢子培養(yǎng)效率。為了達(dá)到最好的培養(yǎng)效果,小孢子的純化步驟必不可少。小麥小孢子純化方法主要有2種,不同孔徑篩網(wǎng)過濾法和密度梯度離心法。不同孔徑篩網(wǎng)過濾法：根據(jù)預(yù)處理后具有胚性的小麥小孢子體積增大至約60 μm[26],可經(jīng)90～100 μm篩網(wǎng)或與38～40 μm篩網(wǎng)雙重過濾的方法將花藥壁破碎物等大的雜質(zhì)及無活力、死亡小孢子或細(xì)胞碎片等小的雜質(zhì)過濾出來[5,21]。該法成本小、簡單易行,但純化效果較差。密度梯度離心法：在過濾的基礎(chǔ)上進(jìn)行密度梯度離心是小麥游離小孢子純化的最常用方式。根據(jù)獲得胚性的小孢子中液泡濃度與其他雜質(zhì)不同的特性,可利用Percoll密度梯度離心[7]將其分離出來。由于Percoll試劑價格昂貴,實際生產(chǎn)中大量應(yīng)用的成本較高,需要一個經(jīng)濟(jì)有效的方法來替代,因此后來多采用21%麥芽糖來替代Percoll[5,24-25]。

2.2.3 小麥小孢子的誘導(dǎo)培養(yǎng)

2.2.3.1 誘導(dǎo)培養(yǎng)基 小孢子獲得胚性后,為其提供最佳誘導(dǎo)環(huán)境至關(guān)重要。首先是基本培養(yǎng)基組成成分的選擇,目前已報道的常用于小麥游離小孢子培養(yǎng)的培養(yǎng)基有A2[7]、MMS3[20]、MMS4[29-30]、CHB-2[31]、NPB99[5],這些培養(yǎng)基大多都是在MS、N6或B5培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上改進(jìn)的[19]。Hamid等[32]將NPB99、C17、W14、CHB-2和P2作為誘導(dǎo)培養(yǎng)基,發(fā)現(xiàn)NPB99、C17和W14的小麥單穗胚胎誘導(dǎo)數(shù)較高,但CHB-2的植株再生率及綠苗比率均最高。

培養(yǎng)基滲透壓對出胚率、植株再生能力及綠苗比率也有影響。Liu等[8]用介于150～500 mOsmol/kg的8個滲透壓處理誘導(dǎo)胚,發(fā)現(xiàn)滲透壓為300 mOsmol/kg時誘導(dǎo)的胚最多;Muhammad等[33]采用介于350～500 mOsmol/kg 的4個滲透壓處理誘導(dǎo)胚,發(fā)現(xiàn)滲透壓為350 mOsmol/kg時小麥的出胚率和綠苗比率最大。上述2個研究結(jié)果存在差異可能與供體基因型、操作方法或誘導(dǎo)環(huán)境不同有關(guān)。

在培養(yǎng)基中添加糖不僅能為小孢子培養(yǎng)提供碳源,對滲透壓的維持也起重要作用。其他作物小孢子培養(yǎng)多采用蔗糖作為培養(yǎng)基的碳源[34],但在小麥小孢子培養(yǎng)中麥芽糖被公認(rèn)為唯一的碳源[35]。李光威等[36]以蔗糖、葡萄糖以及葡萄糖加果糖代替麥芽糖進(jìn)行小孢子誘導(dǎo)培養(yǎng),均沒有胚狀體出現(xiàn)。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因可能是小麥游離小孢子對環(huán)境的敏感性比其他作物高,蔗糖、葡萄糖及果糖對其產(chǎn)生的毒害作用大。

2.2.3.2 外源激素及其他添加物 培養(yǎng)基中外源激素的類型和濃度影響胚的數(shù)量及質(zhì)量。預(yù)處理方式、基本培養(yǎng)基、供試材料基因型及誘導(dǎo)環(huán)境差異,可能導(dǎo)致小麥小孢子對外源激素的需求不同,最佳外源激素類型及濃度尚無統(tǒng)一結(jié)論。處于游離狀態(tài)的小孢子直接接觸培養(yǎng)基時,對培養(yǎng)基較敏感,外源激素濃度要求一般低于花藥培養(yǎng)。除常用的生長素6-BA、2,4-D、KT、苯乙酸(PAA)外,新型外源激素也逐漸在小麥誘導(dǎo)培養(yǎng)基中使用,α-植物磺肽素(PSK-α)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種新型植物肽類生長調(diào)節(jié)物質(zhì),可促進(jìn)細(xì)胞的生長和增殖,在小麥小孢子誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加10-7mol/L PSK-α可以增加胚狀體和綠色再生植株數(shù)量[37]。

在誘導(dǎo)培養(yǎng)基中添加氨基酸、抗氧化劑及抗生素等物質(zhì)也能提高小麥小孢子誘導(dǎo)效率。Muhammad等[38]將多種線粒體和質(zhì)體抗氧化劑分別加入小麥誘導(dǎo)培養(yǎng)基中,發(fā)現(xiàn)添加線粒體抗氧化劑脯氨酸或質(zhì)體抗氧化劑谷胱甘肽均能提高胚狀體數(shù)和綠苗數(shù),添加水楊酸則能降低白化苗的產(chǎn)生。由于供試材料自帶、麥穗表面消毒不徹底或人為操作不當(dāng)?shù)仍蚩赡軙斐膳囵B(yǎng)基污染,除改進(jìn)消毒方式、改善操作技能等方式外,在小麥誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入抗生素也能降低污染率,在誘導(dǎo)培養(yǎng)基加入100 mg/L頭孢噻肟不但可以降低污染率,還可提高出胚率及再生植株數(shù)[39]。

2.2.3.3 子房共培養(yǎng) 在小麥誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入未成熟的小麥子房與小孢子共培養(yǎng),可以顯著提高胚狀體的質(zhì)量,增加胚狀體誘導(dǎo)率和植株再生能力[20,40]。Liu等[8]發(fā)現(xiàn),在小麥誘導(dǎo)培養(yǎng)基中加入研磨的未成熟小麥子房對小孢子胚性誘導(dǎo)無影響,推測并非子房成分而是活的子房釋放的某種“護(hù)理因子”誘導(dǎo)胚狀體產(chǎn)生;同時發(fā)現(xiàn),子房基因型對小孢子胚性誘導(dǎo)的影響不大,甚至可以用燕麥、大麥子房代替小麥子房。在辣椒小孢子誘導(dǎo)培養(yǎng)試驗中也得出同樣的結(jié)論,Lantos等[41]利用小麥或辣椒子房共培養(yǎng)方式誘導(dǎo)辣椒胚狀體,發(fā)現(xiàn)小麥子房共培養(yǎng)能夠產(chǎn)生胚狀體,誘導(dǎo)效果甚至優(yōu)于辣椒子房共培養(yǎng)。用子房預(yù)處理培養(yǎng)基(OVCM)代替子房共培養(yǎng)誘導(dǎo)小孢子,也能誘導(dǎo)出大量的胚[22,42],Zheng等[42]對OVCM和子房共培養(yǎng)2種誘導(dǎo)方式進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn),OVCM誘導(dǎo)的出胚早,胚狀體長勢整齊一致,而子房共培養(yǎng)培養(yǎng)基上誘導(dǎo)的胚狀體較前者多,但是生長不同步,誘導(dǎo)培養(yǎng)28 d后還不斷有新的胚狀體產(chǎn)生。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因是,OVCM在子房預(yù)處理階段積累大量“護(hù)理因子”,子房取出后“護(hù)理因子”不再增加,在小孢子誘導(dǎo)早期就可以快速一致地發(fā)揮作用;而子房共培養(yǎng)培養(yǎng)基是在誘導(dǎo)開始后釋放“護(hù)理因子”的,早期濃度較低,但持續(xù)時間長,貫穿整個誘導(dǎo)時期,產(chǎn)生顯著多于OVCM培養(yǎng)的胚。對該“護(hù)理因子”,目前還沒有定論,可能含有PAA或其類似物及某些氨基酸等營養(yǎng)物質(zhì)[20,36],也可能含有阿拉伯半乳聚糖蛋白(AGP)[29],或是多種物質(zhì)的混合物,需進(jìn)一步研究驗證。

2.2.3.4 小孢子濃度 小孢子的培養(yǎng)濃度必須適宜,小孢子濃度過低,單位體積誘導(dǎo)培養(yǎng)基產(chǎn)生的胚狀體數(shù)少,造成資源和人力的浪費(fèi)。小孢子濃度過高,營養(yǎng)物質(zhì)供給不足,尤其是在純化不徹底的情況下,雜質(zhì)及代謝產(chǎn)物對小孢子的毒害作用加強(qiáng),致使胚狀體數(shù)量和質(zhì)量嚴(yán)重下降。分離純化后的小麥小孢子需要用血球計數(shù)板計數(shù),將小孢子稀釋為0.7×104～2×105個/ mL。

2.2.4 小麥胚的再生培養(yǎng)

2.2.4.1 再生培養(yǎng)基 小麥胚在誘導(dǎo)培養(yǎng)基上長至約2.0 mm時,即可轉(zhuǎn)移到再生培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。胚的質(zhì)量關(guān)系到植株的再生率。王春霞等[25]發(fā)現(xiàn),誘導(dǎo)培養(yǎng)28～29 d、直徑達(dá)2.0 mm的小麥胚均可分化成苗,且綠苗比率較高;培養(yǎng)32～38 d、直徑為2.0 mm的胚再生率雖高,卻幾乎全為白化苗;而培養(yǎng)43～48 d、直徑為2.0 mm的胚基本不能進(jìn)一步分化成苗。常用于小麥胚胎再生的培養(yǎng)基主要有190-2[5,8]、A2R[7,43]、MMS5[44]等。相對于其他培養(yǎng)階段,再生培養(yǎng)操作簡單、成功率較高。Meenakshi等[45]用5種不同再生培養(yǎng)基培養(yǎng)小麥胚,發(fā)現(xiàn)不同培養(yǎng)基胚再生率差異很大,其中在MMS5中加入5 mg/L維生素C培養(yǎng)效果最好,優(yōu)于在MMS5培養(yǎng)基上添加激素和MS、190-2培養(yǎng)基。由此可見,通過系統(tǒng)地改良再生培養(yǎng)基,也可提高綠色植株再生率。

2.2.4.2 白化現(xiàn)象 白化現(xiàn)象在小麥等谷類作物雙單倍體培養(yǎng)中普遍存在,小麥小孢子培養(yǎng)中白化苗的比率高達(dá)50%以上,甚至接近100%[8,18,43]。產(chǎn)生這種現(xiàn)象的原因是預(yù)處理階段質(zhì)體發(fā)生變化,不能夠轉(zhuǎn)化為葉綠體。通過改進(jìn)預(yù)處理方式等,可以減少白化苗的產(chǎn)生。Liu等[46]發(fā)現(xiàn),對于易產(chǎn)生白化苗的小麥基因型,在預(yù)處理培養(yǎng)基中加入10%NPB98可以提高綠苗產(chǎn)生率,而對綠苗率高的基因型也無副作用。預(yù)處理溫度對白化苗的影響也較大,高溫預(yù)處理常常產(chǎn)生高比例的白化苗;而低溫預(yù)處理則可促進(jìn)綠苗產(chǎn)生,但因胚誘導(dǎo)率極大降低,故綠苗總數(shù)下降[36,46],在高溫預(yù)處理時降低高溫?fù)p傷或在低溫預(yù)處理的基礎(chǔ)上結(jié)合其他處理提升胚誘導(dǎo)率,或許是減少白化苗、提升綠色植株再生率的有效方法。

2.2.4.3 再生植株自然加倍率 再生植株的自然加倍率與基因型和培養(yǎng)條件均有密切關(guān)系。小麥不同基因型自然加倍率差異較大,從20%到80%不等[5,8];秋水仙素通過抑制有絲分裂過程中紡錘體的形成阻止姊妹染色單體的分離使染色體數(shù)目加倍,對于自然加倍率較低的小麥基因型,添加秋水仙素可以提高再生植株自然加倍率。在小麥小孢子誘導(dǎo)初期添加秋水仙素可提高再生植株自然加倍率,而在甘露醇預(yù)處理階段添加,加倍率則沒有明顯提升[22,47]。

3 展望

繼1993年,Mejza等[35]和Tuvesson等[48]利用小麥小孢子成功獲得再生植株后,經(jīng)過20多年的研究和技術(shù)改進(jìn),游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)在小麥中已取得長足的進(jìn)步,并逐漸成為小麥獲得雙單倍體的首選途徑,但仍有許多問題有待進(jìn)一步研究和解決。首先,外界條件誘導(dǎo)小孢子胚胎發(fā)生雖已被公認(rèn),但是由于可誘導(dǎo)胚胎發(fā)生的外界條件差別較大,誘導(dǎo)后小孢子生理生化指標(biāo)、基因表達(dá)及細(xì)胞結(jié)構(gòu)的改變也不盡相同,胚胎發(fā)生的途徑也不是單一的,這無疑給胚胎發(fā)生機(jī)制的研究增加了難度;不同外界條件下的誘導(dǎo)機(jī)制存在怎樣的差異,小孢子受怎樣的調(diào)控如何改變配子體向孢子體發(fā)育途徑的,依舊不清楚。其次,供試材料基因型對小孢子培養(yǎng)的影響已是公認(rèn)的,但差異是由哪些基因控制,其細(xì)胞結(jié)構(gòu)、生理生化指標(biāo)及基因表達(dá)是否有差異,培養(yǎng)技術(shù)改良是否要依據(jù)基因型差異而改變等方面需要進(jìn)一步研究。另外,培養(yǎng)技術(shù)改良是提高培養(yǎng)效率的關(guān)鍵,很多在前期報道中難以出胚的品種在技術(shù)改良之后都可以獲得再生植株[5]。由于供試材料基因型、試驗設(shè)計、操作環(huán)境及操作技術(shù)手段等方面的差異造成的培養(yǎng)結(jié)果重復(fù)性差、結(jié)論難統(tǒng)一等問題依舊存在;胚誘導(dǎo)率低、植株再生率低以及白化現(xiàn)象也未能完善解決,仍有許多性狀優(yōu)良的小麥基因型植株再生率低,甚至有些基因型無法再生綠色植株,阻礙其在生產(chǎn)上的應(yīng)用;而且,我國對小麥離體小孢子培養(yǎng)的報道較少,大多停留在培養(yǎng)體系建立及初步應(yīng)用研究上,相關(guān)技術(shù)也僅掌握在部分研究者手中,對我國小麥主要基因型的胚胎發(fā)生能力也不很清楚。隨著技術(shù)的發(fā)展和完善,胚胎發(fā)生機(jī)制將更明確,培養(yǎng)技術(shù)將更加完善,小孢子培養(yǎng)技術(shù)在育種和基礎(chǔ)研究上的巨大潛在優(yōu)勢將被充分挖掘。

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Research Progress on Microspore Embryogenesis Mechanism and Culture Techniques in Wheat

Lü Shuzuo,LI Xuehong,WANG Jieqiong,ZHANG Canjun
(Luoyang Academy of Agriculture and Forestry Sciences,Luoyang 471023,China)

Microspores culture is the best technology to obtain double haploids and has great potential for breeding and fundamental research.The wheat microspore embryogenesis mechanism was expounded at morphological,physiological and biochemical,molecular level.Meanwhile,the main factors of wheat microspore culture were summarized from the aspects of genotype,physical conditions,sampling time of donor plants,and main culture techniques such as pretreatments of donor plants,isolation and purification,induction culture and regeneration culture.Finally,the problems needed to be solved were pointed out.

wheat; microspore culture; microspore embryogenesis

2016-03-26

河南省科技創(chuàng)新人才計劃項目(134200510003)

呂樹作(1978-)，男，河南新安人，助理研究員，博士，主要從事農(nóng)業(yè)生物技術(shù)研究。E-mail：lvshuzuo@163.com

S512.1

A

1004-3268(2016)09-0008-07